כאן אנו מתארים שיטה יעילה ללימוד דינמיקה של פינוי תאים אפופטוטיים In vivo. שיטה זו מעסיקה לחיות דרוזופילה עובר כמודל רב עוצמה לphagocytosis הניטור של תאים אפופטוטיים באמצעות תיוג ספציפי של תאים וphagocytes אפופטוטיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
החיסול התקין של תאים לא רצויים או חריגים באמצעות אפופטוזיס וphagocytosis שלאחר מכן (אישור תאים אפופטוטיים) הוא חיוני להתפתחות תקינה בכל היצורים מטזואניים. אישור תאים אפופטוטיים הוא תהליך דינמי מאוד קשר אינטימי עם מוות של תאים, תאים אפופטוטיים unengulfed נראים בקושי in vivo בתנאים רגילים. על מנת להבין את השלבים של אישור תאים אפופטוטיים השונים ולהשוות phagocytes "מקצועי" - מקרופגים ותאים דנדריטיים ל" הלא מקצועי "- תאים שכנים רקמת התושב, בהדמיה לחיות vivo של התהליך הוא יקר מאוד. כאן אנו מתארים פרוטוקול ללימוד אישור תאים אפופטוטיים בעוברים תסיסנית חיים. כדי לעקוב אחר הדינמיקה של שלבים שונים בphagocytosis אנו משתמשים סמנים ספציפיים לתאים וphagocytes אפופטוטיים. בנוסף, אנו יכולים לעקוב אחר שתי מערכות תא בלען במקביל: מקרופאגים 'מקצועיים' ו 'חצי profeגליה 'ssional במערכת העצבים המרכזית בפיתוח (CNS). השיטה המתוארת כאן מעסיקה את עובר דרוזופילה כמודל מצוין ללימודים בזמן אמת של פינוי תאים אפופטוטיים.
מבוא
החיסול התקין של תאים לא רצויים או חריגים באמצעות אפופטוזיס וphagocytosis הבא הוא קריטי להתפתחות עוברית, כמו גם לאיזון רקמות במבוגר. Phagocytosis של תאים אפופטוטיים או סילוק תאים אפופטוטיים הוא תהליך דינמי מאוד אשר ממשיך בארבעה שלבים: (1) גיוס של phagocytes לתאים אפופטוטיים ("למצוא אותי"), (2) הכרה בתא כיעד לphagocytosis ( 'אוכל אותי') ו (3) היבלעות, ואחריו (4) הבשלת phagosome והשפלה של החלקיקים אפופטוטיים 1-5. ישנם שני סוגים של phagocytes: מקרופגים "מקצועיים" ותאים דנדריטיים, ולא בשלה "הלא מקצועי" תאים שכנים רקמת תושבים, שהם חיוניים לשחרור מתאים אפופטוטיים במהלך מטזואניים פ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כדי לעקוב אחר הדינמיקה של אישור אפופטוטיים תא in vivo שתי אוכלוסיות של תאים חייבים להיות מתויגים: תאי phagocytic ותאים אפופטוטיים.
כדי לסמן אוכלוסיות תאי phagocytic אנו משתמשים שורת דרוזופילה המכילים את הסמן Simu-cytGFP, אשר תוויות תאים באופן בלעדי phagocytic בעובר: מקרופאגים, גליה והאאקטודרם 8. אפשר להשתמש בסמנים שונים לתאי phagocytic, כולל שורות המכילות נהג Gal4 hemocyte ספציפי (CRQ-Gal4) או גליה ספציפי Gal4 נהג (repo-Gal4) וכתב ניאון מקודד גנטי תחת שליטת כטב"מ (כטב"מ-GFP).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מסגרות נציג מסרט שבו תאים אפופטוטיים מסומנים עם Annexin V, וגליה, האאקטודרם ומקרופאגים מסומנים עם Simu-cytGFP מוצגות באיור 2. כל מסגרת היא השלכה של 3 פרוסות 2 מיקרומטר כל אחד.
העובר של שלב 15 ממוקם כראוי מראה את מערכת עצבים העובריים באמצע עם גליה שכותרתו היטב (ז). המקרופאגים (מ '), שהם בעיקר מחוץ למערכת העצבים המרכזית, מראים ביטוי של GFP cytoplasmic חזק. תאי ectodermal גם מסומנים עם .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אישור תאים אפופטוטיים הוא שלב אחרון קריטי של אפופטוזיס, שהוא מאוד דינמי. לכן לימודים בזמן אמת של התהליך הם בעלי חשיבות עליונה. כאן אנו מתארים פרוטוקול המאפשר ניטור של אישור תאים אפופטוטיים בחיים עובר תסיסנית מתפתחים. בהליך זה, שתי אוכלוסיות של תאים חייבים להיות מסומנות באמצעות סמנים ספציפיים: תאים וphagocytes אפופטוטיים. כתב Simu-cytGFP מתאים לניטור מקרופאגים phagocytic, גליה והאאקטודרם בו זמנית באותו העובר, W hich מאפשר לעקוב אחר אוכלוסיות תאי phagocyti.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מארי קירי Reintegration גרנט (IRG249084). אנו מודים לכל חברי המעבדה Kurant.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>מגיב | |||
| Annexin V | בדיקות מולקולריות | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| LysoTracker | בדיקות מולקולריות | L-7528 | |
| שמן הלוקרביון 700 | Sigma | H8898 | |
| < צינורות נימיים חזקים> | |||
| FHC | 30-30-0 | ||
| מסננת תאים | SPL | 93100 | |
| מברשת |
מקורות
- Kinchen, J. M. A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse. Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 78....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
