بروتوكول للتحليل دورة الخلية الحية ذبابة الفاكهة الأنسجة باستخدام الصوتية أقلم التركيز عداد الكريات. هذا البروتوكول يوفر في الوقت نفسه المعلومات حول حجم الخلية النسبي، عدد الخلايا، والمحتوى الحمض النووي ونوع من الخلايا عن طريق تتبع نسب أو الأنسجة التعبير محددة من البروتينات الفلورية في الجسم الحي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحليل دورة الخلية الحية من
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد التدفق الخلوي تستخدم على نطاق واسع للحصول على معلومات حول محتوى الحمض النووي في عدد السكان من الخلايا، إلى استنتاج النسب المئوية النسبية في مختلف مراحل دورة الخلية. وقد تم تمديد هذه التقنية بنجاح إلى الأنسجة الإنقسامية من طراز كائن ذبابة الفاكهة السوداء البطن للدراسات الجينية من تنظيم دورة الخلية في الجسم الحي. عندما يقترن مع نوع من الخلايا المحددة التعبير بروتين فلوري والتلاعب الجيني، يمكن للمرء الحصول على معلومات مفصلة حول الآثار المترتبة على عدد الخلايا، حجم الخلية ودورة الخلية الإلغاء في الجسم الحي. ومع ذلك فقد اعتمدت هذه الطريقة الخلية الحية على استخدام الخلية نفاذية هويشت 33342 صبغ الحمض النووي الإقحام، مما يحد من المستخدمين إلى أجهزة قياس التدفق الخلوي مجهزة ليزر الأشعة فوق البنفسجية. قمنا بتعديل هذا البروتوكول على استخدام الخلية الحية صبغ الحمض النووي أحدث وVybrant DyeCycle البنفسج، متوافقة مع البنفسج الليزر 405nm وأكثر شيوعا. بروتوكول المعروضة هنا يسمح لكفاءة تحليل دورة الخلية إلى جانب الخليةنوع، حجم الخلية النسبي والمعلومات عدد الخلايا، في مجموعة متنوعة من الأنسجة ذبابة الفاكهة. هذا البروتوكول تمتد دورة الخلية تقنية مفيدة لتحليل الأنسجة الحية ذبابة الفاكهة إلى محلل الفوق الصغيرة، والصوتية أقلم التركيز عداد الكريات، والتي يمكن تشغيلها وصيانتها على نطاق و-LAB واحد.
المقدمة
التدفق الخلوي يمكن أن تستخدم لقياس بقاء الخلية، حجم الخلية النسبي، والمحتوى الحمض النووي والتعبير بروتين فلوري في السكان الخلية الحية. ونظرا لتكرار الحمض النووي النووية خلال S-المرحلة، معلومات عن محتوى الحمض النووي في السكان من الخلايا يمكن استخدامها لاستنتاج النسب المئوية النسبية في مختلف مراحل دورة الخلية 1-3. وقد أصبح هذا الأسلوب حجر الزاوية في تحليل دورة الخلية في نظم نموذج من الخميرة إلى الثدييات.
أصبح ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة السوداء البطن نظام نموذجا ممتازا لالوراثية في التحليلات المجراة من تنظيم دورة الخلية. الأ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. يطير تربية
- الصليب تطير من المورثات المرغوب في قنينات بلاستيكية ضيقة مع 10 مل الخميرة الغلوكوز متوسطة 3 أو غيرها من وسائل الاعلام الغنية بالبروتين من اختيارك. ووصف واسعة ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا أدوات متاحة للأنسجة التعبير محددة ونسبها البحث عن المفقودين في الجسم الحي مع فلوري بروتين تعبير بالتفصيل 4،5 في مكان آخر. نقل الآباء إلى قارورة الطازجة يوميا للحصول على سلسلة من 24 مجموعات ذرية الموارد البشرية، أو لمزيد من التدريج الدقيق، وجمع الأجنة على لوحات أجار ونقل اليرقة حديثة الفقس إلى قارورة كم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويبين الشكل 2 نتائج ممثلة لعينة الجناح اليرقات، معربا عن GFP في النصف الخلفي من الأنسجة، وذلك باستخدام قالب GFP المقدمة. ويتم الحصول على نتائج مماثلة مع نوع الأنسجة نفسها، ونمط التعبير عن طلب تقديم العروض باستخدام طلب تقديم العروض قالب المقدمة (الشكل 3A). النماذج المقدمة والفولتية (الجدول 2) هي مناسبة لتحليل عيون اليرقات (الشكل 3B)، والعقول، والأجنحة، وكذلك عيون العذراء، والعقول (الشكل 3D) والأجنحة. يمكن أيضا إنشا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
بروتوكول الموصوفة هنا يسمح لتحليل دورة الخلية، حجم الخلية النسبي وعدد الخلايا في الأنسجة الحية النسبية ذبابة الفاكهة في مراحل النمو المختلفة. عندما يقترن هذا التحليل مع نوع من الخلايا المحددة التعبير بروتين فلوري أو النسب تتبع، ويمكن الحصول على معلومات مفصلة حول الاستجابات الخلوية لدورة الخلية حصيف أو اضطرابات النمو. وكدليل على المبدأ، ونحن تعطلت هدوء في الطيران الدماغ العذراء بالإعراب عن G1-S المنظمين دورة الخلية في GFP المسمى استنساخ الخلية، مما يؤدي إلى تكرار الحمض الن.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
نشكر عايدة دي لا كروز لتطوير وتدريس البروتوكول الأصلي الذي يستند هذا الإصدار 10. ويدعم عمل في مختبر من قبل المعاهد الوطنية للصحة Buttitta منحة GM086517.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
<قوي>الجدول 1. الكواشف والأدوات المطلوبة.< / strong>< / span >
< td colspan = "4" >< td colspan = "4" >< p class = "jove_step" > Live DNA Stain Solution (10 ml): < / p> < TD colspan = "4" >< جدول الحدود = "1" > < / tr > < td > الجهد (مللي فولت) < / td > < td > 2950 < / td > < td > 4250 < / td > < td > 1800 < / td>
1 مل 10X Ca2 + < / sup> Mg2 + < / sup> PBS الحر (pH7.2)
9 مل 10X Trypsin-EDTA (Sigma)
5 & mu ؛ ل Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet (لاحظ أن هذا هو 0.25X التركيز الموصى به لخلايا الثدييات. نجد أن التركيزات الأعلى سامة لخلايا <ذبابة >الفاكهة< >).فئة < / p>
10X Ca2 + < / sup> Mg 2 + < / sup> PBS مجاني (pH7.2): 1.37 مليون كلوريد الصوديوم ، 27 ملي كلوريد كلوريد ، 100 ملي مولار Na 2< / sub>HPO4< / sub> (ثنائي الأساسي) ، 20 ملي مولار KH2< / sub>PO4< / sub> (أحادي الأساسي) معدلة إلى الأس الهيدروجيني 7.2< / ص >
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات | |
|---|---|---|---|---|
| 12 × 75 مم البوليسترين مستدير القاع 5 مل أنبوب اختبار | BD Falcon | 352058 | 5 مل أنابيب | |
| Attune Acoustic Focus Cytometer | Life Technologies / Applied Biosystems | 4445315 | التكوين الأزرق / البنفسجي | |
| Attune Cytometer Software (الإصدار 1.2.5) Life | Technologies / Applied Biosystems | Free< / em>< strong> | PC فقط | |
| حبات تتبع الأداء Attune (5 × 106 حبات / مل) | تقنيات الحياة / الأنظمة الحيوية | التطبيقية 4449754 | لاختبار الأداء اليومي | |
| Dumont # 5 ملقط Inox | أدوات العلوم الدقيقة | 11251-20 | ||
| أطباق الأجنة 30 مم × 12 مم | علوم المجهر الإلكتروني | 70543-30 | أطباق تشريح الزجاج | |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670051 | ||
| محلول التربسين-EDTA (10x) | Sigma | T4174 | ||
| Vannas-T & # 252 ؛ مقص الربيع bingen | أدوات العلوم | الدقيقة 15003-08 | مستقيم 5 مم | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Life Technologies / Invitrogen | V35003 | ||
| < td> | FSC | SSC | BL1 | VL1 |
| عتبة (x1000) < / td > < td > 100 < / td > <> 10 < / td > < td > 10 < / td > < td > 10 < / td > < / tr > | ||||
| 1150 |
الجدول 2. إعداد العتبة والجهد للتحليل في الشكل 2.< / strong>< / p>
المراجع
- Nunez, R. DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry. Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).
- Rabinovitch, P. S. DNA content histogram and cell-cycle analysis. Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).
- Ashburner, M., Roote, J.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
