Existe um interesse crescente na compreensão das funções imunológicas de subpopulações específicas de células em placas de Peyer (PP), os locais primários indutivos de tecidos linfóide associado ao intestino. Aqui destacamos protocolos paralelos para preparar PP preparações de células individuais para análise por citometria de fluxo e criosseções PP para imunocoloração.
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Artigo de método
Isolar e imunocoloração linfócitos e células dendríticas a partir de placas de Peyer Murino
Neste artigo
Resumo
Resumo
Placas de Peyer (PP) são componentes integrais dos tecidos linfóide associado ao intestino (GALT) e desempenham um papel central na imunovigilância intestinal e homeostase. Antigénios particulados e micróbios no lúmen intestinal estão continuamente sujeitos a amostragem por células PP M no epitélio folicular-associado (FAE) e transportado para uma rede de base de células dendríticas (DC), macrófagos, linfócitos e. Neste artigo, descreve protocolos em que PPs murinos são (i) dissocia-se em suspensões de células isoladas e sujeitas a citometria de fluxo, e (ii) preparado para cryosectioning e imunocoloração. Para a citometria de fluxo, PPs são dissociadas mecanicamente e em seguida filtrada através de membranas 70 uM para gerar suspensões de células individuais livres de células epiteliais e os detritos de grandes dimensões. Começando com 20-25 PPs (a partir de quatro ratinhos), esse método rápido e reproduzível origina uma população de> 2,5 x 10 6 células, com> 90% de viabilidade celular. Para cryosectioning, frescoPPs ly isoladas estão imersos em meio de corte ideal de temperatura (OCT), congelado em nitrogênio líquido, e seccionados usando um cryomicrotome. As secções de tecido (5-12 mm) são secas ao ar, fixadas com acetona ou metanol, e, em seguida, submetido a imunomarcação.
Introdução
Placas de Peyer (PP) são agregados macroscópicos de organizados folículos linfóides presentes em todo o intestino delgado dos humanos e ratos (Figura 1) e que constituem os sítios primários em que mucosas respostas imunes são iniciadas contra antígenos alimentares, bactérias comensais, agentes patogénicos microbianos e vacinas orais 1-4. Ao contrário de outros tecidos linfóides periféricos, como os linfonodos mesentéricos, PPs não têm vasos linfáticos aferentes. Como tal, as respostas imunes adaptativas em PPs são accionados em resposta a antigénios derivados a partir do lúmen intestinal. A amostragem de antigénios luminais é realizado pel....
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Protocolo
Os animais foram alojados em convencionais, livres de patógenos específicos condições e foram tratados em total conformidade com cuidado o Wadsworth Center Animal da Comissão Institucional e de Uso (IACUC) diretrizes.
1. Gavagem oral
- (Opcional) estirpe de ratinho Gavage de escolha com antigénio ou micróbios de interesse utilizando uma G 22 x1.5-in. blunt-ponta da agulha alimentação (Popper Scientific, New Hyde Park, NY). Volumes de entrega não deve exceder 400 ul por rato.
2. Isolamento de Células PP para Citometria de Fluxo
- Euthanize ratos por asfixia CO 2, de acordo com....
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Resultados
Citometria de fluxo e suspensões monodispersas de células totais PP revela uma clara distinção entre preparações de células boas e pobres. Em preparações de células com mais de 80 anos de boa viabilidade%, a grande maioria das células demonstram alta dispersão frontal (FSC), um indicador do volume da célula de alta e baixa dispersão lateral (SSC), um indicador de granularidade baixa de células (Figura 2A). Nesta experiência, também preparado intencionalmente a "preparação de células pobres" po.......
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Discussão
Neste artigo, nós fornecemos protocolos paralelos para preparar PP preparações de células individuais para análise por citometria de fluxo e funcional e criosseções para a imunocoloração. Ambos os métodos são altamente reprodutível e facilmente acessível, na condição de um citómetro de fluxo e criostato estão disponíveis. Para os investigadores primeira vez deve-se sublinhar que, quando comparado com o baço, o rendimento total de células de PPs são relativamente escassas. No entanto, o protocolo destacamos geralmente re.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos Renjie Song (Wadsworth Centro Núcleo de Citometria de Fluxo) para assistência na análise de células e Johnson Helen (Wadsworth centro animal Histopatologia Core) para a preparação de parafina. Agradecemos ao Dr. Richard A. Cole (Wadsworth Centro Núcleo de Microscopia de luz) para a assistência com microscopia confocal e coleção de imagens. Nós gostaríamos de agradecer Andy Bentley (Wadsworth Center Foto e Ilustração) para assistência com animações.
MDJ é apoiado pela Fundação de Pesquisa de Ciências da Vida, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Fellowship. SA é suportado por um Centro de Pesquisa em Saúde-Wadsworth Inc. comu....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Item | Companhia | Gato. # | Comentários (opcional) |
| Composto outubro | Tissue-Tek | 4583 | |
| 7x7x5 milímetros Moldes de Base | Fisherbrand | 22-363-552 | |
| ImmEdge Pen | Vector Labs | H-4000 | |
| Além disso Superfrost Slides | Thermo Scientific | 4951 | |
| Borda Rito Lâmina | Thermo Scientific | 4280L | |
| Anti-Mouse CD11c-PE | eBioscience | 17-0114-82 | |
| Anti-Mouse CD45R/B220-APC | BD Pharmigen | 553092 | |
| Anti-Mouse CD3-FITC | BD Pharmigen | 561798 | |
| Anti-CD4 de rato-PE | BD Pharmigen | 553652 | |
| Anti-rato CD8-PE | BD Pharmigen | 553032 | |
| Anti-Mouse CD19-PerCP | BioLegend | 115531 | |
| Solução salina equilibrada de Hank (HBSS) sem vermelho de fenol | Fisher Scientific | 14175-079 | |
| 70 filtro de células mM | BD Falcon | 352350 | |
| Médio baço dissociação | Stem Cell Technologies | 7915 | |
| Soro de cabra | Invitrogen | 16210-072 | |
| Fc Bloco | ATCC 2.4.G2 | HB-197 | SUPES obtido a partir de linha de células 2.4.G2 |
| Tesoura curva | FST | 14061-09 | |
| Criostato | Leica | 3050S | |
| FACS Calibur | BD | ||
| Condessa contador de células | Invitrogen | ||
| Hematoxilina | Richard Allan | 7211 | |
| Eosina | Richard Allan | 71304 | |
| Formalina | Starplex Scientific | 3661 | |
Tabela 1. Reagentes e equipamento utilizados neste estudo. |
Referências
- Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut. Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).
- Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lympho....
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Reimpressões e permissões
