हम आंतरिक झिल्ली टूटना पर नज़र रखने के लिए एक विधि का वर्णन इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया द्वारा हासिल<em> शिगेला flexneri<em></em</em> और<em<em><em> माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग</em></em</em> मेजबान सेल आक्रमण पर. हमारी परख CCF4 का उपयोग करता है, साइटोप्लाज्मिक एक मेजबान रहते हैं या तय कोशिकाओं में जांच झल्लाहट. इस संवाददाता बैक्टीरियल सतह पर एक एंजाइम गतिविधि उपस्थित द्वारा अपमानित है.
शिगेला flexneri एक endocytic कोटर में प्रवेश मेजबान कोशिकाओं पर आक्रमण कि रोगजनक बैक्टीरिया होते हैं. इसके बाद, इस झिल्ली संलग्न कम्पार्टमेंट का टूटना, बैक्टीरिया साइटोसॉल भीतर ले जाने के लिए अनुमति देता है पैदा करना और आगे पड़ोसी कोशिकाओं पर आक्रमण. माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा phagocytosed है, और हाल ही में मैक्रोफेज में टूटना phagosomal झिल्ली को दिखाया गया है. हम शिगेला flexneri या माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग के मेजबान सेल प्रविष्टि के बाद phagosomal झिल्ली विघटन नज़र रखने के लिए एक मजबूत परख विकसित. दृष्टिकोण CCF4 का उपयोग करता है, एक मेजबान कोशिकाओं के cytosol में equilibrates कि β-lactamase के प्रति संवेदनशील संवाददाता झल्लाहट. बैक्टीरिया झिल्ली संलग्न डिब्बों में निवास के रूप में बैक्टीरियल रोगज़नक़ों द्वारा मेजबान कोशिकाओं के आक्रमण के लिये, जांच में लंबे समय के रूप में बरकरार है. तुरन्त इंट्रासेल्युलर रोगज़नक़ cleaves CCF4 की सतह पर रिक्तिका, β-lactamase गतिविधि के विघटन के बाद नेतृत्वसंकेत झल्लाहट का नुकसान करने के लिए आईएनजी और उसके उत्सर्जन स्पेक्ट्रम स्विचन. इस मजबूत ratiometric परख हमलावर जीवाणुओं द्वारा प्रेरित vacuolar टूटना के समय के बारे में सटीक जानकारी पैदावार, और यह उत्सर्जन के संकेतों का पता लगाने के लिए विशेष एल्गोरिदम द्वारा स्वचालित माइक्रोस्कोपी और छवि प्रसंस्करण के लिए युग्मित किया जा सकता है दाता और स्वीकर्ता झल्लाहट. इसके अलावा, यह एकल कक्षों में वास्तविक समय में intracellular बैक्टीरिया द्वारा हासिल vacuolar विघटन की गतिशीलता की जांच की अनुमति देता है. अंत में, यह पूरी तरह से पिछले विधियों से अधिक स्थानिक-अस्थायी समाधान के साथ उच्च throughput विश्लेषण के लिए अनुकूल है. यहाँ, हम शिगेला flexneri साथ ही ऐसे माइकोबैक्टीरियम marinum, माइकोबैक्टीरियम बोविस, के रूप में कई माइक्रोबैक्टीरियल उपभेदों का उपयोग करते समय चूक प्रयोगों या अंत अंक प्रयोगों के लिए HELA कोशिकाओं और THP-1 मैक्रोफेज पर CCF4 vacuolar टूटना परख के लिए अनुकरणीय प्रोटोकॉल की प्रायोगिक जानकारी प्रदान करते हैं और माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग.
कई बैक्टीरियल रोगज़नक़ों संक्रमण के अपने पाठ्यक्रम के दौरान कोशिकाओं की झिल्ली संलग्न डिब्बों में भली भाँति रहे हैं. मैक्रोफेज द्वारा किया जाता है, या रोगजनकों सक्रिय रूप से आम तौर पर गैर phagocytic कोशिकाओं में अपने तेज को प्रेरित कर रहे हैं कि माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग के लिए मामला है के रूप में सेल प्रविष्टि, विशेष मेजबान कोशिकाओं द्वारा phagocytosis के माध्यम से या तो होता है. प्रेरित तेज के मामले में, शिगेला flexneri के लिए उदाहरण के लिए, रोगज़नक़ अन्य सेल कार्यों एक endosomal डिब्बे 1,2 भीतर बैक्टीरियल स्थानीयकरण में जिसके परिणामस्वरूप कसकर विनियमित एंडोमेम्ब्रेन छँटाई मशीनरी के बीच अपहरण कि मेजबान cytosol में प्रेरक प्रोटीन इंजेक्शन. बाद में, शिगेला vacuolar टूटना और मेजबान झिल्ली तस्करी और लाइसोसोम करने से परहेज वितरण के साथ हस्तक्षेप रोगज़नक़ के साइटोसोलिक उपयोग करने के लिए अग्रणी enclosing झिल्ली बाधित. अभी हाल ही में phagolysosomal टूटना भी संक्रमण str के रूप में पाया गया हैategy माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग, विशेष रूप से एक झिल्ली ही सीमित डिब्बे 3,17 भीतर स्थानीयकृत करने के लिए एक लंबे समय के लिए सोचा था कि एक रोगज़नक़ द्वारा प्रयोग किया जाता है.
आक्रामक रोगजनकों के subcellular झिल्ली तस्करी की गतिशीलता की जांच करने के लिए, महान सुधार 4,5 देर से 1980 के दशक के अध्ययन के आधार पर ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) के बाद हासिल किया गया है. उदाहरण के लिए, रंगों का उपयोग कर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी आधारित विधियों, बैक्टीरियल सतह घटकों, या subcellular डिब्बों के साथ सह स्थानीयकरण के लिए मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी 6,7 पदभार संभाल लिया है. हालांकि, वे अभी भी सटीक spatiotemporal संकल्प और मात्रात्मक बैक्टीरियल रोगज़नक़ों द्वारा vacuolar टूटना को मापने के लिए मजबूती उपज नहीं है.
इस बाधा को पहला जीन अभिव्यक्ति 8 अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था कि cephalosporin झल्लाहट CCF4-AM के व्युत्पन्न संवाददाता के आधार पर एक परख के साथ संबोधित किया गया है. फिर, यह संसाधनों के संदर्भ में इस्तेमाल किया गया थाection जीव विज्ञान प्रेरक स्राव की जांच के लिए और मेजबान कोशिकाओं 9,10,11 में नेइसेरिया के तेज पालन करने के लिए. हम शिगेला flexneri 12 और माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग 17 से प्रेरित vacuolar टूटना के अध्ययन के लिए इस संवाददाता का लाभ लेने के एक परख विकसित. हमारे विधि के सिद्धांत शिगेला flexneri का उपयोग कर चित्र 1 में वर्णित है. सबसे पहले, मेजबान कोशिकाओं AM एस्टर moieties बंद cleaving के बाद cytoplasm के अंदर फंस गया है कि झल्लाहट CCF4-AM सब्सट्रेट के साथ लोड कर रहे हैं. फिर, कोशिकाओं शिगेला flexneri से संक्रमित हैं. जीवाणुओं की सतह पर β-lactamase उपहार के रूप में जल्द ही vacuolar टूटना होता है के रूप में फोड़ना CCF4 सब्सट्रेट करने में सक्षम है. यह 405 एनएम पर जांच की उत्तेजना पर 450 एनएम के लिए 535 एनएम से उत्सर्जन चोटी स्विचिंग झल्लाहट संकेत का नुकसान होता है. 450/535 एनएम तीव्रता के ratiometric माप vacuolar अखंडता डाला: कम अनुपात झिल्ली एन प्रतिबिंबितउच्च अनुपात जबकि बंद या बाह्य बैक्टीरिया बैक्टीरिया और मेजबान साइटोसॉल के बीच संपर्क को दर्शाते हैं. हम भी THP-1 मैक्रोफेज में माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग से प्रेरित phagosomal टूटना का अध्ययन करने के लिए इस विधि के एक अनुकूलन रिपोर्ट. अनुक्रम CCF4-AM के लदान केवल बैक्टीरिया के संक्रमण के बाद लागू किया जाता है, उलट है, हालांकि प्रायोगिक सिद्धांतों ही रहते हैं.
इस प्रकार, एकल कोशिका के स्तर पर मात्रात्मक ratiometric प्रतिदीप्ति द्वारा माप, शिगेला flexneri की vacuolar टूटना वास्तविक समय में और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं 12,13,14 से तय नमूनों में लगाया जा सकता है. इसके अलावा, इस विधि माइकोबैक्टीरियम बोविस और माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग का उपयोग करते हुए इस अध्ययन में दिखाया गया के रूप में अन्य इनवेसिव रोगज़नक़ों के एक नंबर के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. अंत में, अच्छी तरह से 96 (या अच्छी तरह से 384) के लिए हमारे प्रोटोकॉल प्रारूपों के miniaturization उच्च throughput में कई शर्तों की स्क्रीनिंग की अनुमति देता है.
CCF4-AM/β-lactamase परख इंट्रासेल्युलर शिगेला flexneri और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में माइक्रोबैक्टीरिया से प्रेरित vacuolar व्यवधान ट्रैक करने के लिए एक सरल तरीका है. यह बैक्टीरिया की सतह पर सक्रिय एक एंजाइम द्वारा cleaved है कि एक लैक्टामेज़ संवेदनशील साइटोप्लाज्मिक झल्लाहट संवाददाता का उपयोग करता है.
CCF4-AM सब्सट्रेट के नुकसान को आसानी से सब्सट्रेट के लोड करने के बाद सभी समाधान के लिए प्रोबेनेसिड जोड़कर बचा जा सकता है. प्रदर्शन के रूप में, परख अनेक प्रकार की कोशिकाओं (उपकला कोशिकाओं, phagocytic कोशिकाओं) और प्रारूपों (96, 35 मिमी गिलास नीचे बर्तन, 6/12/24 अच्छी तरह प्लेटें) के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. 6/12/24 अच्छी तरह से थाली के उपयोग के लिए, बाँझ coverslips कोशिकाओं को बोने से पहले प्रत्येक कुएं के तल पर वितरित कर रहे हैं. प्रयोग के अंत में, coverslips के गोल्ड antifade अभिकर्मक (Invitrogen) के लम्बा जैसे, बढ़ते मध्यम में स्लाइड्स पर स्थानांतरित कर रहे हैं. इस तरह के संकेत परख के बाद अब समय अवधि के लिए स्थिर हैनमूने निर्धारण के बाद पीबीएस में संरक्षित कर रहे हैं जहां 96 कुओं प्रारूप की तुलना में. CCF4-AM सब्सट्रेट की उच्च लागत नमूना मात्रा के निर्धारण से पहले ध्यान में रखा जाना चाहिए. हम उन्हें नीचे स्केलिंग की अनुशंसा करते हैं. प्रयोगों 6/12/24 अच्छी तरह प्रारूप में अधिक महंगे हैं, लेकिन संकेतों दिनों के लिए स्थिर रहे हैं. इसके विपरीत, प्रयोगों 96 प्रारूप में सस्ता कर रहे हैं, लेकिन नमूने प्रयोग के दिन पर विश्लेषण किया जाना है. यह जीना प्रयोगों को भी 96 या 384 भी प्रारूप में प्रदर्शन किया जा सकता है कि उल्लेखनीय है. यह अच्छी तरह से प्रति पदों की संख्या के साथ एक ही समय (उत्परिवर्ती बैक्टीरिया, MOI, प्लाज्मिड या siRNA अभिकर्मक, रसायन आदि) में शर्तों के दर्जनों का उपयोग रहते प्रयोग का प्रदर्शन करने की अनुमति देता है. शिगेला flexneri के लिए अनुकूल है, हम संक्रमण चक्र cytosol में बनाए रखा जा सकता है कि CCF4 की औसत दर्जे का सांद्रता अधिक है क्योंकि "सच" वास्तविक समय या समय चूक प्रयोगों माइक्रोबैक्टीरिया पढ़ाई के लिए संभव नहीं है कि प्रकाश डाला. के लिएइस कारण, CCF4-AM सब्सट्रेट आक्रमण हासिल होने के बाद ही कोशिकाओं पर लागू किया जाता है.
MetaMorph सॉफ्टवेयर के अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है मामले में, हम अच्छी तरह से प्रति चित्रों की एक निर्धारित संख्या के साथ एक संपूर्ण 96/384 अच्छी तरह से थाली प्राप्त करने की अनुमति देता है कि मॉड्यूल "स्क्रीन अधिग्रहण" का उपयोग करने की सलाह देते हैं. इसके अलावा, मॉड्यूल "समीक्षा स्क्रीन डेटा" की अनुमति देता है (मैं) एक बड़ी "पोस्टर" पर एक ही समय में किसी भी चैनल के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक के सिले तस्वीर मोज़ेक visualizing और (ii) 535 में तीव्रता को मापने के लिए एक विशेष एल्गोरिथ्म पाशन और 450 एनएम चैनल. हालांकि, हम समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग एक बैक्टीरिया द्वारा vacuolar टूटना को मापने के लिए सक्षम किया गया है, हम प्रतिपादन व्यक्ति जीवाणुओं की सतह पर enzymatic गतिविधि यह मुश्किल ठीक इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया और vacuolar की प्रभावशीलता की संख्या सहसंबंधी तक की हो सकती है कि सावधानी करना चाहते हैं टूटना.
परख की मजबूती को देखते हुए यह घंटे के लिए अनुकूल हैigh throughput के 96 या 384 अच्छी तरह स्वरूपों में दृष्टिकोण. हम भी सफलतापूर्वक निलंबन 16 में कोशिकाओं के संक्रमण का अध्ययन करने के FACS विश्लेषण के लिए इस प्रोटोकॉल को ढाल लिया है. परख भी आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अग्रणी, उनकी सतह पर लैक्टामेज़ पेश अन्य बैक्टीरिया या वाहकों की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, इस दृष्टिकोण β-lactamase व्यक्त लीजोनेला pneumophila, लिस्टेरिया monocytogenes या साल्मोनेला के रूप में 12 अन्य रोगजनकों द्वारा प्रेरित vacuolar टूटना अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. लिस्टेरिया monocytogenes शिगेला flexneri लिए तुलनीय एक छोटी संक्रमण चक्र के बाद से, समय चूक प्रयोगों संभव हो रहे हैं. इसके विपरीत, क्योंकि लीजोनेला pneumophila और साल्मोनेला प्रदर्शन लंबे संक्रमण चक्र, हम अंत बिंदु प्रयोगों प्रदर्शन करने की सलाह देते हैं.
संभव आवेदनों की विविधता CCF4-AM/β-lactamase परख एक बनाता हैनिश्चित नमूनों में या वास्तविक समय में intracellular रोगजनकों द्वारा प्रेरित vacuolar टूटना पर नज़र रखने के लिए दिलचस्प fluorometric विधि.
The authors have nothing to disclose.
इस काम एजेंस नेशनल डालना ला Recherche द्वारा और यूरोपीय अनुसंधान परिषद द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
LiveBlazer FRET-B/G Loading Kit (CCF4-AM) | Invitrogen | K1089 | Protect from light, stock in – 80 ° aliquots |
Draq5 | Biostatus | DR50050 | |
Poly-L-lysine | Sigma | P9155 | |
μCLEAR-PLATE, BLACK, 96 well | Greiner Bio-One | 655090 | |
35 mm glass bottom dishes | MatTek corp. | P35G-1.5-10-C | |
Probenecid | Sigma | P8761 | |
β-lactamase | Sigma | P0389 |