Summary
Zebrafisk är en framväxande system för modellering av mänskliga sjukdomar i skelettmuskulaturen. Vi beskriver en snabb och effektiv metod för isolering av skelettmuskel myofibers från embryonal och larver zebrafisk. Denna metod ger en hög densitet myofiber beredning lämplig för studier av enstaka skelettmuskelfiber morfologi, protein subcellulära lokalisering och muskelfysiologi.
Abstract
Den zebrafisk har visat sig vara ett värdefullt modellsystem för att utforska skelettmuskelfunktion och för att studera mänskliga muskelsjukdomar. Trots de många fördelarna med in vivo-analyser av skelettmuskulaturen i zebrafisk, visualisera komplexa och fint strukturerad protein miljö ansvarar för muskelfunktion, speciellt i hela embryon, kan vara problematiskt. Detta hinder härrör från den lilla storleken hos zebrafisk skelettmuskel (60 ^ m) och ännu mindre storlek av sarcomere. Här beskriver vi och demonstrera en enkel och snabb metod för att isolera skelett myofibers från zebrafisk embryon och larver. Vi inkluderar även protokoll som illustrerar placera beredningstekniker som är användbara för analys av muskelstruktur och-funktion. Specifikt vi detalj den efterföljande immuncytokemiska lokalisering av skelettmuskelproteiner och kvalitativ analys av stimulerad kalciumfrigör via levande cell kalcium avbildning. Totalt sett denna videoArtikeln ger en rättfram och effektiv metod för isolering och karaktärisering av zebrafisk skelett myofibers, en teknik som ger en kanal för otaliga efterföljande studier av muskelstruktur och funktion.
Introduction
Skelettmuskulatur är en högspecialiserad vävnad ansvarig för att generera de kontraktila styrkor som krävs för rörlighet. Sammandragning initieras genom en process som kallas excitation-kontraktion (EG) koppling som omvandlar elektriska signaler till kalcium frisättning från intracellulära butiker 1,2. Intracellulär kalciumfrigör aktiverar sarcomere att förkorta och generera kraft. De många specifika komponenter av molekylära maskiner som ansvarar för att förmedla neuromuskulära förbindelsen växellåda 3, EG-koppling 4,5, och aktin-myosin beroende sammandragningar 6 fortsätter att vara den pågående föremål för intensiv forskning. Dessutom har proteiner som stabiliserar muskelmembranet under kontraktion 7,8 och som förmedlar signalering mellan myofiber och den extracellulära matrisen 7,9 identifierats och undersökts i detalj.
Mutationer i ett antal gener som är viktiga för muskelstruktur ennd funktion har identifierats som orsaker till humana skelett muskelsjukdomar ( http://www.musclegenetable.org/ ). Dessa sjukdomar, som klassificeras i stort sett som skelett myopatier och muskeldystrofi baserade på kliniska och histopatologiska funktioner, är förknippade med muskelsvaghet, livslånga handikapp och tidig dödlighet 10,11. Den zebrafisk har visat sig vara ett enastående system för modellering och studera mänskliga skelett muskelsjukdomar 8,12,13. Det har använts för att validera nya genmutationer 8, definiera nya aspekter av sjukdoms patofysiologi 14,15, och identifiera nya terapeutiska metoder 15,16. Kraften i den zebrafisk för studium humant muskelsjukdom hänför sig till ett stort antal avkommor, den snabba utvecklingen av muskelstruktur och-funktion, den optiska klarheten hos zebrafisk embryot, och lättheten för genetisk och farmakologisk manipulation av framkallnings zebrafisk 17.
Vi och andra 12,18,19 har nyligen utvecklat en enkel teknik för snabb och effektiv isolering av myofibers från framkallningszebrafisk. Denna metod har gjort det möjligt att granska myofibers mer detaljerat än vad som kan tillhandahållas av hela embryo-analys. Tekniken har utnyttjats för karakterisering av protein subcellulära lokalisering 20 samt för identifiering av viktiga histopatologiska egenskaper som en del av valideringsstudier i nyutvecklade sjukdomsmodeller 21. Dessutom kan enstaka myofibers dessutom användas för live-avbildning och för elektrofysiologiska studier 22, tekniker som gör det möjligt att förhör av viktiga aspekter av muskelfunktion. Den specifika protokoll för myofiber isolering, tillsammans med två exempel på efterföljande analytiska experiment, är detaljerad i de återstående delarna av detta manuskript.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av poly-L-lysin-belagda täck (Tid: 1 timme)
Beläggningstäck möjliggör snabb myofiber sedimentering och vidhäftning. Detta kan utföras under dissociation steg av myofiber isolering (steg 2 nedan).
- Klipp och placera Parafilm på botten av en 60 mm petriskål (alla märken).
- Placera mikroskop täckglas halk (12 mm diameter) på Parafilm i en 60 mm vävnadsodlingsskål eller placera dem i en enstaka brunnar i 24-hålsplattor.
Anmärkning 1: Dessa små runda täck hjälper koncentrera myofiber siffror och minska onödig användning antikropp.
Not 2: Övriga storlek täckglas fungerar, men kommer volymerna av reagenser och embryon som används måste anpassas därefter.
- Pipettera 50-200 pl av poly-L-lysin-lösning (0,01%) på varje täckglas i petriskålen.
- Låt täck sitta minst en hoUR vid 37 ° C. Längre inkubationer kommer inte att negativt påverka resultatet.
- Avlägsna poly-L-lysin-lösningen från täckglaset och tvätta två gånger med ett minimum av 100 ^ il 1 x PBS.
- Låt täckglas för att torka.
- Täckglas är nu redo för myofibers.
Not 3: För att säkerställa sterilitet, kan beläggningen göras på en huva och på autoklaverade täckglas.
Not 4: Håll 60 mm petriskål med Parafilm på botten. Denna inställning kommer att användas under myofiber plätering och immunomärkning (senare steg).
Alternativ 1: I stället för beläggningstäck omedelbart före användning, kan användas en belagd täcklagret. En 60 mm petriskål som innehåller minst 2 ml poly-L-lysin kan lagras vid 4 ° C innehållande ett flertal täckglas. Med detta alternativ startar på steg 1.5 att behandla täckglasen för myofibers.
Alternativ 2: Vi också päls täckglas i poly-L-ornitin. Than är mer arbetsintensiv, men är användbart för längre sikt odling eftersom poly-L-ornitin belagda täckglas kan vara UV-behandlat. Med UV-behandling och noggrann steril teknik levande myofibers typiskt kan upprätthållas i kultur från 4-7 dagar.
2. Dissociation av Zebrafish embryon och plätering av myofibers (Tid: 1-3 tim)
Obs: standardprotokollet gäller bäst till 3 dpf (dagar efter befruktning) embryon.
- Överför zebrafisk embryon i en standard 1,5 ml centrifugrör och ta bort så mycket överskottsfisk vatten som möjligt. Normalt kan 10-20 embryon per rör, om än mindre användas. Att använda mer än 20-25 embryon resulterar ofta i en beredning av överdriven densitet.
- Ta chorions före dissociation, manuellt med # 5 pincett. Alternativt kemisk chorion borttagning uppnås med en 10-15 min Pronase behandling. Normalt är den tidigare borttagande av chorion endast behövs när föregående bekräftelse av en mutant fenotyp eller morfologi krävs, eller vid användning av steg där embryona naturligt kläckts från sin chorion.
- Lägg till 900 l av CO 2-oberoende medier till röret med embryona.
- Addera 100 pl av kollagenas typ II, slutlig koncentration 3,125 mg / ml (Stock kollagenas lösning vid 31,25 mg / ml utspädd i 1 x PBS) för att börja dissociation. Kollagenas IV kan också användas för dissociation.
- Rotera embryon på en skakapparat, och mal sönder var 30 min vid RT med hjälp av en P1000 Pipetman för rivning.
Not 2: Noggrant övervaka embryo dissociation, över eller under dissociation (särskilt äldre) är de vanligaste orsakerna till protokoll misslyckande. Tider för digestion kommer att variera beroende på intensiteten av triturering, antalet embryon per rör, och åldern av embryon. Det är också ofta mindre (i jämförelse med vildtyper) för embryon från skelett mutanter muskel.
Obs3: Genomsnittlig koktiden per embryo ålder: 1 dpf = 1 tim, 2 dpf = 1,5 tim, 3 dpf = 2 timmar och 4 dpf = 2-2,5 tim.
- Sluta matsmältningen när inga hela embryon är synliga, men ändå fasta partiklar är fortfarande synliga - det är viktigt att förhindra overdigestion.
- Centrifugrör med dissocierade embryon vid 0,8-2,3 xg för 3-5 min till pellets cellerna.
- Avlägsna supernatanten från pelleterade celler och tvätta 2x med CO 2-oberoende medier.
- Lägg färsk CO 2 oberoende medier att suspendera cellerna. 1 ml används normalt för preps av 10-20 embryon. Volymen kan skalas utifrån embryo nummer.
- Med hjälp av en P1000 pipett passera embryo fjädring genom ett 70 pm filter. Detta hjälper till att ta bort oönskat skräp från prep.
Not 4: Embryo suspension kan filtreras en andra gång genom en 40 ^ m filter för att ytterligare ta bort oönskat skräp. Från en dubbel filtrering, är återhämtningen approximbart 800 | il från en startvolym av 1 ml.
- Tillsätt cirka 50 till 100 | il av myofiber suspension till varje poly-L-lysin-belagda täckglas.
Not 5: Utför steg 2.9 i petriskålar med Parafilm på botten, som tidigare framställts. Den Parafilm håller myofiber avstängning från att köra bort de belagda täckglas. Håll Petriskålar täckta för att förhindra avdunstning.
- Tillåt myofibers sedimentera cirka 1 timme på de belagda täckglas vid rumstemperatur.
Not 6: myofibers börjar bosätta inom 5-10 min. Men för god myofiber fastsättning, är ett minimum av 1 h (1-2 h) rekommenderas. Att låta myofibers nöja sig längre skadar inte prep. För längre inkubationer (även över natten), kan antibiotika sättas till media. Med antibiotika och steril teknik levande kulturer kan typiskt upprätthållas under 1-2 dagar.
- Live myofibers kan observeras vid denna punkt. Myofibers från embryon 2 dpf och senare kommer att ses som tvärstrimmig och långsträckta celler (Figur 1). Vid denna punkt, myofibers är nu redo för live-analys eller för immunmärkning.
Not 7: Skelettmuskulatur från 1 dpf embryon inte plattan som avlånga och tydligt tvärstrimmiga fibrer. Istället stora myoballs är synliga. Dessutom, under pelleteringsfasen efter dissociation (steg 2,6), 1 dpf myoballs behöva centrifugeras under minst 8 min vid 5000 xg för att åstadkomma en pellet. För analys av embryon i detta skede, är det rekommenderat att använda transgen linje som uttrycker EGFP särskilt i skelettmuskeln 23. Detta kommer att möjliggöra identifiering av celler från muskel ursprung jämfört med andra källor.
3. Fluorescens Immunfärgning av Dissocierade Zebrafish myofibers (Tid: ca 1 dag)
3,1. Immunomärkning
- Avlägsna en del avmedia från myofibers anslutit sig till den belagda täckglas
- Fix celler med användning av 4% paraformaldehyd eller metanol. För PFA, ta ½ volymen av media och ersätta med samma mängd PFA. Fix i 10 min vid RT, ta sedan bort den totala volymen, byt med 50-100 pl av PFA, och fixa i ytterligare 10 minuter. För alkohol fixering, iskall metanol eller aceton kan appliceras vid 4 ° C under 10 min eller 5 min, respektive.
- Tvätta myofibers minst 3-5x med 1x PBS eller 1x PBS plus 0,1% Tween. Genomsnittlig tvättvolym är 50-100 l per täckglas.
- Lägg blockerande lösningen till myofibers (arbets lager) och inkubera 20-60 minuter i rumstemperatur. Blockering lösningen kommer att variera beroende på de primära och sekundära antikroppar. De två vanligaste används i labbet är (1) 1 x PBS, 2 mg / ml BSA, 1% fårserum, 0,25% Triton X-100 slutlig och (2) 0,2% Triton X-100, 2 mg / ml (0,2 % BSA) och 5% får / get-serum.
- Ta bort blockerande lösningen och tillsätt primära antikroppen späds i antingen blåsning lösning eller PBS. Inkubera myofibers över natten vid 4 ° C. Se till att antingen Parafilm eller linda in saran wrap petriskål innehåller myofiber belastade täckglas belagda med antikroppar. Små bitar av fuktad pappershandduk kan adderas för att skapa en fuktig kammare.
- Ta bort primär antikropp från täckglas och tvätta täckglas 3-5x 5 minuter med PBS eller blockerande lösningen.
- Lägg sekundär antikropp vid lämplig koncentration utspädd i 1 x PBS eller blockeringslösning under 1-2 timmar vid RT.
- Avlägsna sekundär antikropp och tvätta myofibers 3-5x i PBS under 5 min vardera vid RT.
3,2. Monteringstäck
- Applicera 1-2 droppar av antifade reagens till ett objektglas.
- Hämtning försiktigt belagda och immunolabled täckglas med pincett och plats (myofibers ner) täckglas på antifade reagens på objektglas.
Not 1: Observera att orienteringen av coated täckglas är kritisk.
- Lägg 1-2 Kimwipes på en hård fast yta. Snabbt invertera bilden med de belagda täckglas som vilar på antifade reagens och placera den (täckglas ner) på Kimwipes.
- Tryck lätt hörnen på objektglas för att avlägsna överskott antifade och bildar en tätning mellan bilden och täckglas
- Låt den antifade återstående torka under 5 till 10 min vid RT, sedan myofibers är redo att bilden (Fig. 2A och B) eller förvara vid 4 ° C.
4. Levande cell Kalcium Imaging Använda GCaMP3
Levande cell experiment kan utföras på myofibers före fixering (Följande steg 2,10). Följande protokoll beskriver Bildproduktion i myofibers uttrycker GCaMP3 24, en genetiskt kodade kalcium indikator, uttrycks av skelettmuskulaturen specifikt zebrafisk α-aktin promotor (pSKM) 23. Alternativtdenna teknik kan lätt anpassas för att använda kalciumindikatorfärgämnen såsom Fura-2.
- Injicera embryon med pSKM: GCaMP3 konstruera vid 1-2 cellstadiet
- Vid 3 dpf, samla larver och förbereda myofibers som beskrivs i avsnitt 1 och 2. Tillåt myofibers vidhäfta under ett minimum av en timme. För denna teknik, förbereder täckglas i 24-brunnar krävs.
- Ta försiktigt bort eventuellt överskott medier, och tillsätt 300 l av färsk CO2 oberoende medier vid RT.
- Beakta celler under ett inverterat mikroskop. GCaMP3 positiva myofibers bör synas i grön fluorescens.
- Ställ in kameran för inspelning, om så önskas.
- Förbered en 30 mM koffeinlösningen i CO2 oberoende medier. För att stimulera celler, försiktigt pipettera 300 l av koffeinlösningen i brunnen under förstoring. Inom 5-10 sek, bör GCaMP positiva myofibers svara på koffein med en snabb ökning av fluorescens (Figur 3). Myofibers kan också ingå avtal. Notera, inducerar koffein kalciumfrisättning från sarkoplasmiska retiklet lagrar 25. Andra medel, såsom KCl 26 och ryanodine 4, kan användas för att studera inducible kalcium release.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fluorescerande immunmärkning av myofibers (Figur 2)
Bilder som visar förväntade fluorescerande märkningsmönster från myofibers immunostained efter lyckad isolering och plätering. De myofibers har märkts med antingen anti-ryanodinreceptorn (1:100) (figur 2A) eller anti-α-aktinin (1:100) (Figur 2B) antikroppar och avslöja immunofärgning av triaden och Z-banden. Sekundära antikroppar som användes var Alexa Fluor 555 (1:500). Bilder tagna med hjälp av konfokalmikroskopi.
Inducerad kalciumfrisättning från en myofiber (Figur 3)
Panel-serien visar den representativa kalciumfrisättning från en isolerad myofiber behandlas med koffein. I korthet var zebrafisk embryon injiceras i en cell scenen med pSKM: GCaMP3 konstruktion. Vid 3 dpf ades embryon dissocierades och ströks såsom beskrivits i protocol. För analys, var GCaMP3 uttrycker myofibers valts, vilket framgår av förekomsten av grön fluorescens vid baslinjen. Med hjälp av en mikropipett för läkemedelsadministrering, var den valda fibern badade i en 30 mM koffein lösning för att inducera kalcium release. Videoinspelning startades före koffein ansökan och fortsatte fram till topp-fluorescens uppnåddes. Denna figur visar normalt koffein inducerad kalcium release, och tekniken kan användas för att förhöra excitation-kontraktion kopplingsapparat via live-avbildning.
Figur 1. Schematisk Tidslinje för Embryo Dissociation. Successiva paneler (topp till botten) illustrera enskilda åtgärder, timing, och utrustning som krävs för embryo dissociation. A) Val av embryon för dissociation. Scale bar 500 | im. B) Image av dissociation setup. Embryon är i media och kollagenas under rotation tills tillräckligt dissocierade (Protokoll steg 2) C) Bild av både myofiber bordläggningen tekniker;. Runda täckglas eller 24-brunnsplattor (protokoll steg 1 och 4, respektive) D) Ett ljusfält. bild av levande dissocierade zebrafisk myofibers pläterade på poly-L Lysin belagda täckglas. Pilar anger avlånga myofibers från 48 HPF zebrafisk. Scale bar 30 nm.
Figur 2. Immunomärkning enskilda myofibers isolerade från 48 HPF zebrafisk embryon. A) Myofiber märkt med anti-ryanodinreceptor (RyR1), avslöjar en bandad mönster längs fibern förenlig med lokalisering till triaden / EG kopplingsapparat. B) Myofiber märkt med anti-α -actinin, visualizin g strimmor (röda) längs myofiber lokalisera till sarcomere och lyfta Z-banden. I båda bilderna är kärnor märkta med DAPI, ses som blå ovaler. Inserts visar högre förstoring av myofiber i den stora bilden. A) och B) Skalstrecket 30 um.
Figur 3. Representant inducerad kalciumfrigör svar från en enda isolerad zebrafisk myofiber. Alla paneler visar en pseudocolored zebrafisk myofiber uttrycker GCaMP3. Tidsförloppet visar ökningen av GCaMP3 fluorescens (röd färg) som svar på tillämpningen av 30 mM koffein. Inspelningen började före koffein ansökan (0 ms) och fortsatte att maximal fluorescens svar (992 msek). Scale bar 30 nm.nk "> Klicka här för att visa en större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebrafish är en kraftfull ryggradsdjur modellsystem för att studera muskelutveckling och funktion in vivo 25,27,28. De har också dykt upp som en värdefull tillgång för modellering humana muskelsjukdomar 14,15,20,29. Även om stora framsteg har gjorts för att främja användning och tillämpning av zebrafisk för studier av muskelfunktion och muskelsjukdomen, det finns ett ständigt kritiskt behov av att utveckla verktyg som gör att mer ingående analys som berömmer den genetiska, morfologiska, beteendemässiga och funktionella fördelar zebrafisk har redan 17. Därför har vi anpassat och utvecklat en enkel och robust teknik för karakterisering av zebrafisk myofibers från dissocierade hela embryon.
Användandet av individuella myofibers är vanligt i studier med den murina modellsystemet. Hos möss har det tillåtet för utredningar och analyser som är opraktiskt eller omöjligt i hela djur, inkluding subcellulära protein lokalisering studerar 30, levande cell imaging 31, och elektrofysiologiska mätningar 32. I zebrafisk, har liknande dissociation tekniker tidigare utvecklats för att specifikt identifiera och undersöka motorneurons 33 liksom Rohon-Beard sensoriska neuroner 34, och dessa tekniker har möjliggjort detaljerad analys av dessa neuron subtyper.
Den breda tillämplighet isolerade myofibers, i kombination med de många unika fördelar zebrafisk erbjuder som ett ryggradsdjur modell 17, är det som motiverade oss att utveckla en teknik för att isolera och karakterisera embryonala och larver zebrafisk myofibers. Vi har använt isolerade myofibers i tidigare studier för att bestämma subcellulära lokalisering av muskelproteiner 20,21, för att studera lokalisering av chimärt uttryckta transgener 35 och att fastställa särskilda myofiber parametrar, bland annat särskilt storlek
Grabner och kollegor har också använt myofiber systemet till stor framgång 19,22,36. De är den enda grupp att rapportera långvarig odling av isolerade fibrer. Dessutom har de kunnat använda fibrerna för att mäta elektrofysiologiska egenskaper hos muskeln. Specifikt de har testat effekterna av förlust av beta-subenheten av dihydropyridin-receptorn på kalciumfrisättning och mätte förmågan hos en uppsättning av transgener för att rädda defeCTS i den här versionen. Dessa studier belysa några av de mycket kraftfulla potentiella tillämpningar av isolerade myofibers.
En annan grupp att redovisa användningen av myofiber prep för att studera muskelsjukdomen är Nixon et al. Som används myofibers för att undersöka effekterna av morpholino medierad caveolin 3 knockdown på muskelutveckling och muskelstruktur 18. Dessa författare inte bara undersökt parametrar med Ijusmikroskopi utan också studerat de fibrer med användning av elektronmikroskopi. Deras arbete identifierar ännu en annan fördel med den isolerade myofiber System: förmågan att studera ultrastrukturen av myofiber i en isolerad och kontrollerad miljö.
Dessa studier, tillsammans med vårt arbete, pekar på det potentiella breda användbarheten för denna teknik. Ytterligare applikationer är säker på att utvecklas, till exempel att mäta snabba kalcium spikar med hjälp av indikatorer som Fura-2. Dessutom erbjuder denna beredning möjlighet att observe elektrisk aktivitet, till exempel aktionspotentialer via spänningskänsliga färgämnen (Di-4-ANEPPS) eller direkt elektrofysiologiska inspelning. Det verkar uppenbart att alla nuvarande tekniker som används på murina myofibers bör gälla för zebrafisk myofibers. Dessutom, förmågan att uttrycka olika transgener i utvecklingszebrafisk, samt tillgången till ett stort och växande antal transgena zebrafisk som uttrycker olika markörproteiner ( www.zfin.org ), lägger ett extra lager av komplexitet och tillämplighet till systemet. Vi visar detta faktum med myofibers odlade från GCaMP3 uttrycker zebrafisk, där vi dra nytta av förmågan att uttrycka GCaMP3 i muskeln för att studera inducerad kalcium avbildning i realtid i isolerade fibrer (Figur 3).
Som med de flesta tekniker, det finns också några tydliga begränsningar i isolerade myofiber systemet. Dessa frågor är i tillägg till stativetard bristerna i att studera en celltyp in vitro som fungerar som en tredimensionell syncytia in vivo och för att utföra elektrofysiologiska experiment med nonphysiologic stimuli. Med hjälp av vår metodik, är man inte kunna få en ren beredning av myofibers. Detta är inte ett problem för immunfärgning eller elektrofysiologiska mätningar, men det utesluter vissa experimentella metoder. Till exempel har vi ännu att bestämma en lämplig metod för att identifiera en ren population av myofibers för transcriptomic analys. Vi har försökt FACS sortering av GFP-uttryck myofibers följt av myofiber förberedelse, men det har inte resulterat i en ren kultur med ett lämpligt antal myofibers för antingen RNA eller proteinanalys.
En annan utmaning är den långsiktiga odling av myofibers. Vi har kunnat hålla kulturer för cirka 24 timmar, och Grabner och kollegor rapporterar ett preparat som har lämpligt för flera dagar av experiment 19. Utmaningen i samband med denna aspekt av tekniken hindrar förorening, eftersom dessa kulturer (ungefär som murina myofiber preps) är ofta svåra att hålla sterila. Stor försiktighet krävs om man ska försöka långvarig kulturer. Vi rekommenderar användning av antimikrobiella medel inklusive antimykotika.
Sammantaget visar vi en praktisk metod för isolering av zebrafisk myofibers samt kontur hur man utför fluorescerande immunomärkning och realtids kalcium avbildning på isolerade preparat fiber. Fortsatt modifiering och utveckling av denna teknik kommer att erbjuda ett ständigt växande repertoar av verktyg för att experimentera på specifika, isolerade celltyper i zebrafisk. Genom att ta avstånd zebrafisk embryon i isolerade individuella myofibers, kan vi ytterligare öka vår förståelse av muskel utveckling, funktion och sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga motstridiga intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka medlemmarna i Dowling lab (Aaron Reifler, Trent Waugh, Angela Busta, och William Telfer) som bidrog till utvecklingen av tekniken och produktionen av manuskriptet. Detta arbete har finansierats av den Taubman Institutet, institutionen för pediatrik vid University of Michigan, och dels av bidrag från muskeldystrofi Association (JJD MDA186999) och National Institutes of Health (JJD 1K08AR054835).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well culture plate | Corning | 3524 | |
| 10x PBS | Invitrogen Gibco | 70011 | |
| CO2 Independent medium | Invitrogen Gibco | 18045 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004186 | Lot 41H12764 |
| Collagenase Type IV | Worthington Biochemical | L5004188 | |
| 8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Sheep serum | Sigma | S3772 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Glass coverslips | Fischerbrand | 12-545-82 12CIR-1D | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Pronase | Sigma | P5147 | |
| 40 μm Filter | BD Biosciences | 352340 | |
| 70 μm Filter | BD Biosciences | 352350 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36931 | |
| Anti-α-Actinin antibody | Sigma | A5044 | |
| Anti-RYR antibody | Abcam | 34C | |
| Alexa Fluor antibody | Invitrogen | A-21425 | |
| TWEEN 20 | Sigma | P1379 | |
| 60 mm Petri dish | Fischerbrand | 0875713A | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Microscope slide | Fischerbrand | 12-550-15 | |
| Caffeine | Sigma | C0750 |
References
- Dulhunty, A. F. Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33, 763-772 (2006).
- Bannister, R. A. Bridging the myoplasmic gap: recent developments in skeletal muscle excitation-contraction coupling. J. Muscle Res. Cell Motil. 28, 275-283 (2007).
- Ohno, K. Genetic defects and disorders at the neuromuscular junction. Brain Nerve. 63, 669-678 (2011).
- Lanner, J. T., Georgiou, D. K., Joshi, A. D., Hamilton, S. L. Ryanodine receptors: structure, expression, molecular details, and function in calcium release. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
- Dolphin, A. C. Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
- Sparrow, J. C., Schock, F. The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 293-298 (2009).
- Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma. Circ. Res. 94, 1023-1031 (2004).
- Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).
- Barresi, R., Campbell, K. P. Dystroglycan: from biosynthesis to pathogenesis of human disease. J. Cell Sci. 119, 199-207 (2006).
- Emery, A. E. Population frequencies of inherited neuromuscular diseases-a world survey. Neuromuscul. Disord. 1, 19-29 (1991).
- Nance, J. R., Dowling, J. J., Gibbs, E. M., Bonnemann, C. G. Congenital myopathies: an update. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 12, 165-174 (2012).
- Bassett, D. I., Currie, P. D. The zebrafish as a model for muscular dystrophy and congenital myopathy. Hum. Mol. Genet. 12, 265-270 (2003).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 252-256 (2000).
- Dowling, J. J., et al. Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy. PLoS Genet. 5, (2009).
- Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5331-5336 (2011).
- Detrich, H. W., Westerfield, M. 3rd, M,, Zon, L. I. Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).
- Nixon, S. J., et al. Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning. Hum. Mol. Genet. 14, 1727-1743 (2005).
- Schredelseker, J., et al. The beta 1a subunit is essential for the assembly of dihydropyridine-receptor arrays in skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17219-17224 (2005).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis. Model Mech. 5, 389-396 (2012).
- Dowling, J. J., Low, S. E., Busta, A. S., Feldman, E. L. Zebrafish MTMR14 is required for excitation-contraction coupling, developmental motor function and the regulation of autophagy. Hum. Mol. Genet. 19, 2668-2681 (2010).
- Schredelseker, J., Dayal, A., Schwerte, T., Franzini-Armstrong, C., Grabner, M. Proper restoration of excitation-contraction coupling in the dihydropyridine receptor beta1-null zebrafish relaxed is an exclusive function of the beta1a subunit. J. Biol. Chem. 284, 1242-1251 (2009).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Dev. Biol. 192, 289-299 (1997).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Zhou, W., et al. Non-sense mutations in the dihydropyridine receptor beta1 gene, CACNB1, paralyze zebrafish relaxed mutants. Cell Calcium. 39, 227-236 (2006).
- Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 6529-6534 (1997).
- Hirata, H., et al. accordion, a zebrafish behavioral mutant, has a muscle relaxation defect due to a mutation in the ATPase Ca2+ pump SERCA1. Development. 131, 5457-5468 (2004).
- van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
- Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum. Mol. Genet. 20, 1712-1725 (2011).
- Leuranguer, V., Papadopoulos, S., Beam, K. G. Organization of calcium channel beta1a subunits in triad junctions in skeletal muscle. J. Biol. Chem. 281, 3521-3527 (2006).
- Capote, J., Bolanos, P., Schuhmeier, R. P., Melzer, W., Caputo, C. Calcium transients in developing mouse skeletal muscle fibres. J. Physiol. 564, 451-464 (2005).
- Adams, B. A., Tanabe, T., Mikami, A., Numa, S., Beam, K. G. Intramembrane charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs. Nature. 346, (1990).
- Sakowski, S. A., et al. A novel approach to study motor neurons from zebrafish embryos and larvae in culture. J. Neurosci. Methods. 205, 277-282 (2012).
- Nakano, Y., et al. Biogenesis of GPI-anchored proteins is essential for surface expression of sodium channels in zebrafish Rohon-Beard neurons to respond to mechanosensory stimulation. Development. 137, 1689-1698 (2010).
- Davidson, A. E., et al. Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies. Brain. 136, 508-521 (2013).
- Schredelseker, J., Shrivastav, M., Dayal, A., Grabner, M. Non-Ca2+-conducting Ca2+ channels in fish skeletal muscle excitation-contraction coupling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5658-5663 (2010).
