Implantatie van kankercellen in het orgaan van oorsprong kan dienen als een nuttige preklinisch model om nieuwe therapieën te evalueren. MB49 blaascarcinoom cellen kunnen worden gekweekt in de blaas na intravesicale instillatie. Dit protocol toont katheterisatie van de blaas muis behoeve van tumor implantatie en adenovirale levering.
Blaaskanker is de tweede meest voorkomende kanker van het urogenitale kanaal en nieuwe therapeutische benaderingen die kunnen verminderen herhaling en progressie nodig zijn. De tumormicromilieu kan significante invloed op tumorontwikkeling reactie. Het is derhalve vaak wenselijk om tumorcellen groeien in het orgaan waaruit zij afkomstig. Dit protocol beschrijft een orthotopic model van blaaskanker, waarin MB49 muizen blaascarcinoom cellen worden bijgebracht in de blaas via katheterisatie. Succesvolle tumorcel implantatie bij dit model moet verstoring van de glycosaminoglycaan beschermende laag, die kan worden bereikt door fysische of chemische middelen. In ons protocol de blaas wordt behandeld met trypsine vóór cel instillatie. Catheterisatie van de blaas kan ook gebruikt worden om geneesmiddelen te leveren zodra de tumoren vastgesteld. Dit protocol beschrijft de afgifte van een adenovirale construct dat een luciferase reportergen tot expressie. Terwijl our protocol is geoptimaliseerd voor de korte-termijn studies en richt zich op gentherapie, de methodologie van muis blaaskatheterisatie heeft brede toepassingen.
Blaaskanker is de tweede meest voorkomende kanker van het urogenitale kanaal met bijna 75.000 nieuwe gevallen en 15.000 sterfgevallen verwacht in 2012 1. Hoge tarieven van herhaling vereisen levenslange follow-up, die blaaskanker een van de duurste vormen van kanker te behandelen maakt. Blaaskanker dat de spierlaag is binnengedrongen kan uitzaaien naar de lever, de longen of het bot via het lymfestelsel. Multimodale behandeling van gevorderde tumoren resulteert in slechts 20-40% overleving na 5 jaar. Daarom zijn effectieve behandeling strategieën die gericht zijn op het verminderen van de herhaling en de progressie van oppervlakkige blaaskanker evenals het verbeteren van de therapeutische resultaten bij patiënten met gevorderde ziekte dringend nodig.
Ontwikkeling van nieuwe therapieën nodig preklinische modellen om de werkzaamheid na de eerste in vitro evaluatie evalueren. De tumormicromilieu kan aanzienlijk invloed op de ontwikkeling en het reactievermogen van kanker, die de noodzaak voor preclinic hoogtepuntenal modellen waarin tumoren ontstaan of kan in het orgaan van oorsprong worden vastgesteld. Een benadering is de ontwikkeling van transgene modellen waarin tumoren spontaan ontstaan of kunnen worden geïnduceerd in een orgaan-specifieke wijze. Een uitstekende protocol van een transgeen blaaskanker model is onlangs gepubliceerd 2. Het nadeel van transgene modellen is dat tumoren vaak langzaam en met minder uniformiteit dan gewenst ontwikkelen. Bovendien onderhoudskosten voor een kolonie te worden beschouwd. Een alternatief voor transgene modellen orthotope implantatie van tumorcellen, die het voordeel van korte termijnen voor tumor vestiging in commercieel verkrijgbare muizen heeft. Terwijl sommige menselijke blaaskanker cellijnen orthotopically kan worden gekweekt (wij hebben met succes gebruikt UM-UC-3), kan het wenselijk zijn om tumoren te vestigen in immunocompetente muizen zijn. Twee muizen blaaskanker cellijnen die orthotopically groeien zijn MBT-2 en MB49 3. Omdat MBT-2 cellen worden besmet met het replicerentype C retrovirus 4, hebben we gekozen MB49 cellen voor onze studies. Het is belangrijk op te merken dat MB49 cellen werden geïsoleerd uit een mannelijke muis en orthotope implantaties zijn anatomische redenen uitgevoerd bij vrouwelijke muizen. Dit heeft het voordeel van gemakkelijke identificatie van de geïmplanteerde cellen met markers van het Y-chromosoom, maar het geslacht mismatch kan een nadeel voor immunologische studies.
De blaas epitheel wordt omzoomd door een glycosaminoglycaan (GAG) laag, die fungeert als een barrière voor infectie door micro-organismen. Deze barrière kan ook interfereren met de implantatie van tumorcellen en verscheidene methoden ontwikkeld om dit probleem (tabel 1) te overwinnen. Elektrocauterisatie is uitgebreid gebruikt als fysieke middelen voor de GAG-laag 5-13 en een protocol demonstreren elektrocauterisatie is onlangs gepubliceerd in Jupiter 14 verstoren. Echter moet een elektrocauterisatie apparaat niet beschikbaar, chemische middelen aan de G vernietigenAG laag, zoals zilvernitraat of poly-L-lysine kan ook 15-24. Tumoren effectief vastgesteld door een korte blootstelling van de blaas een kleine hoeveelheid zilvernitraat (5-10 pl, 0,15-1,0 M, ~ 10 seconden) of langer contact met poly-L-lysine (100 pl 0,1 mg / ml gedurende 20 min) (tabel 1). Hier beschrijven we een werkwijze die trypsine gebruikt geïmplanteerd MB49 cellen vergemakkelijken.
In een poging om therapeutische toepassingen voor blaaskanker verbeteren heeft gentherapie veel aandacht vergaard. Vanuit een klinisch standpunt, blaaskanker is een ideaal doel voor gentherapie vanwege gemakkelijke toegankelijkheid van het orgaan en zich lokaal leveren van de lading. Virale vectoren die zijn onderzocht voor blaaskanker gentherapie omvatten een oncolytische herpes simplex virus 25, retrovirus 26, kanariepokkenvirus 27, vaccinia virus, AAV, en adenovirus 28. In het tweede deel van ons protocol beschrijven we een werkwijze voor virale aflevering die vrijwel identiek is aan instillatie van de tumorcellen. Van belang in ons lab is de ontwikkeling van nieuwe benaderingen om genaflevering, die wij beoordelen via bioluminescentie met een adenovirale vector die een luciferase transgen uitdrukt. Echter, de methode van blaaskatheterisatie worden gebruikt voor levering van verschillende agentia en daarom heeft brede toepasbaarheid.
De in dit protocol beschreven primaire methode is catheterisatie van de muis blazen, die brede toepassingen voor het inbrengen van cellen of een agent die bestemd zijn voor de lokale levering aan de blaas epitheel heeft. De specifiek protocol hierboven beschreven is geoptimaliseerd voor de korte-termijn studies (~ 10 dagen). Implantatie van de juiste aantal cellen is cruciaal, aangezien een groter aantal cellen resulteert in een snellere tumorgroei en mogelijk verlies van dieren door grote tumorlast. Met 200.000 MB49 ce…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door NIH R21 CA143505 om Christina Voelkel-Johnson.
Name of reagent |
Company |
Catalog number |
Comments |
6-8 week old female mice |
Jackson Laboratories |
Strain Name: C57BL/6J Stock Number: 000664 |
|
Trypsin* |
MediaTech |
MT25-053-CI |
Obtained through Fisher |
DMEM* |
MediaTech |
MT10-017-CV |
Obtained through Fisher |
FBS |
Hyclone |
SH30071.03 |
Heat-inactivated |
T25 flasks* |
Corning Costar |
Corning No.:3056 Fisher: 07-200-63 |
Obtained through Fisher |
MB49 cells |
N/A |
N/A |
Obtained from Dr. Boehle (see reference11) |
Puralube Vet Ointment* |
Pharmaderm |
Henry Schein Company No.:036090-6050059 Fisher: NC9676869 |
Obtained through Fisher |
Depilatory cream: Veet |
local pharmacy |
||
Lubricant: K-Y Jelly |
local pharmacy |
||
Catheters* |
Exel International |
Exel International No.:26751; Fisher: 14-841-21 |
Obtained through Fisher |
Isoflurane |
Terrell |
NDC 66794-011-25 |
Obtained though hospital pharmacy |
1 ml slip tip TB syringes |
Becton Dickinson |
BD309659 Fisher:14-823-434 |
|
D-Luciferin |
Gold Biotechnologies |
L-123-1 |
|
Ad-CMV-Luc |
VectorBiolabs |
1000; Request large scale amplification and CsCl purification for in vivo use |
Infectious agent that requires BSL2 containment |
Steady-Glo Luciferase Assay System |
Promega |
E2510 (10 ml), E2520 (100 ml), or E2550 (10 x 100 ml) |
*available through multiple vendors
EQUIPMENT
Material name |
Company |
Catalog number |
Comments |
Anesthesia system |
E-Z Systems, Euthanex Corporation |
Anesthesia system: EZ7000 5-port mouse rebreathing device: EZ109 |
Obtained through Fisher |
Xenogen IVIS 200 |
Caliper Life Sciences |
http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm |
|
FLUOstar Optima |
BMG Labtech |
http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2 |