Summary
Kromosomer kan isoleras från levande celler, såsom lymfocyter eller fibroblaster från hud, och från organismer, inklusive människor eller möss. Dessa kromosompreparat kan utnyttjas ytterligare för rutin G-bandning och molekylära cytogenetiska förfaranden såsom fluorescens in situ hybridisering (FISH), jämförande genomisk hybridisering (CGH), och spektral karyotypning (SKY).
Abstract
Kromosom (cytogenetisk) analys används i stor utsträckning för att upptäcka kromosom instabilitet. När följt av G-bandning och molekylära tekniker såsom fluorescens in situ hybridisering (FISH), har denna analys den kraftfulla förmåga att analysera enskilda celler för avvikelser som innebär vinster eller förluster av delar av genomet och omdisponeringar som omfattar en eller flera kromosomer. Hos människor, kromosomavvikelser förekommer hos cirka 1 per 160 levande födda 1,2, 60-80% av alla missfall 3,4, 10% av dödfödda 2,5, 13% av individer med medfödd hjärtsjukdom 6, 3-6% av infertilitet fall 2, och i många patienter med utvecklingsförsening och fosterskador 7. Cytogenetisk analys av malignitet rutin används av forskare och kliniker, som observationer av klonala kromosomavvikelser har visat sig ha både diagnostiska och prognostiska betydelsen 8,9.60; Kromosom isolering är ovärderlig för genterapi och stamcellsforskning av organismer, inklusive icke-mänskliga primater och gnagare 10-13.
Kromosomer kan isoleras från celler av levande vävnader, inkluderande blodlymfocyter, hudfibroblaster, amniocyter, placenta, benmärg, och tumörprover. Kromosomer analyseras vid metafasstadiet vid mitos, när de mest kondenseras och därför är mer tydligt. Det första steget av kromosomen isoleringsteknik innebär avbrott i de spindelfibrer genom inkubation med Colcemid, för att förhindra cellerna från att fortsätta till den efterföljande anafas skede. Cellerna behandlades därefter med en hypoton lösning och bevaras i deras svällt tillstånd med Carnoys fixativ. Cellerna sedan släppas mot bilderna och kan sedan användas för en mängd olika förfaranden. G-banding innebär trypsin behandling följt av färgning med Giemsa att skapa karakteristiska ljusa och mörka band. Samma procedure att isolera kromosomer kan användas för framställning av celler för förfaranden såsom fluorescens in situ hybridisering (FISH), jämförande genomisk hybridisering (CGH), och spektral karyotypning (SKY) 14,15.
Introduction
Kromosomanalys är en vanlig teknik som används över hela världen för att diagnostisera kromosom instabilitet och omorganiseringar som leder till genetiska sjukdomar och malignitet 1,2,8,9. Dessutom kan en högre upplösning för diagnos och forskning av konstitutionella och cancer-förvärvade genetiska avvikelser uppnås med kombinationen av de klassiska cytogenetiska förfaranden och molekylära cytogenetiska metoder, t.ex. fluorescens in situ hybridisering (FISH), jämförande genomisk hybridisering (CGH) , och spektral karyotypning (SKY) 14,15. På senare tid har dessa tekniker använts för utvärdering av kromosom instabilitet i samband med stamcellsforskning. Karyotypic störningar såsom aneuploidy långsiktiga odlade embryonala celler (ES) och vuxna stamceller av olika organismer har rapporterats av flera laboratorier. Nya bevis stöder att vissa cellinjer är till sin natur mer benägna att kromosom instabiLity oavsett odlingsbetingelser. Därför, när du upprättar och / eller underhålla människa, mus, eller Rhesus stamcellslinjer, är kromosomanalys rekommenderas som en del av kvalitetskontrollen. Många rapporter beskriver det ökande intresse för användning av rutinmässiga och molekylär cytogenetik att övervaka kromosomala stabilitet stamceller och maligna celler eller olika organismer i kultur 10-13. Dessa protokoll används alltmer av nongenetic laboratorier för snabb kromosom bedömning av odlade celler 13. Vi presenterar våra grundläggande rutiner för kromosom preparat från olika celltyper, som kan tillämpas för både kliniska och forskningsändamål och celler från olika organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kromosom Skörd vidhäftande celler
- Standardprotokollet
- Odla celler enligt specifika cellodlingsbetingelser. När cellerna har nått logaritmisk fas (80% konfluens), tillsätt 10 | il / ml av Colcemid till cellodlingskolv. Ett minimum av 2 x 10 6 celler rekommenderas.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C i en 5% CO2-inkubator under 45 min. Med hjälp av en steril pipett överföra media från celler i en 15 ml koniska rör. Ställ åt sidan.
- Tvätta försiktigt cellerna genom att tillsätta 2 ml HBSS-buffert in i kolven. Swirl buffert och ta bort med hjälp av en pipett. Släng.
- Tillsätt 1 ml trypsin, se till att den täcker hela ytan på kolven. Endast lämna cellerna i trypsin under ca 2 min. När huvuddelen av cellerna har en sida, pipettera media i det koniska röret tillbaka till cellerna.
- Överför cellsuspensionen i 10 ml-portioner i 15 ml koniska rör.Centrifugera vid 200 x g under 10 min. Avlägsna supernatanten och suspendera pelleten.
- Tillsätt 10 ml 0,075 M KCl som har förvärmts till 37 ° C och den återstående pelleten i det koniska röret. Vortex rör vid medelhastighet för att blanda KCl och celler.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C under 10 min. Centrifugera vid 200 xg under 5 min vid 25 ° C. Avlägsna supernatanten (fram till ca 0,5 ml återstår) och suspendera pelleten.
- Tillsätt försiktigt 5 ml färsk Carnoys fixativ (03:01-förhållande av metanol: isättika) till cellerna under virvling. Tillsätt sedan 5 ml mer fixativ utan vortexa för totalt 10 ml.
- Centrifugera vid 200 x g under 5 min. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna. Tillsätt 5 ml fixativ till varje rör.
- Centrifugera vid 200 x g under 5 min. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna. Tillsätt 5 ml fixativ till varje rör. Cellerna kan nu lagras i 4 ° C i upp till ett år.
- Ändring av protokoll: Kromosom harvesting av lymfoblastoidcellinjer
- Odla celler enligt specifika cellodlingsbetingelser. (Använd kolv lämplig för den mängd celler som odlas). När cellerna har nått logaritmiska fas (ca 2 dagar efter att cellerna är split), tillsätt 10 ml / ml Colcemid till cellkultur kolv.
- Ändring av protokoll: Kromosom skörd från helblod
Fytohemagglutinin (PHA), ett lektin härledd från röd njurböna, är ett kraftfullt mitogen för humana T-celler 16. 72 h efter tillsatsen av PHA till kulturen, omkring 45% av cellerna i S-fasen. Detta representerar toppen mitotisk aktivitet och är den optimala tidpunkten för att skörda för kromosomstudier. Andra mitogener såsom pokeweed (1-10 mikrogram / ml) får användas vid analys B-celler 17,18.- Samla minst 1 ml helblod i en grön topp natrium heparin rör. Använd inom 3 dagar efter samlingen. Affär blod vid RT until klar att använda.
- Alikvot 0,25 ml helblod i 10 ml av komplett RPMI-medium innehållande L-glutamin (20% fetalt bovint serum, 1% penicillin / streptomycin, 1% fungizon och 1% PHA). Odling vid 37 ° C med 5% CO2.
- Ändring av protokoll: Kromosom skörd från benmärg
Cytogenetisk analys på benmärg är till hjälp i många maligna hematologiska sjukdomar som observationen av en kromosomalt onormala klon kan vara diagnostiskt för en viss typ av leukemi. Kromosomstudier används också för att bedöma sjukdomsprogression, såsom uppkomsten av blastkris och svar på behandlingen. Eftersom benmärgsceller är aktivt delande, finns inget mitogen stimulering nödvändig 9,19. För akuta leukemier 24 och 48 tim kulturer också inrättas.- Samla minst 1 ml benmärg i en grön topp natrium heparin rör. Alikvot 0,25 ml av benmärg i 10 ml av komplett RPMI-medium innehållande L-glutamin (20% fetalt bovint serum, 1% penicillin / streptomycin, 1% fungizon). Odling vid 37 ° C med 5% CO2.
2. Skjut Förberedelser och Solid färgning
En snabb bedömning av en representant slide kommer att ge information om kvaliteten på skörden innan du fortsätter till ytterligare förfaranden såsom G-bandning, FISK, CGH, eller SKY. Vissa laboratorier föredrar att fast fläck cellerna för snabb avverkning och kromosom bedömning. Alternativt kan ett faskontrastmikroskop användas för denna analys. Slides framställes bäst när fuktigheten är ca 50% och temperaturen omgivningens (20-25 ° C).
- Centrifugera cellerna vid 200 xg under 5 min vid 25 ° C. Avlägsna supernatanten tills bara 0,3-0,5 ml återstår.
- Efter att försiktigt återsuspendera pelleten pipett tre droppar av cellsuspensionen från ett avstånd av omkring 2 i på en bild som är lutad i en vinkel av ca 45 ° och låt suspensionenatt rulla över bilden. Lägg en stor droppe färsk Carnoys Fixative till bilden.
- Torka baksidan av bilden på en pappershandduk och sedan sitta på bild ut att torka i minst 10 min. Den bild ska vara helt torr.
- Bered en färsk Giemsa färglösningen (3:1 förhållande av Gurr Buffer och Giemsa Stain). Placera glasen på en färgningsställ. Täck hela bilden i Giemsa färglösningen. Låt objektglasen förblir i färgningslösningen under 5 min. Skölj objektglasen med destillerat vatten, avlopp, och låt lufttorka.
- Tillsätt 4 droppar Permount och ett täckglas till bilden. Se till att det inte finns några bubblor under täckglas. Överskottet Permount kan tas bort med en pappershandduk.
- Analysera cellerna i ljusmikroskop enligt 10X och 100X förstoring. Om metafas-celler finns i överflöd och väl spridning, kan de kvarvarande objektglas kan användas för andra experimentella procedurer.
3. G-Banding Använda trypsin och Giemsa (GTG)
<p> trypsin är ett proteolytiskt enzym som denaturerar euchromatic histoner i DNA-regioner med högre transkriptionsaktivitet följd. Efter Giemsa färgning, kommer dessa regioner att visas som ljusa band. Mycket kondenserad kromatin med liten eller ingen transkriptionsaktivitet (heterokromatin) kommer att ha en stor del av sina histoner skyddade från trypsin och kommer därför att färga mörkt efter Giemsa färgning. Det är viktigt att från början G-bandet en bild för att övervaka villkoren och justera trypsin timing vid behov för de efterföljande bilderna.- Lägg till följande lösningar till 4 Coplin burkar.
Burk # 1 = 30 ml 1x HBSS och 4 ml 10x trypsin (0,5%)
Burk # 2 = 50 ml 1x HBSS
Jar # 3 = 45 ml 1x HBSS och 5 ml fetalt bovint serum
Jar # 4 = 50 ml 1x HBSS - Doppa varje bild i Jar # 1 i 5 sekunder, snabb sköljning i burk # 2, lämnar varje bild i Jar # 3 i minst 30 sekunder, snabb sköljning i Jar # 4 låt objektglasen torka.
- Förbered fresh Giemsa färglösningen (3:1 förhållande av Gurr Buffer och Giemsa Stain). Placera glasen på en färgningsställ. Täck hela bilden i Giemsa färglösningen. Låt objektglasen förblir i färgningslösningen under 5 min.
- Skölj objektglasen i destillerat vatten i samma ordning som de var färgade. Låt objektglasen torka i ca 10 min. Den bild ska vara helt torr.
- Tillsätt 4 droppar Permount och ett täckglas till bilden. Se till att det inte finns några bubblor under täckglas. Överskottet Permount kan tas bort med en pappershandduk.
- Analysera cellerna i ljusmikroskop enligt 10X och 100X förstoring. Justera trypsin tidpunkten för resten av bilderna som bygger på resultaten från den första bilden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metafas sprider Hög kvalitet är avgörande för kromosomanalys. En lyckad analys ger kromosomer som är väl spridda och i lämplig kromosom morfologi. Korrekt G-bandad kromosomer innehåller den karakteristiska ljusa och mörka bandmönster.
Figur 1. En lyckad kromosomspridning där kromosomerna är av medellängd, väl spridda och lätt urskiljbara från varandra, och tillräcklig kontrast mellan ljusa och mörka band. God kromosom morfologi gör det möjligt att identifiera enskilda kromosomer och utvärdering för eventuella omdisponeringar indikativa av kromosom instabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har använt detta förfarande för kromosom isolering från celler av olika organismer, inklusive olika celltyper som erhållits från human, rhesus macaques, råttor och möss 11,20-22. Standardprotokollet är anordnad, men med vissa viktiga steg och variabler kan behöva justeras för dessa olika typer av celler. Flera specifika åtgärder är avgörande både i kromosomala förberedelse-och G-band för att säkerställa bästa möjliga kvalitet på resultaten. En av de variabler som kan påverka analysen är Colcemid inkubationstiden. Otillräcklig tid i Colcemid ger färre metafas sprider och längre, överlappade kromosomer. Längre inkubationstider i Colcemid kommer att resultera i kortare och tjockare kromosomer, som är svåra att analysera. En annan viktig variabel är molariteten av hypoton lösning. En 0,075 M kaliumkloridlösning kommer att svälla cellerna precis tillräckligt för att ge ordentlig kromosom sprids, utan att lysera cellerna. Medan tillsatsden Carnoys Fixeringslösning måste de första 5 ml tillsättas till pelleten under blandande. Detta säkerställer att alla de extra proteiner avlägsnas innan du förvarar proverna eller förbereda diabilder. Om i det fall att cellerna inte blandas tillräckligt bra, kommer en gul protein cap bilda ovanpå pelleten, vilket kan orsaka komplikationer under efterföljande förfaranden.
Korrekt förberedelse slide är viktigt. Samtidigt tappar suspenderade cellpelleten på objektglas, se till att bilden lutar cirka 45 ° vinkel och det finns tillräckligt med avstånd (minst 2 inches) från pipetten till bilden så att kromosomerna kan väl spridas på objektglaset för analys . Översvämning bilden med fixativ omedelbart efter släppa cellerna på att bilden kommer också att hjälpa kromosomer att sprida sig. Temperatur och luftfuktighet, vilket påverkar hur snabbt cellsuspensionen torkar den till bilden, är andra faktorer som påverkar kromosom sprids. Dessa kan vara kontrolleras genom att framställa objektglasen i en miljö med ungefär 50% fuktighet och en temperatur av ca 20-25 ° C, och / eller genom att placera objektglasen i en bild varmare för snabbare torkning. För G-Banding, är den viktigaste faktorn som påverkar kvaliteten på kromosomerna de trypsin exponeringstider. Med en längre trypsin exponering kan kromosomer verkar diffust och svullen. Omvänt kommer ett otillräckligt kort trypsin inkubation ge kromosomer med omöjlig att skilja band och lite kontrast. Den trypsin inkubation Tidpunkten kan komma att ändras beroende på varje specifik cellinje-och skördeförhållanden. Därför bör en representant G-banded slide vara först beredd att utvärdera trypsin förhållanden innan färgning resten av bilderna. Fetalt bovint serum används för att inaktivera trypsin aktivitet före färgning. Vi tillhandahåller protokollet använder Giemsa (GTG), men Wrights fläcken kan användas i stället för Giemsa för GTW banding och avkastning liknande resultat.
t "> Detta förfarande är relativt billigt och effektivt att utföra. G-bandning kan användas för att diagnostisera kromosomavvikelser såsom transloka, borttagningar och aneuploidi som vanligtvis ses i maligniteter, genetiska sjukdomar, och stamceller odlade in vitro 10,11 , 13. Detta ger den oumbärliga visualisering av kromosom konstitution och den övergripande utvärdering av hela genomet i flera celler. Det används ofta i kliniska och forskningslaboratorier över hela världen för diagnos, prognos och terapeutiska utvärdering av cancerceller 10. Prenatal och postnatal vävnadsprover rutinmässigt utvärderas för identifiering av numeriska och strukturella avvikelser som orsakar genetiska sjukdomar som Downs syndrom. Stamceller kan snabbt utvärderas för förekomst av kromosominstabilitet. dock upplösningen av G-bandning begränsad för att identifiera microdeletions eller komplexa kromosomavvikelser som sett i metasTatic maligniteter.Därför, när rutin kromosom G-bandning kompletteras med förfaranden såsom fluorescens in situ hybridisering (FISH), jämförande genomisk hybridisering (CGH), och spektral karyotypning (SKY), är upptäckta av kromosomavvikelser ökat dramatiskt 23. Därför är användningen av det nuvarande protokollet i kombination med dessa andra molekylära cytogenetiska procedurer alltmer används av olika laboratorier för utvärdering av kromosom instabilitet i både kliniska och forsknings inställning 13-15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Arbetet beskrivs i detta manuskript har gjorts möjlig genom finansiering från Patrick F. Taylor Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KaryoMAX Colcemid | Gibco | 15212-012 | |
| HBSS Buffer | Gibco | 24020-117 | |
| 0.5% Trypsin EDTA 10x | Gibco | 15400-054 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Buffer Tablets "GURR" | Gibco | 10580-013 | |
| Geimsa Stain | Ricca Chemical Company | 3250-16 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | ||
| Methanol | Caledon Laboratory Chemicals | 6700130 | |
| Glacial Acetic Acid | Krackeler Scientific Inc. | 11-9508-05 |
References
- Driscoll, D., Gross, S. Prenatal screening for aneuploidy. New Engl. J. Med. 360, 2556-2562 (2009).
- Nussbuam, R., et al. Genetics in Medicine: 7th Edition. , Saunders/Elsevier. Philadelphia. 76 (2007).
- Ljunger, E., et al. Chromosomal abnormalities in first-trimester miscarriages. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 84 (11), 1103-1107 (2005).
- Kwinecka-Dmitri, B., et al. Frequency of chromosomal aberrations in material from abortions. Ginecol. Pol. 81 (12), 896-901 (2010).
- Reddy, U., et al. Stillbirth classification—Developing an international consensus for research: Executive summary of a national institute of child health and human development workshop. Obstet. Gynecol. 114 (4), 901-914 (2009).
- Pierpoint, M., et al. Genetic basis for congenital heart defects: Current knowledge. Circulation. 115 (23), 3015 (2007).
- Kaneshiro, N., Zieve, D. Down Syndrome: Trisomy 21. PubMed Health. , (2010).
- Cin, P. D. Current Protocols in Human Genetics. , (2003).
- Wang, N. Methodologies in cancer cytogenetics and molecular cytogenetics. Am. J. Med. Genet. 115 (3), 118-124 (2002).
- Miura, M., et al. Accumulated Chromosomal Instability in Murine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Leads to Malignant Transformation. Stem Cells. 24 (4), 1095-1103 (2006).
- Izadpanah, R., et al. Long-term In vitro Expansion Alters the Biology of Adult Mesenchymal Stem Cells. Cancer Res. 68 (11), 4229-4238 (2008).
- Dekel-Naftali, M., et al. Screening of human pluripotent stem cells using CGH and FISH reveals low-grade mosaic aneuploidy and a recurrent amplification of chromosome 1q. Eur. J. Hum. Genet. 20 (12), 1248-1255 (2012).
- Moralli, D., Yusuf, M., Mandegar, M., Khoja, S., Monaco, Z. L., Volpi, E. An Improved Technique for Chromosomal Analysis of Human ES and iPS Cells. Stem Cell Rev. Rep. 7 (2), 471-477 (2011).
- Bayani, J., Squire, J. Traditional banding of chromosomes for cytogenetic analysis. Curr. Protoc. Cell Biol. 22, (2004).
- Speicher, M. R., Carter, N. P. The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology. Nat. Rev. Genet. 6 (10), 782-792 (2005).
- Benn, P., Delach, J. Human Lymphocyte Culture and Chromosome Analysis. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Muul, L. M., Heine, G., Silvin, C., James, S. P., Candotti, F., Radbruch, A., Worm, M. Measurement of Proliferative Responses of Cultured Lymphocytes, Curr. Protoc. Immunol. , (2011).
- Barch, M. J., Knutsen, T., Spurbeck, J. The Association of Genetic Technologists Cytogenetics Laboratory Manual. San Francisco: 3rd edition. , ACT. Houston, TX. (1997).
- Dewald, G. W., Ketterling, R. P., Wyatt, W. A., Stupca, P. J. Cytogenetic studies in neoplastic hematologic disorders. In Clinical Laboratory Medicine, 2nd edition. McClatchey, K. D. , Williams & Wilkens. Baltimore. 658-685 (2002).
- Kibe, R., et al. IL-7Rα deficiency in p53(null) mice exacerbates thymocyte telomere erosion and lymphomagenesis. Cell Death Different. 19 (7), 1139-1151 (2012).
- Tsien, F., Morava, E., Talarski, A., Marble, M. Phenotypic features of a boy with trisomy of 16q22-->qter due to paternal Y; 16 translocation. Clin. Dysmorphol. 4 (4), 177-181 (2005).
- Tsien, F., et al. Prolonged culture of normal chorionic villus cells yields ICF syndrome-like chromatin decondensation and rearrangements. Cytogenet. Genome Res. 8 (1), 13-21 (2002).
- McGrattan, P., Campbell, S., Cuthbert, R., Jones, F., McMullin, M., Humphreys, M. Integration of conventional cytogenetics (G-banding), comparative genomic hybridization (CGH) and interphase fluorescence in situ hybridization (i-FISH) for the detection of genomic rearrangements in acute leukemia. J. Clin. Pathol. 61 (8), 903-908 (2008).
