Summary
Nous décrivons ici un protocole pour la détection simultanée des modifications des histones par des séquences d'ADN immunofluorescence et par FISH ADN suivies par microscopie 3D (3D et des analyses immuno-FISH ADN).
Abstract
Hybridation fluorescente in situ utilisant des sondes ADN sur le 3-dimensions noyaux conservés suivie par microscopie confocale 3D (FISH ADN 3D) représente le moyen le plus direct pour visualiser l'emplacement des loci de gènes, chromosomes sous-régions ou des territoires entiers dans des cellules individuelles. Ce type d'analyse permet de mieux comprendre l'architecture globale du noyau ainsi que le comportement des loci génomiques spécifiques et des régions dans l'espace nucléaire. Immunofluorescence, d'autre part, permet la détection des protéines nucléaires (histones modifiées, variants d'histones et des modificateurs, des machines et des facteurs de transcription nucléaires, sous-compartiments, etc.) Le problème majeur en combinant FISH ADN immunofluorescence et 3D est, d'une part, de préserver l'épitope détecté par l'anticorps, ainsi que l'architecture 3D du noyau, et d'autre part, pour permettre la pénétration de la sonde d'ADN pour détecter loci chromosomiques ou territoires 1-5. Ici, nous fournissons un protocole qui combine la visualisation des modifications de la chromatine avec loci génomiques conservées dans les noyaux 3D.
Introduction
Épigénétique mise en place de mécanismes de déclenchement et l'héritage de développement et d'un type de cellule spécifique profils transcriptionnels. À un certain niveau, cela implique la modulation de empaquetage de la chromatine qui définit des régions génomiques actifs ou silencieux. À plus grande échelle, l'organisation mondiale de la 3D et de l'architecture du génome nucléaire jouent également un rôle dans le contrôle des motifs de la transcription. Ainsi, la dissection de ces caractéristiques épigénomiques est essentielle pour une compréhension complète de la façon dont les gènes sont régulés 6-11.
Combiné FISH ADN immunofluorescence et 3D offrent une occasion unique de compléter les analyses moléculaires et biochimiques en évaluant les interactions spécifiques / associations de séquences d'ADN et / ou de protéines dans le noyau. En outre, alors que l'ensemble du génome techniques à haut débit tels que immunoprécipitation de la chromatine (ChIP-seq) ou la conformation de capture chromosome couplé avec le séquençage profond (4C-seq, 5C, Salut-C) fournir dat mondialeun sur 12 populations de cellules, les techniques d'immunofluorescence POISSON / ADN permettre des analyses au niveau de la cellule unique.
Nous décrivons ici un protocole pour la détection simultanée des modifications des histones par des séquences d'ADN immunofluorescence et par FISH ADN suivies par microscopie 3D et des analyses (3D immuno-FISH). L'avantage de ce protocole est la visualisation combinée de l'ADN et la préservation de la structure des protéines. Notre expérience dans ce domaine nous a permis d'améliorer et de simplifier les protocoles existants. Bien que nous ayons utilisé ce protocole pour détecter l'ADN des cassures double brin dans les lymphocytes subissent une recombinaison, cette méthode peut être appliquée à d'autres protéines et d'autres types de cellules.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Étiquetage sonde d'ADN avec des fluorophores: Nick Translation (~ 6 h)
- Propre ADN de BAC (préparé par maxi-prep) ou des plasmides ou des produits de PCR, tous remis en suspension dans H 2 O, peut être utilisé pour le marquage. Notez que pour un signal FISH robuste, sondes doivent couvrir au moins 10 kb.
- Incuber ADN dans RNase A pendant 30 min à 37 ° C (Tous les réactifs sont énumérées dans le tableau 1).
- Incuber la réaction translation de coupure pendant 2 heures à 16 ° C (voir les tableaux 2 et 3). D'autres méthodes de marquage direct peut être utilisé (Exemple: Tag FISH, Invitrogen).
- Inactiver la réaction pendant une heure à -80 ° C ou une nuit à -20 ° C.
- Déterminer la taille de la sonde sur un gel d'agarose à 2%. Le frottis doit être comprise entre 100 et 1000 pb, avec la majorité, à environ 300-500 pb (Notez que le frottis de Cy5-sondes n'est pas visible). Si l'ADN est digéré pas assez, plus l'ADN Pol I etDNase I peut être ajouté au mélange réactionnel et on incube pendant deux heures plus à 16 ° C.
- Purifier sondes sur 0,025 mm de filtres deux béchers litres remplis de H 2 0 pendant deux heures dans l'obscurité.
- Ajouter facteurs de blocage des sondes comme suit: 10 pg d'ADN Cot-1, 10 pg d'ADN Hybloc et 100 pg de sperme de saumon pour 10 pg de sondes d'ADN. Des sondes d'ADN conserver à -20 ° C.
2. Sonde de précipitation / dénaturation / pré-recuit (h 3-4)
- Entre 0,3 pg et 1 pg de sonde d'ADN est utilisé par lamelle. Sondes mélanger avec 0,1 volume de 3M NaAc (pH 5,2) et 2,5 volumes d'éthanol à 100%, incuber pendant une heure à -80 ° C ou une nuit à -20 ° C et centrifuger à 13000 rpm à 4 ° C pendant 30 min. A noter que la quantité de sonde d'ADN peut être ajustée en fonction de la qualité de l'ADN et la région nucléaire de l'hybridation. D'autres méthodes de marquage direct peut permettre l'utilisation de quantités réduites desonde. Pour la détection de multiples signaux FISH ADN sur une diapositive, les différentes sondes peuvent être précipités ensemble (à l'exception des sondes qui ne doit pas être pré-recuit, comme des séquences répétées). Sondes pour plusieurs expériences réalisées dans le même temps peut également être précipité en même temps. Pellets doivent être légèrement colorés selon les fluorophores utilisés (si de petites quantités de sondes sont précipités, le culot peut ne pas être visible).
- Granulés secs et les remettre en suspension dans 15 ul de tampon d'hybridation (voir tableau 4) par lamelle avec agitation (à l'aide d'un thermomixer Eppendorf) dans l'obscurité à 37-45 ° C (pendant environ 20 mn).
- Sondes dénaturer pendant 5 min à 75-95 ° C.
- Pré-recuit sondes à 37 ° C pendant 30-60 min. Longueur de pré-recuit peut être ajustée en fonction de la complexité et de la qualité des sondes.
- Appliquer des sondes pour les lamelles d'hybridation pendant la nuit (voir la section 3).
3. 3Dimensions FISH ADN - Premier Jour (~ 3 h)
- Les cellules non adhérentes sont concentrés dans un petit volume de PBS 1x (~ 2x10 5 cellules à 5-10 pl de PBS 1x par lamelle) et tombe sur le centre d'une lamelle couvre-poly-L-lysine enrobée. Les cellules adhérentes doivent être cultivées sur des lamelles pendant au moins 24 heures (~ 70% de confluence) (lamelles peuvent être revêtus de gélatine à 0,1%). Lamelles carrées 18x18 mm à 24-24 sont placées dans des plaques 6 puits, et tout au long du protocole, deux ml de chaque solution est utilisée par puits (alternativement rondes 1,5 mm lamelles peuvent être placés dans des plaques 12/24-well).
- Fixer les cellules dans du paraformaldéhyde à 2% / PBS 1x, pH 7 à 7,4, pendant 10 min à température ambiante (4% des stocks PFA peut être aliquotés, stocké à -20 ° C). Paraformaldéhyde peuvent être achetés en solution (16%), ou des solutions mères 4% peut être préparé à partir de poudre / granulés. Paraformaldéhyde en poudre est dissoute dans du PBS 1x à> 60 ° C (pH peut être augmenté à 8-9 pour faciliter la dissolution), refroidie sur la glace, réglezà pH 7 à 7,4 ed, filtré, aliquoté dans des faucons et stockées pendant des semaines à -20 ° C.
- Après trois rinçages dans PBS 1x, perméabiliser les cellules de glace-froid 0,4% de Triton-X-100/1 x PBS pendant 5 min sur la glace. Longueur de perméabilisation peut être ajustée en fonction de la cellule de type NB:. Si FISH ADN est combiné avec l'immunofluorescence, l'immunomarquage doit être effectuée à ce stade (voir la section 4).
- Après trois rinçages dans PBS 1x, incuber les cellules avec 0,1 ug / ul RNase A en 1x PBS pendant une heure à 37 ° C. Lamelles sont placées côté cellule vers le bas sur une baisse de 100 pi de solution sur du parafilm ou une diapositive dans une chambre humide. Lamelles sont ensuite soigneusement retiré avec une pince. Si une résistance est rencontrée, lamelles doivent être inondé de 1x PBS afin d'éviter d'endommager les cellules.
- Après trois rinçages dans PBS 1x, perméabiliser les cellules de glace-froid 0,7% de Triton-X-100 HCl / 0,1 M pendant 10 min sur la glace.
- Après trois rinçages in 1x PBS, les cellules dénaturer dans HCl 1,9 M pendant 30 min à température ambiante. Alternativement, les cellules peuvent être dénaturées dans 50% de formamide / 2x SSC à 75-80 ° C pendant au moins 30 min. Noter que la longueur d'hybridation (et de la température) peut être optimisée en fonction de la cellule-type.
- Après trois rinçages dans de la glace-froid 1x PBS, les cellules s'hybrider avec des sondes nuit à 37 ° C dans une chambre sombre et humide. Lamelles sont placées côté cellule vers le bas sur une baisse de 15 pl de sonde sur une diapositive, et scellé avec du ciment de caoutchouc.
4. 3-dimensionnelle d'immuno-FISH - Premier jour (~ 6-7 h)
- Pour combiner immunofluorescence / DNA FISH, l'immuno-marquage doit être effectué après la perméabilisation de 0,4% de Triton-X-100 (étape 3.3).
- Incuber les cellules dans une solution de blocage pendant 30 min à température ambiante (2,5% de sérumalbumine bovine (BSA), sérum de chèvre normal à 10%, 0,1% Tween-20). La solution de blocage est filtré, aliquoté dans eppendorfs de 1,5 ml et stocké pour mois à -20 ° C.
- Incuber les cellules avec l'anticorps primaire dirigé contre la protéine ou la modification d'histone d'intérêt dilué dans une solution de blocage, pendant une heure à température ambiante en chambre humide. Ici, nous montrons l'exemple d'un anticorps contre phosphorylés sérine-139 de H2AX (γ-H2AX, Millipore, voir le tableau 5 pour plus de détails). Lamelles sont placées côté cellule vers le bas sur une baisse de 100 pi de solution sur du parafilm ou une diapositive dans une chambre humide. Lamelles sont ensuite soigneusement retiré avec une pince (inondé de PBS 1x, si nécessaire). Notez que la dilution et la durée d'incubation peut être ajustée en fonction de la qualité de l'anticorps et de cellules-types.
- Laver les cellules dans 0,2% de BSA / 0,1% Tween-20 / PBS 1x, trois fois 5 min à température ambiante sous agitation.
- Incuber les cellules avec le cas échéant un fluorophore conjugué anticorps secondaire dilué dans une solution de blocage pendant une heure à température ambiante dans une chambre sombre et humide. Ici, nous montrons un exemple de détection d'unsecondaire de chèvre anti-anticorps de souris (Alexa Fluor 488 ou 555, Invitrogen; Voir le tableau 5 pour plus de détails). Haptène-anticorps secondaires conjugués (biotine, la digoxigénine, etc) peuvent également être utilisés. Dans ce cas, une étape supplémentaire pour la détection approprié (streptavidine, anti-dig, etc) peut être effectuée avant ou après pendant la nuit ADN-FISH hybridation.
- Rincer les cellules dans 0,1% de Tween-20 / PBS 1x, trois fois 5 min à température ambiante sous agitation dans l'obscurité.
- Post-fix cellules dans du paraformaldéhyde à 2% / PBS 1x pendant 10 min à température ambiante dans l'obscurité.
- Continuer FISH ADN comme ci-dessus à partir d'incubation de la RNase A (étape 3.4).
5. 3-dimensions ADN FISH / Immuno-FISH - Deuxième jour (~ 2 h)
- Retirez délicatement la colle de caoutchouc, des lamelles crues avec 2x SSC, retirer délicatement avec une pince et placez-les dans des puits contenant la solution de lavage.
- Laver les cellules dans du SSC 2X pendant 30 min à 37 ° C dans l'obscurité sous agitation.
- Laver les cellules dans du SSC 2X pendant 30 min à température ambiante dans l'obscurité sous agitation.
- Laver les cellules en 1x SSC pendant 30 min à température ambiante dans l'obscurité sous agitation à noter que dans le cas de la dénaturation de formamide, lavages doit être remplacé par le texte suivant:. Lavage 3 en lavages formamide / 2x SSC et 3 50% en 2x SSC, 5 min chacun, à 37 ° C.
- Monter les cellules dans ProLong moyen de montage d'or contenant 1,5 mg / ml DAPI (4,6-diamidino-2-phénylindole) pour la contre de l'ADN total. Lamelles sont placées côté cellule vers le bas sur une baisse de 10-15 ul de milieu de montage sur une lame et scellé avec du vernis à ongles. Les lames sont conservées pendant plusieurs mois à -20 ° C.
6. Microscopie 3D et d'analyse
- Images en 3D peuvent être acquises avec des systèmes différents microscope. Dans nos expériences, des sections optiques séparées par 0,3 um sont recueillies sur un système Leica SP5 AOBS confocale (acousto-optique Beam Splitter). Notez que la séparation entre opticaavions l peut être réglée en fonction du type d'analyse.
- Piles d'images 3D peuvent être analysées à l'aide du logiciel et des outils différents. Nous utilisons le logiciel Image J pour évaluer les mesures de distance entre les loci d'intérêt et d'analyser les différents types d'associations des loci d'intérêt avec des sous-compartiments nucléaires ou des protéines.
- Toutes les analyses statistiques sont effectuées pour comparer les deux (ou plus) différentes conditions biologiques de paires évaluation (s) d'importance: comparaison entre les différents types de cellules ou de stades, la comparaison entre les différents loci d'intérêt. Dans tous les tests statistiques, les valeurs P ≤ 5,00 E-2 (a = 0,05) sont considérées comme significatives (1,00 E-2 ≤ P ≤ 5,00 E-2 * significatif; 1.00E-3 ≤ P ≤ 1,00 E-2 * * très significative, p <1,00 E-3 *** très important).
L'analyse statistique des distributions entières de distances entre deux allèles. Nous avons d'abord construct cumulatifs courbes de fréquence de distribution sur toute la plage de distances mesurées entre les deux alleles.To évaluer l'importance des différences entre les distributions empiriques des inter-distances alléliques nous utilisons le test non paramétrique de deux échantillons de Kolmogorov-Smirnov (KS) 13,14 essai.
L'analyse statistique de près association (association par exemple) à l'aide de deux allèles à une distance optimale de coupure. Afin d'identifier la gamme de la plupart des différences dans les distances robustes entre deux allèles ou loci, nous utilisons une série de deux-tail test exact de Fisher 15 s. Plus précisément, à chaque distance mesurée nous tester si une condition est nettement surreprésentés à des distances plus courtes entre les deux échantillons. Le minimum de la distribution des valeurs de p indique la plage de distances qui doivent être considérées comme une coupure de près association (c.-à-appariement) des deux allèles. Par la suite le test de Fisher bilatéral exact est utilisé to évaluer l'importance de l'appariement de deux allèles identifiés à la valeur seuil 15. Corrections de tests multiples sont appliqués pour tenir compte du nombre total de tests de Fisher effectué 16.
L'analyse statistique de l'association du locus d'intérêt avec des sous-compartiments nucléaires ou des protéines. Le test bilatéral exact de Fisher-est utilisée pour analyser l'importance de l'association du locus d'intérêt avec différents compartiments ou des protéines 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ADN et immuno-FISH sont utilisés dans le laboratoire Skok pour étudier les changements dans l'organisation nucléaire associés au processus de V (D) J du locus récepteurs des antigènes au cours du développement des lymphocytes B et T. Les techniques décrites ci-dessus nous permettent de mesurer des distances i) entre les deux extrémités d'un locus (contraction) ii) mesurer les distances entre les allèles ou loci (appariement), iii) analyser l'endommagement de l'ADN survenant dans les lieux, iv) déterminer l'emplacement des allèles et par rapport aux loci nucléaires sous-compartiments (hétérochromatine répressive péricentromérique dans notre étude), et v) évaluer l'association des protéines nucléaires sur allèles et des loci (association de l'histone phosphorylée γ-H2AX dans notre étude). En particulier, nous avons analysé le rôle de la dynamique locus dans la régulation de la recombinaison V (D) J des loci d'immunoglobulines dans le développement des cellules B 17-30, et dans la régulation de l'engagement de filiation entre CD4 + et CD8 + T14 cellules. On a également évalué à une lésion de l'ADN du locus récepteur des cellules T, Tcra / j, dans le développement de cellules T portant une forme mutante de la protéine recombinase RAG2 31.
Figure 1. L'analyse des distances entre deux allèles ou loci. (A) sections confocales montrant représentatifs non appariés (à droite) ou par paires (gauche) allèles différents noyaux. La sonde FISH ADN a été généré à partir d'un taux d'alcoolémie (~ 200 ko) couvrant le locus d'intérêt. Les distances entre les allèles ont été mesurés entre le centre de masse de chaque signal de BAC dans des piles d'images 3D. Cercles en pointillés décrivent des formes noyau. Barres d'échelle = 1 um. (B) les courbes de distribution de fréquences cumulées montrant toute la gamme des distances entre l'allèle deuxs mesurée dans deux différentes conditions biologiques (de type sauvage vs mutant). Le test non paramétrique de deux échantillons de test KS a été utilisé pour évaluer l'importance des différences entre les deux distributions. La gamme de la plupart des différences robustes en inter-distances alléliques a été évaluée à l'aide d'une série de tests de Fisher à deux queues exactes (points bleus). Les plus robustes P-valeurs (plus de points) ont été trouvées pour les distances à environ 1 um. Ainsi, la coupure de près association (c.-à-appariement) des deux allèles a été mis en place à 1 pm. (C) des courbes de fréquences cumulées indiquant les distances entre les deux allèles de 0 à 1,5 um dans les deux différentes conditions biologiques. L'importance de l'appariement des deux allèles a été évaluée en utilisant le test de Fisher bilatéral exact pour une coupure à 1 pm. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. L'analyse de l'emplacement d'un lieu par rapport à la sous-compartiments nucléaires. Dans nos études, nous analysons la relation entre nos lieux d'intérêt et de la répression sous-compartiment nucléaire formé par le péricentromérique hétérochromatine (PCH) 32. Allèles sont considérés comme situés à PCH lorsque le signal de taux d'alcoolémie pour le locus d'intérêt est adjacente à ou chevauchant le signal γ-satellite qui s'hybride à PCH (pas de pixel entre les bords de la CAB et γ-satellites signaux FISH ADN). Sections confocales représentant de l'emplacement des allèles TCRA par rapport à PCH: (Haut) pas d'allèle situé à PCH, (Moyen) un allèle à PCH, (en bas) deux allèles à PCH. Locus en rouge, et γ-satellite en blanc. Les flèches jaunes indiquent les allèles situés à PCH. Cercles en pointillés décrivent des formes noyau. Barre d'échelle = 1 um.
Figure 3. Analyse de l'association des protéines nucléaires et de modifications des histones sur un locus. (A) Dans nos études, nous analysons la relation entre nos lieux d'intérêt et la forme phosphorylée de l'histone H2AX (γ-H2AX), comme lecture de l'ADN double brin pauses 33. Sections confocales montrent des exemples d'aucune association γ-H2AX (Haut) ou d'une association sur un allèle Tcra (en bas) dans les noyaux individuels. Allèles ont été définis comme étant associé à γ-H2AX si le taux d'alcoolémie des signaux et l'immunofluorescence foyers étaient au moins partiellement recouvert (au moins un pixel de colocalisation). Locus est affiché en rouge et γ-H2AX en blanc. Cercles tiretés plan nformes ucleus. Barre d'échelle = 1 um. Il est à noter que les analyses de colocalisation du signal BAC avec PCH ou γ-H2AX foyers sont effectuées manuellement à l'aide du logiciel Image J sans seuil automatique. (B) Perte d'une partie du signal γ-H2AX après dénaturation est l'une des principales questions techniques soulevées par ce protocole d'immuno-FISH ADN. Ici, nous montrons un exemple d'immunofluorescence avant (en haut) et après (en bas) traitement de dénaturation HCl à base de (formamide, le traitement a donné des résultats similaires (non représentée)). Bien que le signal est plus faible, les principales caractéristiques de la coloration, en particulier le nombre de foyers subsistant après le traitement. L'utilisation d'un SP5 Leica confocal, les paramètres pour le laser 561 avant et après dénaturation ont été les suivantes: 35% d'énergie / gain à puce à 730V, et la puissance de 45% / gain à puce à 750V, respectivement. En outre, nous montrons ici un exemple d'une coloration par immunofluorescence pour une autre histone modification, H3K27me3 (panneaux de droite) montrant que ce protocole peut être appliqué à d'autres marques des histones, comme cela a déjà été publié en 1,3. γ-H2AX est représenté en jaune et en rouge H3K27me3. Cercles en pointillés décrivent des formes noyau. Barre d'échelle = 2 um. Cliquez ici pour agrandir la figure .
| Nom de réactif / Matériel | Entreprise | Nombre Catalogm | Commentaires |
| H 2 O | Pêcheur | # BP2470 | |
| RNase A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | #C11397 à C-11401 | |
| Cy3 ou Cy5 dUTP | Pêcheur | # 45-001-xxx | |
| DNase I | Roche | # 04536282001 | |
| ADN Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0.025 filtres pm | Millipore | # VSWP02500 | |
| ADN Cot-1 1 mg / ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc ADN 1 mg / ml | Applied Genetics | # MHB | |
| De sperme de saumon | Sigma | # D1626 | poudre pour être remises en suspension à 10 mg / ml dans du H 2 O |
| NaAc (acétate de sodium, pH 5,2, solution tampon) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Pêcheur | N ° 525 | |
| Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Pêcheur | # BP431 | |
| Poudre de sulfate de dextrane | Sigma | # D8906 | |
| PESS (Saline-phosphate de sodium-EDTA) solution 20x | Pêcheur | # BP1328 | |
| Formamide | Pêcheur | # BP227 | |
| Lamelles de | Pêcheur | N ° 12-548-B | |
| Diapositives | Pêcheur | # 12-550 | |
| Plaques de 6 puits | Pêcheur | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Pêcheur | # MT-46-013-CM | |
| Sigma | # P8920 | ||
| Paraformaldéhyde, granulés, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol qualité | Sigma | # T8787 | |
| Fraction BSA (Bovine Serum Albumin) V | Pêcheur | # BP 1600 | |
| Sérum normal de chèvre | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol qualité | Sigma | # P9416 | |
| SSC (citrate de sodium salin) 20x solution | Pêcheur | # BP1325 | |
| ProLong réactif antifade Or | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4 ',6-diamidino-2-phénylindole) | Sigma | # D9542 | |
| Meilleur essai un ciment enveloppe en caoutchouc | Magasins de fournitures d'art ou de bureau |
Tableau 1. Réactifs spécifiques et du petit matériel.
| NT avec dUTP couplé avec Alexa-fluorophores | Montant | Concentration finale |
| 10 ug d'ADN | X ul | |
| RNase A - 0,17 pg / pl | 10 pl | |
| H 2 O | Remplissez à 260 ul | |
| TOTAL - 30 min à 37 ° C | 260 ul | |
| 10x tampon NT | 50 pi | 1x |
| 100 mM et êtreta;-mercaptoéthanol | 50 pi | 10 uM |
| mélange de dNTP | 40 pi | 40 uM de chaque dNTP |
| 0,1 mM dTTP | 50 pi | 10 uM |
| 1 mM Alexa dUTP | 12 pl | 30 uM |
| DNase I (solution de travail, voir le tableau ci-dessous) | 30 pi | |
| ADN Pol I | 7,5 pi | 15 U / ml |
| TOTAL - 2 heures à 16 ° C | 500 pi | |
| NT avec dUTP couplé au Cy3 ou Cy5 | Montant | Concentration finale |
| 10 ug d'ADN | X ul | |
| RNase A - 0,17 pg / pl | 10 pl | |
| H 2 O | Remplissez à 300 ul | |
| TOTAL - 30 min à 37 ° C | 300 pl | |
| 10x tampon NT | 50 pi | 1x |
| 100 mM β-mercaptoéthanol | 50 pi | 10 uM |
| mélange de dNTP | 50 pi | 50 uM de chaque dNTP |
| 1 mM Cy3 ou Cy5-dUTP | 12 pl | 30 uM |
| DNase I | ~ 30 pi | ~ 1,2 U / pl |
| ADN Pol I | 7,5 pi | 15 U / ml |
| TOTAL - 2 heures à 16 ° C | 500 pi |
Tableau 2. RNase A de traitement et de traduction Nick de 10 ug d'ADN.
| Solutions | Réserves | |
| RNase A | Solution de travail: 0,17 pg / pl | Composée frais |
| 10x tampon NT: | 0,5 M Tris-HCl, pH 8, 50 mM MgCl 2, 0,5 mg / ml de BSA | Tubes de 1,5 ml à -20 ° C. |
| dNTP mix: | dATP, dCTP, dGTP et: 0,5 mM chacun en H 2 O | Tubes de 1,5 ml à -20 ° C |
| DNase I: | Solution mère: reconstitué à 20.000 U / ml dans 20 mM Tris pH 7.5/50% de NaCl glycerol/50 mM | Tubes de 0,5 ml à -20 ° C |
| Solution de travail: Chaque nouveau lot de solution de DNase I doivent être testés à des dilutions différentes (10 U / ml, 20 U / ml et 40 U / ml de H 2 O). La dilution donnant un frottis d'ADN entre 100 et 1000 pb (voirétape 5) doit être utilisé en tant que solution de travail. | Composée frais |
Tableau 3. Solutions pour le traitement RNase A et traduction Nick.
| Tampon d'hybridation | Solutions | Réserves | |
| 10% | 50x solution de Denhardt: | 1 g de Ficoll 400, 1 g Polyvinylpyrrolidone et 100 ml de H 2 0 - Avec filtre | Falcon de 50 ml à -20 ° C |
| 40% | 25% sulfate de dextran: | Poudre de sulfate de dextrane est dissous dans 12,5 x SSPE à 37-65 ° C | Falcon de 50 ml à -20 ° C |
| 50% | Formamide | Bouteilles à +4 ° C | |
| Des aliquotes de 1,5 ml eppendorfs sont stockés à -20 ° C | |||
Tableau 4. Tampon d'hybridation.
| Anticorps | Fournisseur | Numéro de catalogue | Dilution |
| γ-H2AX - H2A.X phospho, clone JBW301, monoclonal de souris | Millipore | # 05636 | 1/200 |
| H3K27me3, clone, polyclonal de lapin | Millipore | # 07449 | 1/200 |
| Alexa Fluor 555 âne anti-souris | Invitrogen | # A-31570 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 de chèvre anti-souris | Invitrogen | # A-11001 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 de chèvre anti-lapin | Invitrogen | # A-11008 | 1/500 | </ Tr>
Tableau 5. Anticorps primaires et secondaires.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Les techniques décrites ci-dessus ont été utilisées dans notre laboratoire pour analyser la réglementation de V (D) J de l'immunoglobuline et TCRA / j loci dans le développement des lymphocytes 30,31. Nous sommes convaincus que cette technique peut être adaptée pour la détection de diverses protéines nucléaires, des compartiments nucléaires et les lieux, dans différents types cellulaires. Modifications du protocole peut être nécessaire, et dans ce cas les étapes majeures de se concentrer sur sont les suivants. Tout d'abord, la longueur de perméabilisation peut être ajustée en fonction de la cellule-type. La deuxième longueur de l'incubation anticorps primaire peut également être ajusté en fonction de la qualité de l'anticorps et de l'abondance de la protéine d'intérêt (par exemple, dans certains cas, l'incubation peut être réalisée pendant une nuit à 4 ° C). Fait important, l'étape de dénaturation peut être adapté, et le traitement HCl peut être remplacé par une dénaturation de formamide 3,4,34 et NaOH pour FISH ADN 20. Également répétered cycles gel-dégel de l'azote liquide peut être appliquée aux cellules après fixation / perméabilisation pour FISH ADN seul 4,34. Enfin, alors que plusieurs modifications des histones, l'ARN polymérase II et co-facteurs ont été détectés avec succès en utilisant cette méthode 30,35, immuno-coloration pour d'autres protéines nucléaires peut être réalisée après l'hybridation FISH ADN 4.
L'analyse d'image 3D peut impliquer l'utilisation de différents types de microscopes, y compris à grand champ à épifluorescence (couplé avec déconvolution) et la microscopie confocale laser 36. Le choix de la méthode d'imagerie dépend de la résolution nécessaire, le nombre de fluorophores, la profondeur des échantillons et de la qualité des signaux d'ADN et de protéines. Le développement de nouveaux microscopes haute résolution ouvre une toute nouvelle avenue dans la visualisation précise des processus nucléaires et cellulaires 37-39. En outre, de nouvelles techniques de generation-mesure de sondes qui ne contiennent pas de séquences répétitives de permettre la détection de régions génomiques propre, à partir d'un 15-kb du locus spécifique, pour les piscines de complexes exons 40. Cela augmente la précision et la sensibilité de microscopie à haute résolution dans le suivi de la dynamique des processus nucléaires.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts financiers.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Skok, surtout Susannah Hewitt, de discussions et de commentaires. Ce travail est soutenu par l'Institut national de la santé subventions R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS est une leucémie et érudit Lymphoma Society. JC est un Fellow Irvington Institut de la recherche sur le cancer Institut. MM est soutenu par une éducation National Science Foundation Grant universitaire intégré et des stages de recherche (NSF IGERT 0333389).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H2O | Fisher | # BP2470 | |
| RNase A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
| Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
| DNase I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
| Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
| Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
| Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
| Formamide | Fisher | # BP227 | |
| Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
| Slides | Fisher | # 12-550 | |
| 6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
| Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
| Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
| SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
| Best test one coat rubber cement | Art or office supply stores | ||
| Table 1. Specific reagents and small equipment. | |||
References
- Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods in enzymology. , 376-405 (2004).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods Mol. Biol. 463, 205-239 (2008).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods Mol. Biol. 659, 117-126 (2010).
- Markaki, Y. The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination microscopy for studies of 3D nuclear architecture: 3D structured illumination microscopy of defined chromosomal structures visualized by 3D (immuno)-FISH opens new perspectives for studies of nuclear architecture. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 34, 412-426 (2012).
- Heard, E., Bickmore, W. The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation. Current opinion in cell biology. 19, 311-316 (2007).
- Misteli, T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell. 128, 787-800 (1016).
- Fraser, P., Bickmore, W. Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation. Nature. 447, 413-417 (2007).
- Cremer, T., et al. Chromosome territories--a functional nuclear landscape. Current opinion in cell biology. 18, 307-316 (2006).
- Mao, Y. S., Zhang, B., Spector, D. L. Biogenesis and function of nuclear bodies. Trends in genetics : TIG. 27, 295-306 (2011).
- Dostie, J., Bickmore, W. A. Chromosome organization in the nucleus - charting new territory across the Hi-Cs. Current opinion in genetics & development. 22, 125-131 (2012).
- van Steensel, B., Dekker, J. Genomics tools for unraveling chromosome architecture. Nature. 28, 1089-1095 (2010).
- Massey, F. J. The Kolmogorov-Smirnov Test for Goodness of Fit. Journal of the American Statistical Association. 253, 1951 (1951).
- Collins, A., et al. RUNX transcription factor-mediated association of Cd4 and Cd8 enables coordinate gene regulation. Immunity. 34, 303-314 (2011).
- Fisher, R. A. On the interpretation of χ2 from contingency tables, and the calculation of P. Journal of the Royal Statistical Society. 85, 87-94 (1922).
- Benjamini, Y. H., Yosef, Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological). 57, 125-133 (1995).
- Fitzsimmons, S. P., Bernstein, R. M., Max, E. E., Skok, J. A., Shapiro, M. A. Dynamic changes in accessibility, nuclear positioning, recombination, and transcription at the Igkappa locus. J. Immunol. 179, 5264-5273 (2007).
- Fuxa, M., et al. Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene. Genes Dev. 18, 411-422 (2004).
- Goldmit, M. Epigenetic ontogeny of the Igk locus during B cell development. Nature. 6, 198-203 (2005).
- Hewitt, S. L. Association between the Igk and Igh immunoglobulin loci mediated by the 3' Igk enhancer induces 'decontraction' of the Igh locus in pre-B cells. Nature. 9, 396-404 (2008).
- Johnson, K. IL-7 Functionally Segregates the Pro-B Cell Stage by Regulating Transcription of Recombination Mediators across Cell Cycle. Journal of Immunology. , (2012).
- Karnowski, A., et al. Silencing and nuclear repositioning of the lambda5 gene locus at the pre-b cell stage requires Aiolos and OBF-1. PLoS ONE. 3, e3568 (2008).
- Kosak, S. T. Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development. Science. 296, 158-162 (2002).
- Liu, H., et al. Yin Yang 1 is a critical regulator of B-cell development. Genes Dev. 21, 1179-1189 (2007).
- Parker, M. J. The pre-B-cell receptor induces silencing of VpreB and lambda5 transcription. Embo J. 24, 3895-3905 (2005).
- Roldan, E., et al. Locus 'decontraction' and centromeric recruitment contribute to allelic exclusion of the immunoglobulin heavy-chain gene. Nature immunology. 6, 31-41 (2005).
- Skok, J. A. Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes. Nature. 2, 848-854 (2001).
- Skok, J. A. Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes. Nature immunology. 8, 378-387 (2007).
- Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location. Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).
- Hewitt, S. L. RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci. Nature immunology. 10, 655-664 (2009).
- Deriano, L., et al. The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis. Nature. 471, 119-123 (2011).
- Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division. Molecular cell. 3, 207-217 (1999).
- Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA repair. 3, 959-967 (2004).
- Croft, J. A., et al. Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus. The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).
- Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
- Walter, J., et al. Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei. Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).
- Dobbie, I. M. OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging. Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).
- Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).
