Medidas de flexión rigidez de biopolímeros utilizando ensayos de Vuelo a Vela

Resumen

Un método para medir la longitud de persistencia o rigidez a la flexión de los biopolímeros se describe. El método utiliza una quinesina impulsado por microtúbulos ensayo de deslizamiento para determinar experimentalmente la longitud de persistencia de los microtúbulos individuales y es adaptable a actina ensayos basados ​​en deslizamiento.

Resumen

Los microtúbulos son polímeros del citoesqueleto que desempeñan un papel en la división celular, la mecánica celular y el transporte intracelular. Cada una de estas funciones requiere microtúbulos que son rígidos y recta suficiente para abarcar una fracción significativa de la célula de diámetro. Como resultado, la longitud de persistencia microtúbulos, una medida de la rigidez, se ha estudiado activamente durante las últimas dos décadas ^1. No obstante, las preguntas abiertas permanecen: microtúbulos cortos son 10-50 veces menos rígidos que los microtúbulos largos ^2-4, e incluso microtúbulos largas han medido las longitudes de persistencia que pueden variar en un orden de magnitud ^5-9.

A continuación, se presenta un método para medir la longitud de microtúbulos persistencia. El método se basa en un kinesin impulsado por microtúbulos ensayo de deslizamiento ^10. Mediante la combinación de etiquetado fluorescente escaso de microtúbulos individuales con seguimiento sola partícula de fluoróforos individuales unidos a los microtúbulos, la gliding trayectorias individuales de los microtúbulos se realiza un seguimiento con precisión nanométrica nivel. La persistencia de longitud de las trayectorias es la misma que la longitud de persistencia de los microtúbulos en las condiciones utilizadas ^11. Una rutina de seguimiento automatizado se utiliza para crear trayectorias de microtúbulos a partir de los fluoróforos unidos a los microtúbulos individuales, y la longitud de persistencia de esta trayectoria se calcula utilizando las rutinas escritas en IDL.

Esta técnica es rápida implementación, y capaz de medir la longitud de persistencia de 100 microtúbulos en un día de experimentación. El método puede ser extendido para medir la longitud de persistencia bajo una variedad de condiciones, incluyendo la longitud de persistencia como una función de la longitud a lo largo de microtúbulos. Además, las rutinas de análisis usados ​​pueden extenderse a miosina de acción basados ​​en ensayos de deslizamiento, para medir la longitud de persistencia de los filamentos de actina también.

Introducción

El citoesqueleto, una red de biopolímeros se encuentran en la mayoría de las células eucariotas, desempeña un papel en la organización celular, el transporte intracelular, y la mecánica celular. Las características mecánicas de los biopolímeros del citoesqueleto (principalmente actina y microtúbulos) desempeñan un papel importante en la determinación de las características mecánicas de la célula como un todo ^12. Puesto que la mecánica de células enteras puede caracterizar células sanas y enfermas ^13,14 y está implicado en la motilidad celular ^15, las propiedades mecánicas de los componentes del citoesqueleto subyacentes han sido un ár....

Protocolo

1. Microtúbulos delta del ensayo de Soluciones

Prepárese con ensayo de deslizamiento.

1. Polimerizar 0,5 mg microtúbulos poco marcados con fluoróforo brillante orgánica ^22. La concentración etiqueta de destino es 1 fluoróforo por micrómetro de microtúbulos, o una densidad de etiquetado de aproximadamente 1 por cada 1.500 fluoróforo dímeros de tubulina. Almacenar a temperatura ambiente, protegida de la luz con aluminio, papel de aluminio de hasta dos semanas.
2. Purificar biotina-quinesina ²¹ a aproximadamente 1 mM. Almacenar a -80 ° C en 5 ml de alícuotas para su uso en los experimentos individuales. <....

Resultados

Una instantánea de un ensayo de deslizamiento se muestra en la Figura 2. Una densidad de los microtúbulos es bueno microtúbulos 1-10 por campo de visión; sustancialmente más resultará en mal seguimiento como microtúbulos se cruzan entre sí. Una gráfica de las trayectorias 11 de microtúbulos a partir del ensayo de deslizamiento en la Figura 2 se muestra en la Figura 3. Trayectorias típicas son de 10 a 30 um de largo; algunas trayectorias tienen espacios donde uno se cruz.......

Discusión

Mediciones Longitud persistencia son una buena caracterización de las propiedades mecánicas de biopolímeros individuales. En este artículo, hemos descrito un método de medición de la longitud de persistencia de los microtúbulos. Como se ha señalado en la introducción, este método se extiende fácilmente a examinar las propiedades mecánicas de microtúbulos en una variedad de condiciones, simplemente variando los reactivos, la temperatura o viscosidad en la etapa final del ensayo de deslizamiento, 3,9, o por polimerización.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos
Imidazol	Sigma-Aldrich	I2399
Cloruro potásico	Sigma-Aldrich	P9541
Cloruro de magnesio	Sigma-Aldrich	M8266
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
BSA	Calbiochem	126615
Biotinilado BSA	Thermo Scientific	29130
Α-caseína	Sigma-Aldrich	C6780
Estreptavidina	Thermo Scientific	21125
Ditiotreitol	Sigma-Aldrich	D0632
Paclitaxel	LC Laboratorios	P-9600
Glucosa oxidasa	Sigma-Aldrich	G2133
Catalasa	Sigma-Aldrich	C100
Glucosa	Sigma-Aldrich	G8270
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
2-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148	Toxic. Comprar pequeña cantidad.
24x60 mm N º 1 1/2 tapa de vidrio	VWR	48393-252
22x22 mm N º 1 cubierta de vidrio	Gold Seal	3306
Grasa de alto vacío	Dow-Corning	NA
Equipos
Microscopio TIRF	Muchos	NA	El microscopio TIRF utilizado en este método fue hecho en casa.
IDL (software)	Exelis	NA	¿Podría sustituir MATLAB, ImageJ, u otro software de análisis de imágenes.