Detectie van eiwit palmitoylering in gekweekte hippocampale neuronen door immunoprecipitatie en Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Summary

De omkeerbare toevoeging van palmitaat aan eiwitten is een belangrijke regulator van intracellulaire eiwitten mensenhandel. Dit is van bijzonder belang in neuronen waar veel synaptische eiwitten gepalmitoyleerd. We gebruiken een eenvoudige biochemische methode gepalmitoyleerd eiwitten in gekweekte neuronen, die kunnen worden aangepast voor meerdere celtypes en weefsels.

Abstract

Palmitoylering is een post-translationele modificatie lipide waarbij de bevestiging van een 16-koolstof verzadigd vetzuur, palmitaat, aan cysteïneresidu van substraateiwitten door een labiele thioesterbinding [beoordeeld in ^1]. Palmitoylering van een substraat eiwit verhoogt de hydrofobiciteit, en typisch vergemakkelijkt de handel naar celmembranen. Recente studies hebben aangetoond palmitoylering een van de meest voorkomende lipide wijzigingen in neuronen ^{1, 2,} suggereert dat palmitaat omzet een belangrijk mechanisme waarmee deze cellen regelen de targeting van eiwitten en handel. De identificatie en detectie van gepalmitoyleerde substraten derhalve beter inzicht in protein trafficking in neuronen.

Detectie van eiwit palmitoylering in het verleden is technisch gehinderd door het ontbreken van een consensus sequentie tussen substraateiwitten en de afhankelijkheid van metabole Labellng van palmitoyl-eiwitten met ^{3H-palmitaat,} een tijdrovende biochemische assay met een lage gevoeligheid. Ontwikkeling van de acyl-Biotin Exchange (ABE) assay laat sneller en hoge gevoeligheid van detectie gepalmitoyleerd eiwitten ^2-4, en optimaal is voor het meten van de dynamische omzet palmitaat op neuronale eiwitten. De ABE assay bestaat uit drie biochemische stappen (Figuur 1): 1) onomkeerbare blokkade van ongemodificeerd cysteine ​​thiolgroepen met N-ethylmaliemide (NEM), 2) specifieke splitsing en ontmaskering van thiol de gepalmitoyleerde cysteine ​​groep van hydroxylamine (HAM), en 3) selectief merken van de gepalmitoyleerde cysteine ​​met een thiol-reactief biotinyleringsreagens, biotine-BMCC. Zuivering van de thiol-gebiotinyleerde eiwitten volgens de ABE stappen heeft verschilden, afhankelijk van de algemene doelstelling van het experiment.

We beschrijven een werkwijze om een ​​eiwit van belang gepalmitoyleerd zuiveren primaire hippocampal neuronen door een eerste immunoprecipitatie (IP) stap met een antilichaam gericht tegen het eiwit, gevolgd door de ABE assay en western blotting om rechtstreeks palmitoylering niveaus van dat eiwit die het zogeheten IP-ABE assay. Low-density culturen van embryonale rat hippocampale neuronen zijn op grote schaal gebruikt om de lokalisatie, de functie, en de handel in neuronale eiwitten te bestuderen, waardoor ze bij uitstek geschikt voor het bestuderen van neuronale eiwitten palmitoylatie met behulp van het IP-ABE-test. De IP-ABE assay heeft vooral standaard IP en western blotting reagentia, en wordt alleen beperkt door de beschikbaarheid van antilichamen tegen het doelsubstraat. Deze test kan eenvoudig worden aangepast voor de zuivering en detectie van getransfecteerde gepalmitoyleerd eiwitten in heterologe celkweken primaire neuronale kweken die afkomstig zijn van verschillende hersenweefsels van zowel muis als rat, en zelfs primaire hersenweefsel zelf.

Protocol

1. Extractie van Target Eiwit van gekweekte primaire hippocampale neuronen

1. Voor de oogst endogene eiwit van primaire hippocampale cellen, bereid een Lysis Buffer (LB; tabel 1) met proteaseremmers. Aan 10 ml lysisbuffer, voeg 0,1 ml oplossing phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) tot een eindconcentratie van 10 mM en voeg 1 protease inhibitor cocktail tablet.
2. Voorbereiden N-ethylmaleimide (NEM) oplossing (Tabel 1) van gevriesdroogd poeder. Voorzichtig los op in 100% EtOH bij kamertemperatuur (RT). Altijd bereid NEM oplossing vers voor de dag van het experiment.
3. Vervolgens combineren lysisbuffer en NEM. Voeg 0,5 ml van 2M oplossing NEM een verse 50 ml conische buis. Voeg 20 ml LB top boven, wordt snel LB + NEM (eindconcentratie van 50 mM) op een schommelende platform bij 4 ° C volledig mengen gedurende 5 minuten. Voeg altijd NEM / EtOH oplossing eerst en LB tweede terdege de twee te mengen.
4. Verwijder gekweekte neuronen van incubator en plaats op ijs *. Verwijder cellulaire media en voorzichtig tweemaal wassen met koude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) 1x. Voeg 300 ml LB + 50 mM NEM tot de eerste bron van hippocampale neuronen, en schraap cellen met behulp van een wegwerp cel lifter. Verzamel de cellysaat, vervolgens lozen het lysaat in de volgende bron van die groep. Schraap cellen in de tweede put met behulp van de cel lifter, verzamelen, en herhaal behulp van een derde goed, als nodig is om verder te concentreren het lysaat.
5. Verzamel cellysaat in een voorgekoeld (op ijs), 1,5 ml microcentrifugebuis. Herhaal stap 1.4 met gebruikmaking van 100 pi LB + 50 mM NEM alle resterende cellysaat verzamelen. Pass totale cellysaat door middel van een 26 ½ meter spuit 5-6 keer om te helpen bij de mechanische lysis, zorg dat de niet bellen blazen in de oplossing. Men kan in plaats Sonificeer 15 sec op ijs, wanneer apparatuur beschikbaar. Nutate cellysaat voor ≥ 30 min bij 4 ° C.
6. Verduidelijking van de cel Lysate door centrifugeren bij 16.000 xg / 30 min, om pellet niet-gelyseerde cellen en detergent onoplosbaar materiaal.
7. Verzamel gewist cellysaat (supernatant) in een nieuwe pre-gekoelde 1,5 ml buis op ijs. Herhaal oogst protocol voor alle groepen van cellen. Maatregel eiwitconcentratie in alle lysaatmonsters met BCA assay en normaliseren het volume van alle lysaatmonsters van groepen van cellen precies gelijke totale eiwitten hebben met een aanbevolen minimum van 500 ug. Vul alle monsters met LB + 50 mM NEM tot 500 ul totaal volume.
8. Voeg 1-5 ug primair antilichaam gericht tegen het doeleiwit aan elk lysaat monster. Nutate het antilichaam-lysaat gemengd monsters overnacht bij 4 ° C.

Primaire rat hippocampale neuronen worden gekweekt bij een dichtheid van ca. 250.000 cellen / putje in een 6-wells schaal, in een serumvrij medium met een B27 supplement neuronale, zoals eerder beschreven ⁵ en gekweekt voor het verlangend tijd, meestal 14-16 dagen in vitro (DIV) tot rijpheid bereiken. Een minimum van 500 ug totaal eiwit wordt aanbevolen om succesvol immunologisch en een doelwit eiwit neuronale die gewoonlijk Hiervoor zijn 2-3 putjes van een 6-wells schaal biotinyleren.

2. Precipitatie van antilichaam gebonden doeleiwit

1. Voor neerslaan en immobiliseren van een doeleiwit Bereid een 50% suspensie van proteïne A of proteïne G sepharose beklede kralen. Specifiek voeg ≥ 60 pl sepharose korrels per monster naar 1,5 ml buisjes, zodat alle monsters evenveel kralen hebben. Magnetische kralen zijn ook geschikt als het materiaal beschikbaar is.
2. Voeg een gelijk volume van 50% slurry aan elk antilichaam-lysaat monster en nutate ≥ 1 uur bij 4 ° C.

3. Acyl-Biotine Exchange: hydroxylamine (HAM) Cleavage

1. Hoewel het uitvoeren van stap 2.2, stelt een aantal buizen met lysis buffer (LB) diandere kleur heeft pH's. De pH is zeer belangrijk voor deze stappen en dienen te worden bijgesteld met behulp van een pH meter. Bereid 2 ml LB pH 7,2 per monster, en 0,5 ml van strenge Buffer per monster (Tabel 1). Bereid ook 0,5 ml LB + 10 mM NEM per monster, zoals in de stappen 1,1-1,3. Voeg PMSF en protease inhibitor tabletten alle lysis buffers, zoals in stap 1.1.
2. 1. Hydroxylamine (HAM) is een krachtig reductiemiddel, waarvan splitsing van palmitaat uit cysteines vereist voor biotinylering (figuur 1), en het weglaten van het HAM splitsing dient als negatieve controle. Splitsen elk monster van kralen in twee monsters, een weglaten van het HAM klieving (-HAM) en een onder de HAM stap (+ HAM). Normaliseren van eiwitafbraak door HAM behandeling moet men elk monster gesplitst in drieën met 1/3 van de korrels voor de HAM-control en de overige 2/3 voor de + HAM behandeling.
   2. Bereid extra 1.5 ml buizen op ijs, aangeduid als de HAM-controle voor elk monster. Na stap 2,2 voorzichtig alle monsters 'beads gecentrifugeerd bij 0,5 xg / 1 min bij 4 ° C (centrifuge met deze snelheid, duur en temperatuur voor alle overige stappen tenzij anders vermeld), de buizen op ijs, de bovenstaande vloeistof, en resuspendeer de kralen in 600 ul van LB + 10 mM NEM.
3. Na opnieuw schorsing van de monsters 'parels in lysisbuffer + NEM 10 mM, onmiddellijk verzamelen 200 ul lysaat-kraal het monster slurry, en lozing in dat monster-HAM buis op ijs. Een extra 300 pi LB + 10 mM NEM de HAM-sample en een extra 100 ul het HAM + monster voor een totaal van 500 pi in elk monster. Incubeer de buizen gedurende 10 minuten op ijs.
4. Re-schorten (wassen) de-HAM en + HAM monsters voorzichtig met 0,5 ml strenge buffer, per monster. Snel uitvoeren van deze stap, omdat een langere incubatie SDS zal resulteren in de verwijdering van gebonden antilichaam van hetkralen.
5. Voorzichtig wassen alle monsters driemaal in 0,5 ml / monster van LB pH 7,2, en spin neer tussen wasbeurten als in stap 3.2b.
6. Hoewel het uitvoeren van stap 3.5, stelt een HAM buffer (tabel 1). Voeg het juiste volume van hydroxylamine oplossing naar een nieuwe buis, tot een eindconcentratie van 1 M bereiken in een volume van 0,5 ml LB pH 7,2, per + HAM monster. Altijd de voorbereiding van de HAM buffer vers voor de dag van het experiment. Voeg 0,5 ml / monster van LB pH 7,2 tot all-HAM samples en 0,5 ml / monster aan HAM buffer om alle monsters + HAM.
7. Nutate alle monsters gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT). Neem niet meer dan 1 uur.

4. Acyl-Biotine Exchange: Biotine-BMCC Labeling

1. Hoewel het uitvoeren van stap 3.6, bereiden van 2 ml LB pH 6,2 per monster (Tabel 1), in stap 3.1. Plaats de LB pH 6,2 op ijs tot gebruik. Meteen ook een voorraadoplossing bereid van biotine-BMCC (tabel 1) voor gebruik. Weeg exactgevoerd 2,1 mg biotine-BMCC, verzamelen in een 1,5 ml buis, en zachtjes in 0,5 ml Dimethylsulfoxide (DMSO) op te lossen door het toestel op een schommelstoel platform bij kamertemperatuur, tot 8mm concentratie (gebruik geen pipet te breken van de poeder te bereiken ).
2. Zodra stap 3.6 is voltooid, voorzichtig een keer wassen van de beads in pH 6,2 lysisbuffer, om residueel HAM buffer te verwijderen. Verwijder het supernatant en plaats de monsters op ijs.
3. Biotine-BMCC een maliemide geconjugeerd biotinemolecuul dat een hoge affiniteit voor vrije thiolgroepen van cysteïnes (Figuur 1). Hoewel het uitvoeren van stap 4.2, bereiden 0,5 ml biotine-BMCC Buffer (tabel 1) per monster op werkconcentratie van 0,5 uM tot 5 uM. Concentraties dan 5 uM waarschijnlijk het doeleiwit ⁶ verzadigen, en typisch niet worden overschreden, dit kan echter verschillen afhankelijk van de gewenste doeleiwit. Voeg 0,5 ml van biotine-BMCC buffer aan elk monster en nutate precies 1 uur bij 4 ° C. Neem niet meer dan 1 uur.

5. Elutie van biotine-geconjugeerd doeleiwit en SDS-PAGE

1. Zodra stap 4.3 is voltooid, voorzichtig een keer wassen alle monsters in LB pH 6,2. Houd alle monsters op ijs in tussen de wasbeurten. Verwijder 2x SDS monsterbuffer zonder reducerend middel (Tabel 1) van -20 ° C opslag en langzaam ontdooien op ijs.
2. Voorzichtig wassen monsters drie keer in LB pH 7,5 + PMSF / remmers, en de monsters op ijs in tussen de wasbeurten te houden.
3. Verwijder het supernatant van de derde wassing, waardoor de gepelleteerde beads in een slurry met resterende buffer in de bodem van de buis. Dompel een pipet met een kleine diameter tip (een gel laad tip of P2 pipetpunt voldoende) in de bodem van de buis door de slurry, en snel verzamelen alle resterende buffer, en let niet op te nemen elke kralen.
4. Aanvullen 2x SDS monsterbuffer met DL-Dithiothreitol (DTT) tot een eindconcentratie van 5 mM te bereiken. Toevoegen40-50 pi 2x monsterbuffer + 5 mM DTT aan elk monster. Indien nodig, vortex de korrels volledig wordt gemengd met het monster buffer, gecentrifugeerd en onmiddellijk met hoge snelheid naar alle parels in een pellet, ondergedompeld in monsterbuffer verzamelen.
5. Kook alle monsters gedurende 10 min bij 75-80 ° C. Laat monsters koel aan kamertemperatuur gedurende ≥ 10 minuten op de bank boven, en centrifugeer bij 16.000 xg / 3 min volledig pellet de kralen.
6. Voeg volledige volume geëlueerde eiwit (supernatant) van elk monster aan een baan op een polyacrylamide gel geschikt voor western blotting, met SDS-PAGE ^7. Dient alle monsters zodat het HAM-control eluent en + HAM eluent voor een monster onmiddellijk grenzend aan elkaar lopen tijdens SDS-PAGE (Fig. 2). Na SDS-PAGE, naar een PVDF of nitrocellulose membraan.

6. Western blotting en detectie van palmitoylatie van Target Protein

1. Zodra stap 5.6 is voltooid, was het membraantweemaal in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS 1x) 10 minuten op een schommelende platform bij kamertemperatuur.
2. Bereid een blockingbuffer niet-specifieke labeling blokkeren door weging van Bovine Serum Albumine (BSA), 3% gewicht te bereiken in een volume van TBS 1x + Tween-20 0,05% (TBS-T) die voldoende is om volledig onderdompelen membraan . Voor streptavidine blotting, altijd blokkeren met BSA en niet poedermelk. Blokkeren membraan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een schommelende platform.
3. Bereid een oplossing van antilichaam TBS-T + 0,3% BSA. Voeg Streptavidine-HRP antilichaam opgelost bij 1 mg / ml in gedestilleerd water, verdund 1:5,000-1:10,000. Zodra stap 6.2 is voltooid, het membraan eenmaal wassen in TBS-T gedurende 10 min en vervolgens incuberen van het membraan in Streptavidin antilichaamoplossing op een schommelende platform voor ofwel gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
4. Was het membraan driemaal in TBS-T gedurende 10 min op een schommelende platform. Om het detecteren palmitoylatie, bloot HRP luminescentie met een chemiluminescent substraat kit.
5. Om te normaliseren palmitoylatie de hoeveelheid van het eiwit van belang dat werd immunologisch Strip de membraan met Western blot strippen buffer gedurende 5-10 minuten op een schommelende platform bij kamertemperatuur. Herhaal stap 6,1 tot 6,4 met het primaire antilichaam tegen het eiwit van belang dat oorspronkelijk werd gebruikt voor de immunoprecipitatie.
6. Kwantificeren palmitoylering van het eiwit van interesse met behulp van beeldanalyse software en normaliseren palmitoylering niveaus om de hoeveelheid immunogeprecipiteerd eiwit.

Representative Results

De IP-ABE assay detecteert specifiek thiol-palmitoylering van cysteïneresiduen langs substraateiwitten en worden gebruikt om palmitoylering van immunologisch neuronale eiwitten te detecteren op een wijze afgebeeld in figuur 1. Behandeling van de immunologisch neuronale eiwit met HAM (figuur 1) splitst de thioester koppeling tussen palmitaat en cysteine ​​thiolgroep's, waarbij specifieke opname van biotine-BMCC op de vrijgekomen thiolgroep, die vervolgens kunnen worden gedetecteerd met western blotting. Het weglaten van HAM (minus-HAM) splitsing voorkomt de opname van biotine-BMCC en fungeert als een negatieve controle voor specifieke palmitoyl-biotinilatie van de plus-HAM monster, en moet daarom altijd naast worden uitgevoerd om de plus-HAM monster voor westerse blotting door SDS-PAGE (figuur 2).

In een geoptimaliseerde experiment (Figuur 2A), de palmitoyleringsignaal van de neuronale proteïne δ-catenine ² kan gemakkelijk worden gedetecteerd door blotting voor biotine-BMCC bij een concentratie van 1 uM, met streptavidine geconjugeerd met HRP tegen parallel minus en plus-HAM samples. De specifieke palmitoylatie signaal voor δ-catenine lijkt dan het voorspelde grootte van 160kD, alleen in de plus-HAM monster. De specificiteit van dit signaal bevestigd door reprobing voor δ-catenine met het specifieke antilichaam dat oorspronkelijk werd gebruikt om immunologisch, wat resulteert in een signaal in zowel HAM behandelingen op hetzelfde voorspelde grootte. Optimalisatie van de IP-ABE assay (figuur 2A) zal resulteren in een western blotting profiel van een minus-HAM monster dat gemakkelijk te onderscheiden van de plus-HAM sample, en vertoont weinig tot geen palmitoylering signaal.

De concentratie van biotine-BMCC gebruikt gepalmitoyleerd cysteines etiket vereist een zorgvuldige optimalisatie en als een super-verzadigingsconcentratie van biOtin-BMCC wordt gebruikt tijdens de ABE chemie stappen (Figuur 2B), overmatige achtergrond en niet-specifieke signalen zichtbaar. Een lineaire respons curve voor biotinylering van gepalmitoyleerde neuronale proteïne, de α7 nicotine acetylcholine receptor, gebruik van biotine-BMCC is eerder vastgesteld ⁶ en toont vrijwel volledige verzadiging bij een concentratie van 5-10 uM. Hoewel de optimale concentratie van biotine-BMCC zal wijken enigszins afhankelijk van de neuronale doeleiwit, zal behandeling met biotine-BMCC in een concentratie van meer dan 5 uM waarschijnlijk super-verzadigd het doeleiwit, en resulteren in een western blot profiel met zichtbare achtergrond en niet-specifieke signalen. Een concentratie van 0,5 uM voor biotine-BMCC is eerder gebruikt om palmitoylering andere neuronale eiwitten te detecteren inclusief SNAP-25, huntingtin, AMPA receptor subunits GluA1 en GluA2 en paralemmin ⁸ en bepaling van de optimale concentratie voor een nieuwdoeleiwit kan worden bereikt door trial and error in lineair beginnen binnen het bereik van 0,5-5 pM die hier beschreven. De resulterende streptavidine western blot profielen tussen de minus en plus-HAM monsters δ-catenine palmitoylering elkaar lijken wanneer behandeld met 4 pM biotine-BMCC (Figuur 2B), met extra achtergrondsignalen in verschillende maten, wat aangeeft dat ongepaste biotinylering heeft plaatsgevonden.

Hydroxylamine is een krachtig reducerend middel dat resulteert in beperkte afbraak van het doeleiwit naast de efficiënte splitsing van thioester koppeling. Bijgevolg optimalisatie van ABE chemie vereist een tot normaliseren van de hoeveelheid immunogeprecipiteerd eiwit dat voor min-en plus-HAM monsters (stappen 3.2 - 3.3). Normalisatie vereist het gebruik van dubbele hoeveelheid geïmmobiliseerde doeleiwit in de plus-minus versus de HAM-sample, die daadwerkelijk leidt tot onderscheiden western blotting profielen voor het doeleiwit, zoals getoond voor δ-catenine (Figuur 2A, B). Indien echter de hoeveelheid geïmmobiliseerde doeleiwit niet genormaliseerd tussen minus en plus-HAM monsters, kunnen de resulterende western blot signaal voor het doeleiwit in de plus-HAM monster verloren, zoals getoond voor δ-catenine een gelijke hoeveelheid van eiwit werden gebruikt in zowel HAM behandelingen (figuur 2C).

De specificiteit van ABE chemie voor het labelen van gepalmitoyleerd eiwitten is zeer gevoelig en vereist optimalisatie. De valkuilen die tijdens de IP-ABE test omvatten de sub-optimale resultaten weergegeven in figuren 2B en 2C, en degradatie van het doeleiwit onafhankelijk van HAM behandeling die typisch worden veroorzaakt door oudere reagentia en buffers en onjuiste pH. Om deze valkuilen te vermijden en te corrigeren voor suboptimale ABE chemie, de versheid en concentratie van de reagentia die voor debuffers in tabel 1 altijd te worden onderzocht, en de pH aanpassingen van de buffers altijd te worden gecontroleerd uitvoeren van de proef.

Buffer		Werkconcentratie	Reacties
Lysis Buffer (LB)	In gedestilleerd H2O: 1% IGEPAL CA-630 50 mM Tris-HCl pH 7,5 150 mM NaCl 10% Glycerol	N / A	Bereid voor experiment en bewaar bij 4 ° C
NEM Oplossing	In 100% EtOH: NEM gevriesdroogd poeder	2 M	Bereid, onmiddellijk voor gebruik.
Strenge Buffer	In LB: 10 mM MEM 0,1% SDS	N / A	Bereid kort voor gebruik op ijs bewaren.
LB pH 7,2	In LB: de pH instellen op exact 7,2	N / A	Een pH meter om de pH onmiddellijk voor gebruik.
HAM Buffer	In LB pH 7,2: De oplossing HAM	1 M (laatste HAM concentratie)	Bereid deze oplossing onmiddellijk voor gebruik.
LB pH 6,2	In LB: Breng de pH precies 6,2	N / A	Als voor LB pH 7,2
De biotine-BMCC Solution	In DMSO: 2,1 mg Biotin-oplossing BMCC	8 mM	Bereid deze oplossing onmiddellijk voor gebruik.
Biotine-BMCC Buffer	In LB pH 6,2: Voeg Biotine-BMCC oplossing	1 tot 5 uM (laatste biotine-BMCC concentratie)	Bereid deze oplossing onmiddellijk voor gebruik.
2x SDS monsterbuffer geen reductiemiddelen	In gedestilleerd H2O: 5% SDS 5% Glycerol 125mm Tris-HCl pH 6,8 0,01% Bromophenol Blue	N / A	Bereid voor experiment, en bewaar bij -20 ° C tot gebruik. Aangevuld met 5 mM DTT vóór gebruik.

Tabel 1. Buffers en reagentia die voor de IP-ABE assay. Veel lysis buffers worden bereid voordat het experiment, maar de pH worden gecontroleerd en direct aangepast voor gebruik met een pH meter, het succes van de ABE chemie waarborgen. De meeste stamoplossingen moeten worden vers bereid voor elk experiment, onmiddellijk voor gebruik. Veel van de buffers nodig reagentia voor de meeste uitgeruste laboratoria biochemie en speciale reagentia met leverancier zijn vermeld in de tabel van reagentia en apparatuur.

Figuur 1. Schema van de Immunoprecipitatie en Acyl-Biotin Exchange (IP-ABE) assay te zuiveren en detecteren palmitoylering van neuronale eiwitten. Cultured hippocampale neuronen gelyseerd (1) een doeleiwit wordt dan gezuiverd met een doelwit-specifiek antilichaam, en geïmmobiliseerd op Sepharose korrels bekleed met proteïne G of A. Het gezuiverde doeleiwit is dan (2) behandeld met N-ethylmaliemide (NEM) irreversibel binden en vrije thiol (-SH) groepen te blokkeren langs ongewijzigd cysteïnen (C). Het doeleiwit wordt vervolgens (3) een behandeling met hydroxylamine (HAM), resulterend in specifieke splitsing van bindingen op thioester gepalmitoyleerd cysteïnes en het zichtbaar worden van een vrije thiolgroep gepalmitoyleerde (-SH). Vervolgens wordt de doeleiwit (4) treated met een thiol-reactief biotine molecule, biotine-BMCC, waardoor specifieke biotinylering van de cysteine ​​gepalmitoyleerd. Tenslotte (5) het gebiotinyleerde doelwit eiwit wordt geëlueerd en uit het antilichaam en kralen. Het doeleiwit met gepalmitoyleerd cysteine ​​(s) gelabeld met biotine is nu geschikt voor SDS polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) en Western-blotting met streptavidine te detecteren palmitoylering van het gezuiverde eiwit neuronale. Klik hier om groter bedrag bekijken .

Figuur 2. Detectie van palmitoylatie van de neuronale eiwitten δ-catenine met behulp van de IP-ABE-test. Primaire rat hippocampale neuronen werden gekweekt als pre⁵ hiervoor beschreven bij een dichtheid van 130 cellen / mm ² tot rijpheid 14DIV werden vervolgens gelyseerd en onderworpen aan de IP-ABE assay op palmitoylering van een recent geïdentificeerde gepalmitoyleerd neuronale substraat, δ-catenine ² detecteren. Gezuiverd immunoprecipitaten (IP) van δ-catenine (doeleiwit) werden geïsoleerd met 5 ug δ-catenine antilichaam per sample (BD Transduction Laboratories), en werden onderworpen aan SDS-PAGE in parallel minus en plus-hydroxylamine (HAM) monsters. Palmitoylering werd gedetecteerd door western blotting (WB) met streptavidine-HRP (palmitoylering), en het membraan werd gestript en onderworpen aan een WB reprobe voor δ-catenine. (A) Een geoptimaliseerde vertegenwoordiger IP-ABE resultaat voor gepalmitoyleerd δ-catenine (pijlpunt) behandeld met 1 uM biotine-BMCC, ter illustratie van de specificiteit van ABE chemie voor het detecteren van thiol-gepalmitoyleerd eiwitten van IP monsters. (B) Een sub-optimale vertegenvertegenwoordiger IP-ABE resultaat δ-catenine, waar een sterke concentratie van 4 pM biotine-BMCC werd gebruikt, waardoor niet-specifieke signalen en achtergrond in zowel minus en plus-HAM samples (pijlen). (C) Een suboptimale representatieve IP-ABE WB voor δ-catenine, waar een hoge concentratie van 4 pM biotine-BMCC werd gebruikt, en de hoeveelheid eiwit dat voor het plus-HAM IP monster niet genormaliseerd voor HAM-gemedieerde eiwitafbraak, wat resulteert in een signaal is in de reprobe WB voor δ-catenine. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Discussion

De IP-ABE assay hier gepresenteerde een eenvoudige en zeer gevoelige methode voor het detecteren gepalmitoyleerd eiwitten in gekweekte primaire hippocampale neuronen meeste gebruik van standaard biochemische technieken. Dit maakt de test eenvoudig aan te passen voor laboratoria al uitgerust met western blotting materialen. De IP-ABE assay combineert een standaard protocol immunoprecipitatie te isoleren en te immobiliseren je doeleiwit, gevolgd door eerder beschreven ABE chemie ^2-4 om snel niveaus van palmitaat detecteren op een substraat eiwit. De ABE techniek heeft een breed toepassingsgebied voor de behandeling gepalmitoyleerd eiwitten in verschillende weefsels en cellijnen, inclusief grootschalige palmitoyl-proteomische screening van globale palmitoylatie profielen en snelle detectie van palmitoylering niveaus van een doeleiwit.

Vorige beschrijvingen van ABE chemie hebben gebruikt verschillende methoden cellysis en detergent extractie van neuronale proteins ^{2, 9,} vrije thiol-blokkade ^{10, 11,} biotinylering, en zuivering van het doeleiwit ^4, afhankelijk van de toepassing van het experiment. De toevoeging van palmitaat aan neuronale eiwitten resulteert in hun targeting naar celmembranen, en detectie van de gepalmitoyleerde fractie van een doeleiwit vereist de extractie van deze membranen. ABE eerder beschreven methodieken gebruikt verschillende ionische ⁹ en niet-ionische detergenten ⁸ tot gewenste doeleiwitten extraheren, en het gebruik van een bepaald reinigingsmiddel afhankelijk van de doelgroep eiwit en zijn bekende membraantransport. Hier gebruiken wij de niet-denaturerende en niet-ionische detergens IGEPAL CA-630 gepalmitoyleerd eiwitten die we hebben gevalideerd voor extractie en detectie van de gepalmitoyleerde neuronale proteïne δ-catenine (figuur 2) extraheren. De structuur van IGEPAL CA-630 omvat een volumineus en stijf niet-polaire kopgroep die nietverstoren natieve eiwitconformatie of interacties, maar maakt de associatie met hydrofobe gebieden van membraan-geassocieerde eiwitten, waarbij verleent mengbaarheid en hen toelaten de winning. Vele neuronale eiwitten gelokaliseerd in de synaptische membraan of post-synaptische dichtheid van synapsen worden geëxtraheerd met IGEPAL CA-630, sommige kunnen echter niet volledig oplosbaar en kan het gebruik van een andere niet-denaturerend detergens zoals Triton X-100, die nodig is eerder gebruikt voor ABE chemie ^{2, 8.}

Verschillende beschrijvingen van ABE chemie hebben ook gebruik gemaakt van een andere thiol-reactieve biotinyleringsreagens van het molecuul hier beschreven, genaamd Biotin-HPDP (Thermo Scientific), die ook noodzakelijk een andere wijze van eiwitzuivering ^4. Biotine-HPDP is een thiol-reactief, maliemide-geconjugeerde biotine molecuul dat een disulfidebinding in de linker arm maliemide bevat, structureel differentiating uit Biotin-BMCC, waarin geen dit disulfidebinding. Na thiol-biotinylering van vrije of gepalmitoyleerde een eiwit cysteïne door biotine-HPDP, kan de resulterende disulfidebinding tussen het doeleiwit en biotine groep worden gesplitst doordat reagentia om de biotine groep te verwijderen en het eiwit in zijn originele vorm regenereren, waardoor biotinylering door Biotine-HPDP voorbijgaande aard en reversibel. Daarom is het gebruik van deze biotinyleringsreagens vereist zuivering van een doeleiwit door geïmmobiliseerde avidine reagentia, zoals streptavidine bedekte korrels. Echter, thiol-biotinylering van een doeleiwit door biotine-BMCC, zoals wij hier beschreven, is stabiel en relatief permanent en vereist zuivering van het doeleiwit door een antilichaam gericht tegen het doel en geïmmobiliseerd op Sepharose kralen. Beide ABE technieken zijn eerder gebruikt voor grootschalige schermen en detectie van palmitoylering van enkele eiwitten ^{2, 8-10, 12} en deIP-ABE-assay we hier beschrijven is optimaal voor snelle detectie van palmitoylatie van enkele neuronale doelwit eiwitten.

Een overweldigende meerderheid van de cellulaire palmitoylatie heeft betrekking op de omkeerbare toevoeging van palmitaat aan de thiolgroep van cysteines (genoemd S-palmitoylatie, die we generaliseren als 'palmitoylatie' in dit protocol), zijn echter een zeer beperkte groep eiwitten onderworpen aan onomkeerbare palmitoylatie op glycine en cysteïneresten door de vorming van stabiele amidebindingen, genoemd N-palmitoylering ^13. Een beperking van ABE chemie is het onvermogen om N-palmitoylering detecteren vanwege de stabiliteit van de amidebinding en dus screening van een nieuw doeleiwit voor palmitoylering worden bevestigd met 3H-palmitaat metabolische labeling ^1.

Zoals eerder vermeld kan de IP-ABE assay gemakkelijk worden aangepast voor de behandeling van palmitoylering in eiwitextracten van meerdere bronnen, waaronder transfected heterologe cellijnen, primaire weefsel, en primaire neuronale culturen uit verschillende gebieden van de hersenen. De IP-ABE assay is gebruikt voor de behandeling van palmitoylering voldoende gemuteerde cysteine ​​naar serine eiwitten om de locatie van een gepalmitoyleerd cysteine ​​langs een doeleiwit ^{8 geven,} voor de behandeling dynamische palmitaat omzet synaptische eiwitten in gekweekte neuronen onder basale condities ^10, en veranderingen in palmitoylering niveaus van neuronale eiwitten na inductie van neuronale activiteit ^9. De gevoeligheid en het aanpassingsvermogen van de IP-ABE-test maakt het bij uitstek geschikt is voor de behandeling palmitoylatie profielen van neuronale eiwitten, en optimaal is voor het opsporen van dynamische veranderingen in palmitoylatie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
IGEPAL CA-630	Sigma	I8896
PMSF	Fluka	93482
Protease Inhibitor Cocktail	Roche Complete Mini	11 836 153 001
NEM	Sigma	E3876
HAM solution	Sigma	46780-4
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	Ensure compatibility with chosen detergent
Protein G/A-coated sepharose beads	GE Healthcare	17-6002-35
Biotin-BMCC	Thermo Scientific	21900
Streptavidin-HRP	Thermo Scientific	21126	Reconstitute at 1 mg/ml in water
Western Blot Stripping Buffer	Thermo Scientific	21059