Summary
MicroRNAs få en betydelig rolle i hjernens struktur og funksjon. Her beskriver vi en metode for å håndheve hippocampus miRNA over-uttrykk ved hjelp stereotaktisk injeksjon av en konstruert miRNA-uttrykke lentivirus. Denne tilnærmingen kan tjene som en relativt hurtig måte å vurdere
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) er små regulatoriske single-RNA-molekyler rundt 22 nukleotider lange som kan hvert mål mange mRNA transkripsjoner og dim en hel genuttrykk sti ved å fremkalle ødeleggelse og / eller hemme oversettelse av disse målene. Flere miRNAs spiller sentrale roller i å opprettholde neuronal struktur og funksjon, og i høyere nivå hjernefunksjoner, og metoder er søkt for å manipulere sine nivåer for å utforske disse funksjonene. Her presenterer vi en direkte in vivo metode for å undersøke de kognitive konsekvenser av tvangssalg mirnas overskytende hos mus ved stereotaktisk injeksjon av miRNA-koding viruspartikler. Konkret innebærer det gjeldende protokoll injeksjon i hippocampus CA1 regionen, som bidrar til pattedyr minne konsolidering, læring, og stressresponser, og tilbyr en praktisk injeksjonsstedet. Koordinatene blir målt i henhold til musen bregma og virus perfusjon kontrolleres digitalt og holdt meget langsom.Etter injeksjon, blir operasjonen såret forseglet og dyrene gjenopprette. Lentiviruses koder lyddempere av tilsvarende mRNA mål tjene til å implisere den spesifikke miRNA / target samhandling ansvarlig for den observerte effekten, med naive mus, mus injisert med saltvann og mus injisert med "tomme" lentivirus vektorer som kontroller. En måned etter injeksjon, dyrene er undersøkt i Morris Water Maze (MWM) for å vurdere deres seilas læring og minne evner. Den MWM er en rund tank fylt med vann farget med en liten plattform neddykket 1 cm under vannoverflaten. Steady visuelle signaler rundt tanken tillate romlig navigasjon (lyd og jordens magnetfelt kan også hjelpe dyrene med å navigere). Video kamera overvåkning gjør det mulig å måle ruten for svømme og tid til å finne og utgjøre plattformen. Musen er først lært at montering av skjult plattform tilbyr en flukt fra den håndheves svømming, det er da testet for å bruke denne rømning og finally er plattformen fjernes og probe tester undersøke om musen husker sin tidligere plassering. Gjentatte tester gjennom flere påfølgende dager markere forbedret ytelse av testede mus ved kortere ventetider for å finne og montere plattformen, og som flere direkteruter til nå plattform eller plasseringen. Unnlatelse av å vise en slik forbedring representerer svekket læring og hukommelse og / eller angst, som deretter kan bli testet spesifikt (for eksempel i forhøyet pluss-labyrint). Denne tilnærmingen gjør validering av spesifikke miRNAs og målet transkripsjoner i studert kognitive og / eller stress-relaterte prosesser.
Introduction
Rollen av bestemte miRNAs i nervesystemet fungerer har nylig blitt utfordret av lentiviral injeksjon i flere studier. MiRNAs har vist seg å være avgjørende for å opprettholde og re-shaping synapse struktur 1, synaptogenesis 2 og synapse ombygging og vedlikehold tre. Disse studiene tyder på at miRNAs er engasjert, via multileveled regulatoriske effekter i både utvikler seg og i å opprettholde den viktigste produksjonen av nervesystemet, kognitiv funksjon. Stereotaktisk injeksjon av lentivirus partikler inn i bestemte regioner i gnager hjernen gjør søker etter endringer i synapse morfologi og neuronal aktivitet, og ble brukt for å opprette funksjonell betydning på over-uttrykt transkripsjoner 4,5. Direkte smitte av nerveceller på veldefinerte hjernen områder med miRNA-uttrykke lentiviruses kan være innblandet i studier av aldring, hjernen lidelser og nevrodegenerasjon; Studier av miRNAs i riket av atferdsmessige regulering 6-8 er på et langt mindre avansert tilstand, og stereotaktisk injeksjon av miRNA-uttrykke lentivirus partikler etterfulgt av atferdsmessige tester kan være nyttig for slike formål. En betydelig mer arbeidskrevende metode for å indusere over-eller under-uttrykket innebærer genmodifisert knock-in eller knockout mus. Genetiske systemer kan videre tillate betinget og temporal kontroll på uttrykk (f.eks Cre-Lox, Tet-systemer), men disse neppe gi den romlige spesifisitet av injeksjon prosedyre og det er nesten alltid en viss leakiness. Også, de tekniske prosedyrene ikke kreve kirurgi og kan brukes på tvers av laboratorier med relativt god reproduksjonsevne, men de er tregere og krever mye mer arbeidskraft og økonomiske ressurser. I tillegg er den tidsmessige styring av over-eller under-ekspresjon i injiserte mus er langt mer nøyaktig enn i genetisk modifiserte mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Lentivirus Forberedelse
- Grow HEK-293ft celler til 90% samløpet.
- På dagen for transfeksjon endring celle medium til serumfritt DMEM supplementert med 1 mM glutamin og 50 mg / ml penicillin-streptomycin.
- Ko-transfektere cellene med en pLKO.1-Puro vektor og med plasmider som koder for deltaet R8.2 og VSV-G-delene og miRNA av interesse, under anvendelse av 10 ul av 1 mg / ml polyetylen-imin som en bærer 9..
- Samle pakket lentiviruses på 24 timer og 48 timer etter transfeksjon, filter gjennom 0,45 mikrometer filter.
- Konsentrer de lentiviruser ved hjelp av ultrasentrifugering i 70 000 xg i 2 timer og 15 ° C, alikvoter og oppbevar ved -70 ° C.
- Mål virustiter ved å infisere HEK-293T celler med seriefortynnet virus preparater (1 til 10 -6 ml vektor per brønn). Den resulterende titer (et minimum på 1 x 10 ~ 9 infeksiøse partikler pr ml anbefales) blir evaluert for ekspresjon av den gene av interesse, ved hjelp av puromycin utvalg og ved å tallfeste GFP uttrykke virus gjennom å telle fluorescerende celler.
For mer detaljert protokoll av lentivirus forberedelse se 10.
2. Forbereder Animals for kirurgi
- Kirurger drakt bør omfatte kirurgiske kappe, sterile hansker, lue og maske.
- Vei dyret, og deretter anesthetize det med en IP-injeksjon av Ketamin en blanding, med volumet proporsjonal med dyrets vekt som spesifisert for hvert medikament. For en Ketamin / Xylazin blanding, er et doseområde fra 80 til 200 mg / kg ketamin og 7-20 mg / kg xylazin vanligvis brukt for mus.
- Vente til dyret er helt bedøvet, så sjekk for manglende tilbaketrekning refleks i hind lem av dyret ved å utvide lem og deretter trykke på den med fingeren.
- Injisere dyret subkutant med Rimadyl, som angitt på boksen, for smertelindring. Typisk dosering for Rymadil er 5-10 mg.
- Plasser dyret på en varmepute for å holde en jevn kroppstemperatur og fukte øynene med salve.
- Barbere området mellom de to ørene med en kappsag.
- Rense huden med betadine.
3. Eksponering av Skull and Drilling
- Plasser dyret inne i stereotact ved justering av stengene inn i sprekker bare anteriort for dyrets øre.
- Bruk en skalpell til å gjøre en anterior-posterior snitt på ca 1,5 cm mellom ørene og holde den åpen med kirurgi klemmer (serfines).
- Rengjør overflaten av skallen med en bomullspinne til skjæringspunktet mellom den koronale sutur og sagittal sting, dvs. bregma og skjæringspunktet mellom koronale og bakhode sting, dvs. lambda, er synlige.
- Pek tuppen av sprøyten, holdes av stereotact, til bregma punkt, i alle tre akser. Skriv ned koordinatene. Dette punktet ville bli betraktet som null point i alle tre akser.
- Løft sprøyten i den vertikale aksen, slik at en plan bevegelse ville ikke lage riper i skallen og flytte sprøyten hodet til riktig sted. Hippocampus CA1 injeksjoner krever følgende koordinater i forhold til bregma i mm: -2 ved den fremre / bakre akse, ± 1,8 på laterale / medial akse og -1,5 i dorsal / ventral akse.
- Senk sprøytespissen til den berører hodeskallen og markere stedet med en markør. Fjern sprøyten tilbake for å unngå knivstikking.
- Bor et grunt hull, bare i skallen bein med en fin driller. Hold borer stødig slik at det ikke ville fortsette å bore inn i bløtvevet under. Du kan forhindre dette ved steadying en hånd med den andre, og ved å bore i korte pulser.
4. Injeksjon av Lentivirus
- Uttak 0,5 ml av den konsentrerte løsning lentivirus.
- Plasser sprøyten over hullet og sakte senke den vertikalt før det ReaChes overflaten av skallen. Fortsett å senke sprøyten inn i hjernen meget langsomt. På dette trinnet noen blødning kan oppstå som ikke nødvendigvis indikerer en mislykket penetrasjon. Hvis blødningen oppstår tørke det opp med en bomullspinne.
- Sett digitale pumpen til 0,02 ml / min (0.5 mL ville bli injisert i 25 min) og begynn infusjon. Langsom tilførsel tillater en effektiv spredning av viruset inn i vevet, og hindrer tilbakestrømning. I noen sprøyte typer vurdere å sette inn sprøyten for en ekstra dybde på 0,5 mm før du trekker til originale koordinater og infusjon.
- Etter at infusjonen er fullført vente på ytterligere 5 minutter for å tillate materialet å spre seg inn i hjernen i stedet til vikende tilbake inn i kanalen dannet av sprøyten.
- Fjern sprøyten veldig sakte og se for rygg renn. Hvis en tilbakestrøm-ning er observert på dette trinnet, ble en fraksjon av den injiserte materiale sannsynligvis tapt.
5. Wound Tetting og gjenoppretting
- Seal the viklet med histoacryl. Sørg for å unngå lekkasje av histoacryl inn i øynene.
- Injiser dyret intraperitonealt (IP) med 1 ml forvarmet saltvann, for å unngå uttørring.
- Plasser dyret i oppsamling bur som er plassert på en oppvarmet blokk. Se dyret mens den gjenoppretter i ytterligere en time.
I tilfelle av vekttap, appetittmangel, bør svakhet / manglende evne til å skaffe strøm eller vann, døende tilstand eller infeksjon, avliving av dyret utføres. Akseptable metoder for avliving av gnagere er barbiturater, inhalant bedøvelse, CO 2, CO, eller kaliumklorid i forbindelse med narkose.
Etter 4 til 6 uker, vurdere dyrets navigasjon minne vurderes i Morris Water Maze. Den lentivirus vil vanligvis infisere de fleste cellene inne i injiseringshodet sfære.
6. Behavioral Assessment i Morris Water Maze
- Trene dyrene i Morris Water Maze. For eksakt opplæring og testing protokoll se 11. Etter hvert forsøk, tørke dyret med et tørt håndkle, setter den tilbake i buret sitt og oppdatere vannet i tanken.
- Test dyrene i Morris Water Maze for tre sammenhengende dager, fire studier hver dag. Hver dag setter dyret inn i labyrinten i hver av de fire retningene av labyrinten (nord, sør, øst og vest) i et skiftende rekkefølge, for eksempel dag én: øst-vest-nord-sør, dag to: vest-syd -nord-øst. Tørk av dyrene etter hvert forsøk.
- Under testen forsøk spore dyret med et sporingssystem som Noldus sporingssystem.
- Etter 12 th test rettssak, sette dyret i vannbeholderen uten plattformen i ett minutt. Dette ville bli brukt til å analysere den søker strategi dyret tar.
- Analysere dataene som blir foreslått i 12..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Injeksjon på 0,5 mL lentivirus inn i CA1 regionen i mus hippocampus, med strømningshastigheten er anført i den protokoll delen gir en infisert sfære på omtrent 1 mm i rostral-kaudal akse, og om lag 0,5 mm i den mediale laterale-og fremre -posterior akser (figur 3).
Figur 1. Bregma punkt og injeksjon apparater. (A) vist en skjematisk kart over Bregma (koronale og sagittal sting krysset) og Lambda (bakhode og sagittal sting krysset) som sett etter å ha utført snittet. (B) Bilde som viser de viktigste mekaniske komponenter i stereotactic apparat.
Figur 2. Lentivirus principal komponenter. lentivirus Det omfatter komponenter som muliggjør resistens mot antibiotika (Ampiciline, Amp R), et reportergen (GFP), 5 'og 3' lange terminale repetisjoner (LTR) for effektiv integrering og ekspresjon av viruset og genet av interesse (miRNA).
Figur 3. Injeksjonsstedet og in vivo Lentivirus transfeksjon. (A) på injeksjonsstedet etter musen atlas. Injeksjon er rettet på CA1 regionen av hippocampus. (B) GFP kvantifisering i vilkårlige enheter (normalisert mål på mengden av "grønne" sett i hvert felt) langs 11 skiver, hver en 40 mikrometer tykke, i rostral-caudal aksen. (C, d, e og f). Spesifikke felt for stillingene som er merket pågraf i b. DAPI flekker i rødt og GFP i grønt. Klikk her for å se større figur .
Figur 4. Behavioral vurdering av mus i MWM. (A) Gjennomsnittlig ventetid for å finne den skjulte plattformen for mus injisert med lentivirus uttrykker en bestemt miRNA (utpekt Mir-X i figuren, røde sirkler, n = 10) og mus injisert med krafse uttrykke lentivirus (grønne trekanter, n = 10). Feil søylene representerer SEM. ANOVA P-verdi <0,05. (B) Representative baner av den siste rettssaken for de to gruppene. (C) Gjennomsnittlig avstand i 30 min i det åpne feltet for mus injisert med Mir uttrykker testet lentivirus (grønn), scramble uttrykker lentivirus (rød) og un-injiserte dyr (blå). Ingen forskjell i den globale bevegelse aktivitet ble identifisert (ANOVA P> 0,1). (D) Representative baner av mus fra hver gruppe i (c).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stereotaktisk injeksjon av en lentivirus er en relativt hurtig metode for in vivo-vurdering for både opp-eller ned-regulering av forskjellige gener og MiRNAs. Den viktigste alternativ er en genetisk utviklet mus som er et mye mer arbeidskrevende og tidkrevende teknikk deretter direkte lentivirus injeksjon. I tillegg oppregulering, i lentivirus injeksjon, skjer på et bestemt tidspunkt i voksen mus og inkluderer ikke noen mulighet for leakiness under utvikling, som er oftest slik i de genmanipulerte musene som inkluderer temporal kontroll. Fullstendig temporal kontroll er viktig ved vurdering av relevans av forskjellige gener i neurodegenerative sykdommer hvor det endrede reguleringen skjer sent i livet til dyret. I tillegg tilbyr lentivirus injeksjon presis romlig kontroll, som igjen er underlagt en viss leakiness i de genmanipulerte systemer. Musen tekniske systemer utnytte endogenous spesifisitet av forskjellige transkripsjonsfaktorer ved tilsetning av en innsats av en promoter som kan bli aktivert bare i en bestemt region eller celletype. Til sammenligning kan lentivirus injeksjoner være begrenset i rom uten å endre vektoren. Ulempene med lentivirus injeksjon er kravet til en arbeidskrevende kirurgisk prosedyre og tvilsom reproduserbarhet mellom laboratorier. Etter injeksjonen kirurgi, må en periode, mellom en uke og tre uker passere for viruset for å indusere sin virkning og for dyret å komme seg, før ytterligere protokoller kan utføres slik som adferdsmessige og biokjemiske vurderinger. For studier hvor tidspunktet for induksjon bør være i umiddelbar nærhet til de ulike vurderingene den injiserte lentivirus kan inkludere en temporal kontroll-system, slik som Cre-LOX-systemet, og antibiotika kan benyttes i et slikt tilfelle som induceren lenge etter at dyr helt restituert. Denne teknikken ble presentert i 13.. Angående Reproducibility mellom injeksjoner, har grupper som utfører denne metoden rutinemessig viste en ganske reproduserbar målretting og levering av injisert materiale mellom dyr 13. Reproduserbarhet mellom laboratorier er en sak som krever stor forsiktighet, siden ulike laboratorier bruker forskjellige sprøyter, ulike typer sprøyte kanten (sløv eller skarpe), og ulike flyt priser, som påvirker den resulterende injeksjon sfære. I begge metodene en posisjonell effekt på grunn av genomisk integrering området kan forekomme. I den transgene linje følgen ville være genet stanse i hele linjen. I lentivirus injisert populasjonen, på den annen side, ville effekten være begrenset til en liten del av befolkningen. Kombinere Mir eksperimenter sammen med shRNA eksperimenter in vivo kan kaste lys over det spesielle ved effekten av en viss Mir på sin target 6,8. Til slutt kan lentivirus injeksjon benyttes i en transgen mus knockdown for testing av et knock-in virkning i et spesifikkeic hjernen regionen og tjene for et tap av funksjon / redning av funksjon eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Denne studien har vært støttet av Edmond og Lily Safra Center for Brain Sciences (SB fellesskap), The Legacy Heritage Biomedical Science Partnership Program av Israel Science Foundation (Grant nr. 378/11, å HS) og den tyske israelske Stiftelsen for Industriell Forskning og utvikling (GIF) (Grant 1093-32.2/2010 Nei, til HS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Rodent weigh scale | Burtons (UK) | 115-455 | |
| heating pad | FIRstTechnology | DCT-25 | |
| trimming machine | Stoelting | 51465 | |
| stereotact | Stoelting | 51730 | |
| Scalpel and blades | Kent scientific | INS500348 | |
| Harland syringe | Hamilton | 7632-01 | |
| driller | Stoelting | 51449 | |
| digital pump | Harvard apparatus | 704507 | |
| Water tank and platform | Stoelting | 60135 | |
| Reagents | |||
| ketamine | Vetoquinol(Lure France) | 3055503 | |
| domitor | Orion pharma | 107140-10 | |
| Rimadyl | Pfizer animal health | 24751 | |
| moisture ointment - Synthomycine 5% | Rekah Pharmaceutical | 195 | |
| histoacryl | Braun | 112101 | |
| saline | Sigma Aldrich | D8662 | |
References
- Siegel, G., et al. A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis. Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).
- Jin, P., et al. Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway. Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).
- Simon, D. J. The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions. Cell. 133, 903-915 (2008).
- Consiglio, A. In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice. Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).
- Jakobsson, J., Lundberg, C. Lentiviral vectors for use in the central nervous system. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).
- Berson, A. Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer's disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice. EMBO Molecular Medicine. , (2012).
- Haramati, S. MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).
- Shaltiel, G., et al. Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target. Brain Structure & Function. , 10-1007 (2012).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).
- Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs & transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).
- Nunez, J. Morris Water Maze Experiment. J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).
- Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice. J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).
- Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. Genetic approach for intracerebroventricular delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).
