Summary
Chromosomen kunnen worden geïsoleerd uit levende cellen zoals lymfocyten of huidfibroblasten en organismen, met inbegrip van mensen of muizen. Deze chromosoom preparaten kunnen verder worden gebruikt voor routinematige G-banding en moleculaire cytogenetische procedures zoals fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), vergelijkende genomische hybridisatie (CGH) en spectrale karyotypering (SKY).
Abstract
Chromosoom (cytogenetische) analyse wordt veel gebruikt voor de detectie van chromosomale instabiliteit. Als gevolgd door G-banding en moleculaire technieken zoals fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), deze test is de krachtige mogelijkheid om individuele cellen te analyseren voor aberraties die winsten of verliezen van delen van het genoom en herschikkingen waarbij een of meer chromosomen betreffen. Bij de mens, chromosoomafwijkingen treden bij ongeveer 1 per 160 levendgeborenen 1,2, 60-80% van alle miskramen 3,4, 10% van de doodgeborenen 2,5, 13% van de personen met een aangeboren hartaandoening 6, 3-6% van onvruchtbaarheid gevallen 2, en bij veel patiënten met vertraging in de ontwikkeling en geboorteafwijkingen 7. Cytogenetische analyse van maligniteit routinematig gebruikt door onderzoekers en clinici, zoals observaties van klonale chromosomale afwijkingen is aangetoond dat zowel diagnostische en prognostische betekenis 8,9 hebben.60; Chromosoom isolatie is van onschatbare waarde voor gentherapie en stamcelonderzoek van organismen, waaronder niet-humane primaten en knaagdieren 10-13.
Chromosomen kunnen worden geïsoleerd uit cellen van levende weefsels, zoals bloed lymfocyten, huidfibroblasten, amniocyten, placenta, beenmerg en tumormonsters. Chromosomen worden geanalyseerd op het metafase van de mitose, wanneer ze het meest gecondenseerd en daardoor beter zichtbaar. De eerste stap van het chromosoom isolatietechniek omvat de verstoring van de spindel vezels door incubatie met Colcemid, te voorkomen dat de cellen te gaan tot de volgende anafase stadium. De cellen worden vervolgens behandeld met een hypotone oplossing en bewaard in de gezwollen toestand met Carnoy fixeermiddel. De cellen worden vervolgens gedropt op slides en kan dan worden gebruikt voor een verscheidenheid aan procedures. G-banding gaat trypsine behandeling, gevolgd door kleuring met Giemsa om karakteristieke lichte en donkere banden te creëren. Dezelfde procedure chromosomen isoleren kan worden gebruikt voor de bereiding van cellen voor procedures zoals fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), vergelijkende genomische hybridisatie (CGH) en spectrale karyotypering (SKY) 14,15.
Introduction
Chromosoom analyse is een conventionele techniek wereldwijd gebruikt om chromosomale instabiliteit en herschikkingen leiden tot genetische aandoeningen en maligniteit 1,2,8,9 diagnosticeren. Bovendien kan een hogere resolutie voor de diagnose en het onderzoek van constitutionele en kanker verworven genetische afwijkingen worden bereikt met de combinatie van de klassieke cytogenetische procedures en moleculaire cytogenetische methodes zoals fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), vergelijkende genomische hybridisatie (CGH) , en spectrale karyotypering (SKY) 14,15. Recenter zijn deze technieken zijn gebruikt voor het evalueren van chromosomale instabiliteit geassocieerd met stamcellen. Karyotypic afwijkingen zoals aneuploïdie langdurig gekweekte embryonale cellen (ES) en volwassen stamcellen van verschillende organismen zijn gerapporteerd door verschillende laboratoria. Recent bewijs ondersteunt dat sommige cellijnen zijn inherent meer geneigd om chromosoom instabiliteit ongeacht kweekomstandigheden. Om deze reden, bij het opzetten en / of onderhouden van mens, muis, of Rhesus stamcellijnen, wordt chromosoomanalyse aanbevolen als onderdeel van de kwaliteitscontrole. Veel rapporten beschrijven de toenemende belangstelling voor het gebruik van routine en moleculaire cytogenetica de chromosomale stabiliteit van stamcellen en kwaadaardige cellen of verschillende organismen in cultuur 10-13 volgen. Deze protocollen worden steeds vaker gebruikt door niet-genetische laboratoria voor snelle chromosomale beoordeling van hun gekweekte cellen 13. We presenteren onze basisprocedures voor chromosoom bereiding van verschillende celtypes, die kan worden toegepast zowel klinisch als onderzoeksdoeleinden en cellen afkomstig van verschillende organismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Chromosoom oogsten van hechtende cellen
- Standaard Protocol
- Kweek cellen volgens bepaalde cel kweekomstandigheden. Wanneer de cellen logaritmische fase (80% confluentie) bereikt, voeg 10 ul / ml Colcemid de celkweek kolf. Een minimum van 2 x 10 6 cellen wordt aanbevolen.
- Incubeer cellen bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator gedurende 45 minuten. Met behulp van een steriele pipet media uit cellen in een 15 ml conische buis. Zet opzij.
- Voorzichtig wassen van de cellen door toevoeging van 2 ml HBSS buffer in de kolf. Swirl buffer en vervolgens verwijderen met behulp van een pipet. Gooi.
- Voeg 1 ml trypsine, zodat zij het gehele oppervlak van de kolf omvat. Alleen laat de cellen in trypsine gedurende ongeveer 2 minuten. Als de meerderheid van de cellen losgemaakt, pipet de media in de conische buis weer op de cellen.
- Breng de celsuspensie in 10 ml porties in 15 ml conische buizen.Centrifugeer bij 200 xg gedurende 10 minuten. Verwijder supernatant en resuspendeer de pellet.
- Voeg 10 ml 0,075 M KCl die is voorverwarmd tot 37 ° C om de resterende pellet in de conische buis. Vortex buis op de middelste stand te mengen KCl en cellen.
- Incubeer cellen bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 25 ° C. Verwijder de bovenstaande vloeistof (tot ongeveer 0,5 ml resten) en resuspendeer pellet.
- Voeg voorzichtig 5 ml verse Carnoy's fixatief (3:1 verhouding methanol: ijsazijn) om de cellen tijdens vortexen. Voeg vervolgens 5 ml meer fixeermiddel zonder te vortexen in totaal 10 ml.
- Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant en resuspendeer cellen. Voeg 5 ml fixeermiddel aan elke buis.
- Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant en resuspendeer cellen. Voeg 5 ml fixeermiddel aan elke buis. De cellen kunnen dan op 4 ° C worden bewaard gedurende maximaal een jaar.
- Wijziging van Protocol: Chromosome harvesting lymfoblastoïde cellijnen
- Kweek cellen volgens bepaalde cel kweekomstandigheden. (Gebruik de juiste kolf voor de hoeveelheid cellen wordt gekweekt). Wanneer de cellen logaritmische fase (ongeveer 2 dagen na cellen splitsing) bereikt, voeg 10 ul / ml Colcemid de celkweek kolf.
- Wijziging van Protocol: Chromosome oogsten uit volbloed
Fytohemagglutinine (PHA), een lectine afkomstig van de rode bonen, is een krachtig mitogeen voor humane T-cellen 16. 72 uur na de toevoeging van PHA aan de cultuur, ongeveer 45% van de cellen in de S-fase. Dit vertegenwoordigt de piek mitotische activiteit en het optimale moment om oogsten voor chromosoom studies. Andere mitogenen zoals karmozijnbes (1-10 ug / ml) kan worden gebruikt bij de analyse van B-cellen 17,18.- Vang minimaal 1 ml volbloed in een groene bovenkant natriumheparine buis. Binnen 3 dagen na de inzameling. Store bloed bij RT until klaar voor gebruik.
- Aliquot 0,25 ml bloed in 10 ml compleet RPMI medium met L-glutamine (20% foetaal runderserum, 1% penicilline / streptomycine, 1% fungizone, en 1% PHA). Kweken bij 37 ° C met 5% CO2.
- Wijziging van Protocol: Chromosome oogsten uit beenmerg
Cytogenetische analyse van beenmerg is nuttig in vele kwaadaardige hematologische aandoeningen zoals de waarneming van een chromosomaal abnormale kloon diagnostisch is voor een specifiek type van leukemie. Chromosoom studies worden ook gebruikt om ziekteprogressie, zoals het begin van blast crisis en respons op behandeling te beoordelen. Aangezien beenmergcellen actief delende, niet mitogeen stimulatie nodig 9,19. Voor acute leukemie zijn ook 24 en 48 uur culturen opgezet.- Vang minimaal 1 ml beenmerg in een groene bovenkant natriumheparine buis. Aliquot 0,25 ml beenmerg in 10 ml compleet RPMI medium met L-glutamine (20% foetaal runderserum, 1% penicilline / streptomycine, 1% fungizone). Kweken bij 37 ° C met 5% CO2.
2. Slide Voorbereiding en Solid kleuring
Een snelle evaluatie van een vertegenwoordiger dia zal informatie over de kwaliteit van de oogst te verstrekken voordat u verder om verdere procedures, zoals G-banding, FISH, CGH, of SKY. Sommige laboratoria de voorkeur aan vaste vlek de cellen voor een snelle oogst en chromosoom assessment. Alternatief kan een fase contrast microscoop gebruikt voor deze analyse. Dia's zijn het best voorbereid wanneer de luchtvochtigheid is ongeveer 50% en de omgevingstemperatuur (20-25 ° C).
- Centrifugeer de cellen bij 200 g gedurende 5 minuten bij 25 ° C. Verwijder de bovenstaande vloeistof tot er slechts 0,3-0,5 ml overblijft.
- Na voorzichtig resuspenderen van de pellet, pipet drie druppels celsuspensie op een afstand van ongeveer 2 in op een slede die is gekanteld onder een hoek van ongeveer 45 ° en laat de suspensiete rollen over de glijbaan. Voeg een grote daling van verse Carnoy's Fixative aan de dia.
- Droog de achterkant van de schuif op een papieren handdoek en dan zitten de schuif om te drogen gedurende minstens 10 minuten. De dia moet volledig droog zijn.
- Bereid verse Giemsa Kleuroplossing (3:1 verhouding van Gurr Buffer en Giemsa Stain). Plaats de dia's op een kleuring rek. Bedek de hele dia in de Giemsa kleuring oplossing. Laat de dia's blijven in de kleuroplossing gedurende 5 minuten. Spoel dia's met gedestilleerd water, laat, en laat aan de lucht drogen.
- 4 druppels Permount en een dekglas aan de dia. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen onder het dekglaasje. De overmaat Permount kunnen worden verwijderd met een papieren handdoek.
- Analyseer cellen met een lichtmicroscoop onder 10X en 100X vergroting. Als de cellen in de metafase zijn er in overvloed en goed gespreid, kunnen de overige dia's worden gebruikt voor andere experimentele procedures.
3. G-Banding Met behulp van trypsine en Giemsa (GTG)
<p> Trypsine is een proteolytisch enzym dat euchromatic histonen in gebieden van DNA denatureert hogere transcriptionele activiteit verkregen. Na Giemsa kleuring, zullen deze regio's zo licht bands. Zeer gecondenseerd chromatine met weinig of geen transcriptionele activiteit (heterochromatine) een groot deel van de histonen beschermd tegen trypsine en zal dus vlekken donker na Giemsa kleuring. Het is essentieel om aanvankelijk G-band een dia aan de voorwaarden te monitoren en de trypsine timing eventueel voor de volgende dia.- Voeg de volgende oplossingen 4 Coplin potten.
Jar # 1 = 30 ml 1 x HBSS en 4 ml 10X trypsine (0,5%)
Pot # 2 = 50 ml 1x HBSS
Jar # 3 = 45 ml 1 x HBSS en 5 ml foetaal runderserum
Pot # 4 = 50 ml 1x HBSS - Dompel elke dia in Jar # 1 voor 5 sec, snelle spoelen in Jar # 2, laat elke dia in Jar # 3 minstens 30 sec, snelle spoelen in Jar # 4 laat vervolgens dia's te drogen.
- Bereid fresh Giemsa Kleuroplossing (3:1 verhouding van Gurr Buffer en Giemsa Stain). Plaats de dia's op een kleuring rek. Bedek de hele dia in de Giemsa kleuring oplossing. Laat de dia's blijven in de kleuroplossing gedurende 5 minuten.
- Spoel dia's in gedestilleerd water in dezelfde volgorde waarin ze werden gekleurd. Laat de dia drogen gedurende ongeveer 10 minuten. De dia moet volledig droog zijn.
- 4 druppels Permount en een dekglas aan de dia. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen onder het dekglaasje. De overmaat Permount kunnen worden verwijderd met een papieren handdoek.
- Analyseer cellen met een lichtmicroscoop onder 10X en 100X vergroting. Pas trypsine timing van de rest van de dia gebaseerd op de resultaten van de eerste dia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hoge kwaliteit metafase spreads zijn essentieel voor chromosoomonderzoek. Een succesvolle test levert chromosomen die goed verspreid en van geschikte chromosoom morfologie. Goed G-gestreepte chromosomen bevatten de karakteristieke lichte en donkere strepen patronen.
Figuur 1. Een succesvolle chromosomale spreiding waarin de chromosomen van gemiddelde lengte, goed verspreid en gemakkelijk te onderscheiden van elkaar, en voldoende contrast tussen lichte en donkere banden. Geschikt chromosoom morfologie maakt de identificatie van individuele chromosomen en evaluatie voor herschikkingen indicatieve van chromosoom instabiliteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij hebben de onderhavige procedure chromosoom isolatie van cellen van diverse organismen, waaronder verschillende soorten cellen verkregen uit menselijke, Rhesus makaken, ratten en muizen 11,20-22 gebruikt. Het standaardprotocol is voorzien, maar een aantal belangrijke stappen en variabelen moeten worden aangepast voor deze verschillende soorten cellen. Een aantal specifieke stappen zijn cruciaal in zowel de chromosomale voorbereiding en G-banding om de best mogelijke kwaliteit van de resultaten te garanderen. Een van de variabelen die de test kan beïnvloeden is het Colcemid incubatietijd. Onvoldoende tijd in Colcemid levert minder metafase spreads en langer, overlapt chromosomen. Langere incubatietijden in Colcemid leidt tot kortere en dikkere chromosomen die moeilijk te analyseren zijn. Een andere belangrijke variabele is de molariteit van de hypotone oplossing. Een 0,075 M kaliumchloride zullen de cellen net genoeg om een goede verspreiding chromosoom, zonder lyseren van de cellen verkregen zwellen. Tijdens het toevoegende Carnoy's Fixatief moet het eerste 5 ml toegevoegd aan de pellet onder mengen. Dit garandeert dat alle extra eiwitten worden verwijderd alvorens de monsters of het voorbereiden dia. Indien in het geval dat de cellen niet voldoende worden gemengd, wordt een gele eiwit dop gevormd bovenop de pellet, die complicaties kan veroorzaken tijdens latere procedures.
Een goede voorbereiding slide is essentieel. Terwijl het schrappen van de geresuspendeerde cel pellet op dia's, zorg ervoor dat de dia wordt gekanteld tot ongeveer 45 ° hoek en er is voldoende afstand (minstens 2 inch) van de druppelaar aan de dia, zodat de chromosomen goed kan verspreiden in de dia voor analyse . Overstromingen van de dia met fixeermiddel onmiddellijk na het schrappen van de cellen op de dia zal ook chromosomen helpen te verspreiden. Temperatuur en vochtigheid, die invloed hebben op hoe snel de celsuspensie droogt op de dia, zijn andere factoren die chromosoom verspreiding beïnvloeden. Deze kunnen bestuurd door het bereiden slides in een omgeving met ongeveer 50% vochtigheid en een temperatuur van ongeveer 20-25 ° C, en / of door het plaatsen van dia's op een dia warmere sneller drogen. Voor G-Banding, de belangrijkste factor die de kwaliteit van de chromosomen beïnvloedt is de belichting trypsine tijd. Met een langere trypsine blootstelling kan chromosomen lijken verspreid en gezwollen. Omgekeerd zal een onvoldoende korte trypsine incubatie chromosomen opleveren met onderscheiden bands en weinig contrast. De trypsine incubatie timing is onder voorbehoud, afhankelijk van elke specifieke cellijn en oogstomstandigheden. Daarom moet een vertegenwoordiger van G-gestreepte dia eerst bereid zijn om de trypsine te evalueren voordat het kleuren van de rest van de dia's. Foetaal runderserum wordt gebruikt om de trypsine activiteit voorafgaand aan kleuring inactiveren. Wij bieden het protocol met Giemsa (GTG), maar vlek Wright worden gebruikt in plaats van Giemsa voor GTW verbinden en levert vergelijkbare resultaten.
t "> Deze procedure is relatief goedkoop en effectief uit te voeren. G-banding kan worden gebruikt om chromosoom afwijkingen zoals translocaties, deleties en aneuploïdie die gewoonlijk worden waargenomen bij maligniteiten, genetische aandoeningen te diagnosticeren, en stamcellen gekweekt in vitro 10,11 13. Dit geeft de onontbeerlijke visualisatie van de chromosoomsamenstelling en de globale evaluatie van het gehele genoom in meerdere cellen. Het wordt vaak gebruikt in klinische en onderzoekslaboratoria wereldwijd voor de diagnose, prognose en therapeutische evaluatie van kankercellen 10. Prenatale en postnatale weefselmonsters worden routinematig gecontroleerd op de identificatie van numerieke en structurele afwijkingen welke genetische afwijkingen zoals Down syndroom veroorzaken. Stamcellen kunnen snel worden geëvalueerd op de aanwezigheid van chromosomale instabiliteit. De oplossing van G-banding beperkt voor de identificatie van cnv of complexe chromosoomafwijkingen zoals te zien in metasTatic maligniteiten.Daarom, als routinematige chromosoom G-banding is aangevuld met procedures zoals fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), vergelijkende genomische hybridisatie (CGH) en spectrale karyotypering (SKY) op ontdekking van chromosomale afwijkingen drastisch 23 verhoogd. Daarom wordt het gebruik van dit protocol in combinatie met deze andere moleculaire cytogenetische procedures toenemende mate gebruikt door verschillende laboratoria voor de evaluatie van chromosomale instabiliteit in zowel klinische en onderzoek instellen 13-15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Werk in dit manuscript beschreven werd mogelijk gemaakt door financiële steun van de Patrick F. Taylor Stichting.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KaryoMAX Colcemid | Gibco | 15212-012 | |
| HBSS Buffer | Gibco | 24020-117 | |
| 0.5% Trypsin EDTA 10x | Gibco | 15400-054 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Buffer Tablets "GURR" | Gibco | 10580-013 | |
| Geimsa Stain | Ricca Chemical Company | 3250-16 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | ||
| Methanol | Caledon Laboratory Chemicals | 6700130 | |
| Glacial Acetic Acid | Krackeler Scientific Inc. | 11-9508-05 |
References
- Driscoll, D., Gross, S. Prenatal screening for aneuploidy. New Engl. J. Med. 360, 2556-2562 (2009).
- Nussbuam, R., et al. Genetics in Medicine: 7th Edition. , Saunders/Elsevier. Philadelphia. 76 (2007).
- Ljunger, E., et al. Chromosomal abnormalities in first-trimester miscarriages. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 84 (11), 1103-1107 (2005).
- Kwinecka-Dmitri, B., et al. Frequency of chromosomal aberrations in material from abortions. Ginecol. Pol. 81 (12), 896-901 (2010).
- Reddy, U., et al. Stillbirth classification—Developing an international consensus for research: Executive summary of a national institute of child health and human development workshop. Obstet. Gynecol. 114 (4), 901-914 (2009).
- Pierpoint, M., et al. Genetic basis for congenital heart defects: Current knowledge. Circulation. 115 (23), 3015 (2007).
- Kaneshiro, N., Zieve, D. Down Syndrome: Trisomy 21. PubMed Health. , (2010).
- Cin, P. D. Current Protocols in Human Genetics. , (2003).
- Wang, N. Methodologies in cancer cytogenetics and molecular cytogenetics. Am. J. Med. Genet. 115 (3), 118-124 (2002).
- Miura, M., et al. Accumulated Chromosomal Instability in Murine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Leads to Malignant Transformation. Stem Cells. 24 (4), 1095-1103 (2006).
- Izadpanah, R., et al. Long-term In vitro Expansion Alters the Biology of Adult Mesenchymal Stem Cells. Cancer Res. 68 (11), 4229-4238 (2008).
- Dekel-Naftali, M., et al. Screening of human pluripotent stem cells using CGH and FISH reveals low-grade mosaic aneuploidy and a recurrent amplification of chromosome 1q. Eur. J. Hum. Genet. 20 (12), 1248-1255 (2012).
- Moralli, D., Yusuf, M., Mandegar, M., Khoja, S., Monaco, Z. L., Volpi, E. An Improved Technique for Chromosomal Analysis of Human ES and iPS Cells. Stem Cell Rev. Rep. 7 (2), 471-477 (2011).
- Bayani, J., Squire, J. Traditional banding of chromosomes for cytogenetic analysis. Curr. Protoc. Cell Biol. 22, (2004).
- Speicher, M. R., Carter, N. P. The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology. Nat. Rev. Genet. 6 (10), 782-792 (2005).
- Benn, P., Delach, J. Human Lymphocyte Culture and Chromosome Analysis. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Muul, L. M., Heine, G., Silvin, C., James, S. P., Candotti, F., Radbruch, A., Worm, M. Measurement of Proliferative Responses of Cultured Lymphocytes, Curr. Protoc. Immunol. , (2011).
- Barch, M. J., Knutsen, T., Spurbeck, J. The Association of Genetic Technologists Cytogenetics Laboratory Manual. San Francisco: 3rd edition. , ACT. Houston, TX. (1997).
- Dewald, G. W., Ketterling, R. P., Wyatt, W. A., Stupca, P. J. Cytogenetic studies in neoplastic hematologic disorders. In Clinical Laboratory Medicine, 2nd edition. McClatchey, K. D. , Williams & Wilkens. Baltimore. 658-685 (2002).
- Kibe, R., et al. IL-7Rα deficiency in p53(null) mice exacerbates thymocyte telomere erosion and lymphomagenesis. Cell Death Different. 19 (7), 1139-1151 (2012).
- Tsien, F., Morava, E., Talarski, A., Marble, M. Phenotypic features of a boy with trisomy of 16q22-->qter due to paternal Y; 16 translocation. Clin. Dysmorphol. 4 (4), 177-181 (2005).
- Tsien, F., et al. Prolonged culture of normal chorionic villus cells yields ICF syndrome-like chromatin decondensation and rearrangements. Cytogenet. Genome Res. 8 (1), 13-21 (2002).
- McGrattan, P., Campbell, S., Cuthbert, R., Jones, F., McMullin, M., Humphreys, M. Integration of conventional cytogenetics (G-banding), comparative genomic hybridization (CGH) and interphase fluorescence in situ hybridization (i-FISH) for the detection of genomic rearrangements in acute leukemia. J. Clin. Pathol. 61 (8), 903-908 (2008).
