Summary
Este protocolo descreve um processo melhorado que implica explante
Abstract
Desenvolvimento cortical envolve complexas interações entre neurônios e não-neuronais, incluindo elementos de células precursoras, vasos sanguíneos, meninges e da matriz extracelular associada. Porque eles fornecem um ambiente adequado organotípica, explantes fatia corticais são muitas vezes utilizados para investigar essas interações que controlam a diferenciação neuronal e desenvolvimento. Embora benéficos, o modelo de explante fatia podem sofrer de inconvenientes, incluindo a laminação celular aberrante e migração. Relatamos aqui um sistema de explante todo hemisfério cerebral para estudos do desenvolvimento cortical precoce, que é mais fácil de preparar do que fatias corticais e programas de migração organotípica consistente e laminação. Neste sistema modelo, laminação precoce e padrões de migração continuar normalmente durante um período de dois dias, in vitro, incluindo o período de separação preplate, durante o qual camada cortical prospectivo seis formas. Em seguida, desenvolvemos um electroporação utero ex (EUEP)abordagem que alcança ~ 80% de sucesso na segmentação expressão GFP para os neurônios em desenvolvimento no córtex dorsal medial.
O modelo de explante todo hemisfério faz desenvolvimento precoce cortical acessível para intervenção eletroporação, farmacológicos e abordagens de imagem ao vivo. Este método evita a cirurgia necessária de sobrevivência in utero eletroporação (IUEP) abordagens, melhorando simultaneamente a transfecção e consistência de segmentação de área. Este método irá facilitar os estudos experimentais de neuronal migração, proliferação e diferenciação.
Introduction
Os mamíferos cerebrais formas através do córtex concertada migração, proliferação e diferenciação de neurónios sucessivamente gerados. Cada neurónio nasce na zona ventricular (VZ) e migra do VZ na zona intermédia (IZ), formando a placa cortical (CP) 1. À medida que passam através de diferentes domínios corticais, os neurónios migram exibir vários modos de 2,3 a migração dependentes do meio extracelular e de outros elementos celulares (por exemplo, a glia radial) dentro do tecido em desenvolvimento. Neurónios corticais então prender migração no topo da placa de moldagem cortical nos processos coincidentes de prisão migração neuronal e 4 dendritogenesis.
Desenvolvimento cortical é iniciada entre os dias embrionários 11-13 (E11-13) 5 a criação da camada plexiforme primordial 6 ou preplate (PP), uma camada de neurónios pioneiras que recobre o VZ. Em perspectivaCamada 6 neurônios corticais (ou seja, os primeiros neurônios corticais nascidos no VZ), em seguida, orientar seu somata em um padrão estereotipado e se fundem em uma camada distinta dentro do PP 7. Estes eventos dividir o preplate em um (camada cortical futuro 1) marginal superficial e uma zona de fundo, o último composto de células subplaca cortical (camada transitória 7). Este processo, denominado divisão preplate, é um evento fundamental para o crescimento futuro do córtex cerebral 8.
Muitas mutações genéticas foram identificadas que interromper vários aspectos do desenvolvimento cortical 9. Desenvolvimento cortical também pode ser impactado negativamente pela exposição a toxinas ingeridas como a cocaína e álcool 10 11. Porque malformações corticais que surgem durante o desenvolvimento provavelmente contribui para distúrbios neurológicos (por exemplo, autismo, esquizofrenia), as investigações empíricas de perturbações do desenvolvimento cortical são inerentesly importante. É, portanto, de grande importância para delinear estratégias para estudar o desenvolvimento cortical que permitem testes rápidos de efeitos genéticos ou toxina, mas que também preservar as possíveis interações entre os neurônios de diferenciação, outros tipos de células e da matriz extracelular (ECM) durante esse período inicial do desenvolvimento do cérebro 12 .
Explantes de fatia 13 ter fornecido um tal sistema e têm sido amplamente utilizados para o desenvolvimento do ensaio neurónio cortical 14-16. No entanto, ensaios de fatias podem sofrer da desvantagem de que a migração neuronal e laminação pode ser anormal 17 possivelmente devido a danos nas células meníngeas que rodeiam o cérebro em desenvolvimento e ancorar o andaime glial radial. Como radiais fibras gliais são um importante substrato para cortical neurônio interrupção da migração de 18 a lâmina basal por corte pode perturbar localmente arquitetura radial glial e levar a migração cortical alterada. Além disso, a sliced superfícies de explantes proporciona uma região de células mortas, que podem alterar a composição normal do ECM nestas áreas.
Abordagens mais recentes têm focado sua análise sobre células localizadas no fundo da fatia que está cercado por adequadas tipos de células saudáveis e ECM. No entanto, em alguns casos, estas abordagens mais recentes podem requerer que a fatia de espessura original de cultura ser crio-seccionado ou parafina seccionado após a fixação, de modo que o interior relativamente normal da fatia é disponibilizada para análise 19-21. Ambos vibratome original seccionamento para preparar as fatias de tempo real para a cultura, bem como o subsequente cryosectioning de fatias fixos para análise requerem cuidados e esforço para estes ensaios para o trabalho.
Para fornecer uma abordagem simples e complementar para estudos do desenvolvimento cortical cedo, modificamos uma fatia abordagens existentes 13 para facilitar os estudos do desenvolvimento cortical cedo. Nós desenvolvemos uma whole modelo explante hemisfério semelhante a um modelo existente hemisfério E14 todo que envolveu culturas agitação em 65 rotações por minuto e permitiram o crescimento organotípica para 16-18 horas 22,23. Na nossa abordagem, explantes hemisfério inteiras são colocadas em membrana semi-permeável 13, com uma atmosfera de oxigénio de alta cultura 21,24 estender crescimento cortical organotípica durante 48 horas. Esta abordagem também permite a electroporação consistente de desenvolvimento de neurónios corticais. Os embriões são removidos do útero e electroporado para introduzir o ADN plasmídico e do telencéfalo é então dissecado. Cada hemisfério é isolado e colocado com o lado medial para baixo sobre um filtro revestido com colagénio. O explante é então cultivado durante um período de 48 horas, um período que abrange a divisão preplate 8. Durante o período de cultura, L6 neurônios desenvolvem a partir de precursor para neurónios diferenciados 25, posicionado correctamente no interior da placa cortical. Ao longo deste período, o desenvolvimentoneurónio é cercado pela ECM apropriada e tipos de células que se confrontar a célula correspondente in vivo. Este sistema já provou ser valioso para decifrar os eventos celulares que estão na base toxicidade do etanol 26, a camada de formação de 6 e preplate divisão 7,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Anteriores electroporações utero com expressão da proteína verde fluorescente plasmídeo
- Soluções para injecção de DNA de plasmídeo são preparados com CAG-eGFP DNA 27 diluído para a concentração de trabalho final de 0,33 mg / ml em DDH 2 O. Qiagen Endo-free Maxi-Preps são utilizadas para purificar o plasmídeo a partir de bactérias transformadas. Corante verde rápido a ~ 0,02% (w / v final) é adicionado à solução de DNA, como um marcador de injecção.
- Para preparar a área cirúrgica, spray para baixo bancada de trabalho e estágio estereomicroscópio com uma solução de etanol 70% e seque. Pulverizar uma tesoura cirúrgica e pinças com etanol 70% antes da dissecção e seque.
- Cronometrados grávidas suíços / Webster barragens são sacrificados no E13 por transferência para uma câmara cheia de CO 2 a partir de um cilindro pressurizado e a barragem é monitorizado até que todo o movimento parou, durante pelo menos 1 min. Após o sacrifício por inalação de CO2, os embriões são removidos do útero e colocados emde 10 cm de placa de Petri contendo gelada solução salina balanceada de Hanks (HBSS).
- Dissecar cuidadosamente cada embrião das membranas que envolvem extraembryonic e manter geladas HBSS.
- Transferir cada embrião individualmente para uma placa de 10 cm segundo Petri contendo HBSS frio. Use uma seringa Hamilton de injectar 2-3 ul da mistura de DNA rápido verde no ventrículo do hemisfério cerebral esquerdo, tendo o cuidado de injectar-se numa área cortical espacialmente separada da área cortical para análise futura.
- Para electroporate, mantenha o embrião suavemente com uma pinça e coloque a pá levemente positivo do eléctrodo de pinça sobre a linha média dorsal da cabeça e levemente coloque a pá negativa por baixo do queixo do embrião. Electroporações são conseguidos com um electroporador BTX830 programado para entregar cinco impulsos de 30 V de 50 ms de duração, separadas por intervalos de 950 mseg. Essas configurações são para o modelo BTX830. Outros sistemas podem ser utilizados de acordo com o fabricante INSTRUÇÕESns.
2. Preparação Explante todo Hemisfério
- Após a electroporação, os embriões são colocados de volta para gelados HBSS. O cérebro é removido usando duas pinças de joalheiro # 5 para remover a pele e crânio cartilaginoso a partir da cabeça do embrião. A pinça é então deslizado por debaixo do cérebro para remover o cérebro intacto do crânio. O hemisfério electroporated (à esquerda) é, em seguida, dissecado a partir do tecido cerebral e do cérebro médio em anexo é removido. Durante todo o cuidado é tomado procedimento de dissecção para não danificar as meninges que recobrem o hemisfério esquerdo cortical.
- Uma vez que cada dissecados de embriões são transferidos em HBSS, utilizando uma pipeta de 1 ml com uma ponta de pipeta de corte. O hemisfério é expelido suavemente para uma inserção de cultura de colagénio revestida. Até seis explantes hemisfério são dispostos lado medial para baixo em cada pastilha de 24 mm. Uma vez dispostos, HBSS excesso é removido da pastilha e a pastilha é então colocada em um poço de 35 milímetros de um prato de 6 poços. O poço contém exactly 2,7 mL de meio: DMEM-F12 meios contendo Glutamax e suplementado com 2% de B-27, 1% G5 e 1% de Penicilina-Strep. Algumas gotas de meios de comunicação a partir do poço pode ser pipetado em cima de cada explante, mas não se adicione o meio em excesso do original de 2,7 mL por poço.
- Uma vez que os explantes foram colocados em filtros de colagénio do prato de 6 poços contendo os explantes são colocados em um Rothenberg Billups (BR) câmara (que também contém um prato de humidificação com água). A 95% / 5% de oxigénio / CO mistura de gás 2 é injetado na câmara durante pelo menos 1 min antes de selar a câmara fechada e desconectar a 95% / 5% de oxigénio / CO 2 do tubo de abastecimento de gás. A câmara de BR é então colocado a 37 ° C de cultura de tecidos incubadora durante o resto do período de cultura, 1-2 DIV.
3. Fixação de explante para Histologia
- Numa hotte preparar a solução de fixação Pagano pelo primeiro g 8 solubilizante de paraformaldeído em 100 ml de pré-aquecido (~ 80 & deg; C) DDH 2 O. Adicionar 1-3 gotas de NaOH concentrada para promover a solubilização e agitar suavemente. Uma vez solubilizados misturar a solução de paraformaldeído a 8% de 1:1 com uma solução que é de 500 mM de sacarose, 100 mM de Hepes, pH 7,4, 50 mM de MgCl2, 5 mM de KCl para uma concentração final de 4% de paraformaldeído em 250 mM Hepes 50 mM de sacarose , 25 mM de MgCl2, 2,5 mM de KCl, pH 7,4.
- Para corrigir os explantes aquecer a solução fix Pagano e 37 ° C. Remover rapidamente a maior parte dos meios DMEM/F12 de cada poço de cultura e adicionam-se 5 ml de Fix Pagano a cada poço de explantes. Certifique-se de cobrir cada explante completamente na correção. Fixar durante 1 h à RT. Não remova explantes de filtro antes de 1 hora da fixação.
- Depois de remover a solução de fixação fix Pagano e substituir com Pagano solução sem correcção (250 mM de sacarose 50 mM de Hepes, 25 mM MgCl2, 2,5 mM de KCl, pH 7,4). Adicionar algumas gotas de azida de sódio a 10% e armazenar a 4 ° C até que a incorporação.
4. Incorporação e Sectioning para Histologia
- Prepara-se uma solução de 10% de pele de vitela por solubilização de gelatina 10 g de gelatina de pele de vitelo em 100 ml de água quente (55-60 ° C). Colocar em solução de gelatina a uma placa quente a 60 ° C e periodicamente redemoinho até solubilizado.
- Verter cerca de 10 ml da solução de gelatina a 10% na parte inferior de uma placa de 10 cm de Petri e deixar 30 minutos para solidificar. Isto irá formar um "pad" para a incorporação de explantes. Estas almofadas podem ser preparadas com antecedência dias e armazenado a 4 ° C. Use uma régua para desenhar uma grelha no fundo da placa de Petri e transferir explantes individuais em cada caixa da grelha. Remover a solução residual Pagano e utilizando um pipetador, cobrir cada explante, com solução a 10% de gelatina quente e deixa-se solidificar. Retomar a adição lenta de uma solução de gelatina, até que cada explante é completamente rodeado por gelatina, tomando cuidado para não derreter a almofada por meio da adição de um excesso de aquecer a gelatina de uma só vez. Permitir a gelatina para endurecer por ~ 1 hora. Uma vez endureceu o indiviexplantes ual pode ser cortado em pequenos blocos de gelatina. Os blocos são pós-fixados em Pagano fixar por 24-48 horas antes da corte com uma vibratome.
- Explantes em blocos de gelatina são posicionados bulbo olfatório-se e seccionadas no plano coronal em 100 um de espessura. As secções são recolhidas e armazenadas em PBS + azida de sódio a 0,1% a 4 ° C até processamento imunohistoquímico.
- Detecção imuno-histoquímica é realizada através da transferência de pontos para uma placa de 24 poços (2-3 pontos por poço). Primeiro bloco de anticorpo de ligação não específica por adição de 0,5 ml de PBST + B (PBS + 0,5% de Triton X 100 e 2% de BSA) a cada um, bem incubar 1 hora com agitação suave. O anticorpo primário apropriado é então diluído em PBST + B e 0,4 ml por poço é adicionado por incubação durante a noite à temperatura ambiente. O primário é lavada com PBS 3X lavagens, pelo menos, 10 min cada. O anticorpo secundário e 2 ug / ml de Hoechst 33342 mancha nuclear são então diluídas em PBST + B e as amostras são incubadas durante 2 h à RTcom agitação suave. Três lavagens de PBS (10 min cada) são executados e em seguida, as secções são montadas em lâminas com um 90% de glicerol a 50 mM Tris, pH 7,4, meios de montagem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O roedor córtex embrionário apresenta um gradiente neurogenético transversal ao longo do período de desenvolvimento, tais neocórtex que lateral é aproximadamente 1 dia mais maduro do que neocórtex dorsal medial 28. A maior parte da camada 6 neurónios são assim gerado (isto é, exibem a sua última fase S) na E12 no córtex lateral (também chamado Campo 40 5) e em E13 no córtex medial dorsal (também chamado campo 1 5). Dividindo Preplate começa aproximadamente 1 dia após geração neurónio da camada 6 e, portanto, é iniciada na cortical lateral no E13 e o córtex dorsal em E14. Para estudar a divisão preplate e a iniciação do desenvolvimento de placa cortical, modificamos um ensaio de explante fatia 21,24 de tal forma que todo hemisférios cerebrais foram cultivadas tipicamente a partir de E13 a E15 (Figura 1).
Foi testada a viabilidade da técnica de explante cortical através da análise do crescimento de explantes hemisfério inteiros derived de ratinhos Tg (Eomes :: eGFP) GSAT (Figura 2). Esta estirpe mouse contém um transgene que relata neurônios imaturos da linhagem de excitação cortical 7,29,30. Explantes hemisfério inteiros corticais foram preparadas em E13, em um ponto de tempo antes da separação preplate no neocórtex dorsal (Figura 2A). Explantes corticais da mesma ninhada foram fixados sequencialmente gota ao longo de um período de 2 DIV e processados para análise histológica subsequente. No ponto inicial de análise de tempo (DIV 0), dividindo preplate ainda não ocorreu no Campo 1 (neocórtex dorsal; Figuras 2A, 2E). Por um DIV a CP é aparente (Figuras 2B, 2C, 2F, 2G), e continua a crescer até 2 DIV (Figuras 2D, 2H). Assim, os explantes hemisfério inteiro cultivadas inicialmente em E13 suporte para dois dias, a maturação do córtex cerebral e captura divisão preplate no neocórtex dorsal.
Para confirmar a normaal desenvolvimento histológica no neocórtex dorsal, nós imunocoradas dois explantes DIV para os proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPGs), um componente da matriz extracelular que é também um marcador estabelecido de PP e os seus derivados e o MZ SP 8,31,32. A imunocoloração para CSPGs revela duas bandas de imunorreactividade CSPG no córtex dorsal, indicando a divisão apropriada da PP em MZ e SP durante o período de cultura in vitro (Figuras 3A-3C). O PP é dividido por L6 neurónios corticais que são conhecidas por expressar os factores de transcrição e Ctip2 Tbr1 7,33,34. O padrão de coloração imunológica destes marcadores (Figuras 3D-3F, 3G-I, respectivamente), confirma a expressão apropriada destes factores de transcrição no CP recém-formado. Juntas, estas análises confirmam desenvolvimento precoce organotípica cortical em explantes hemisfério inteiro.
In utero electroporações têm sido usados extensivamentede ensaio para a função das células gene autónoma no córtex desenvolvimento 35. Por isso, testamos se eletroporação conseguiram transfectar neurônios em todo o modelo hemisfério explante. O ventrículo esquerdo intactas E13 embriões foram injectados com 0,33 mg / ml de CAG-GFP e electroporated plasmídeo (ver Métodos) para introduzir o ADN plasmídico em precursores neuronais que a linha do ventrículo lateral (Figura 1A). Após 2 DIV explantes foram retiradas fixa e seccionados para análise histológica. Neste ponto de tempo, as células que expressam GFP foram observados em todas as zonas corticais em toda a parede cerebral (Figuras 4A-4C). Expressão da GFP pode ser observada a partir de precursores neuronais no VZ, enquanto as células que expressam GFP intensos foram observados no IZ e CP. É importante notar que numerosos neurónios GFP + foram observados no topo da formação de CP com dendrites e axónios emergentes. As células formam uma camada discreta na interface entre o CP e indicatin MZg prisão migração adequada e laminação (Figuras 4A-4C, as setas). Os dendritos estendido para a MZ enquanto os axônios corticofugal estender abaixo da CP e no IZ (Figuras 4A-4C e 5, ver também S1 filme Suplementar). Abaixo as células de diferenciação são GFP + células em diversos estados de maturidade, incluindo neurônios com uma morfologia bipolar, justaposta radiais fibras gliais e abaixo deles, os neurônios multipolares no IZ (Figuras 4D 4F). Além disso, os dendritos são observados estendendo-se para o MZ onde a proteína Reelin ECM é apropriadamente immunolocalized (Figuras 4G-4I). As condições de eletroporação e explante assim permitir o desenvolvimento normal de neurônios corticais através dos estágios de precursor para a migração de neurônio para neurônio diferenciar imaturo.
No momento da electroporação (E13) 100% dos neurónios produzidos pelos VZ neocorticais dorsais são L6 neurónios, os neuróniosque dividiu o 5 PP. Electroporação bem sucedida requer que os constructos ser introduzido para dentro dos neurónios, durante 6 horas a imediatamente antes de, ou durante, fase M do ciclo celular 36. Assim, é esperado que a primeira pós-mitóticas, GFP + E13 neurónios após a electroporação no córtex dorsal (campo 1) devem preencher o CP de conformação. Tais neurónios foram observados (Figura 4), indicando que o protocolo pode fiavelmente alvo L6 neurónios corticais para os estudos da sua migração e maturação.
Para estimar a "taxa de sucesso" do processo de eletroporação / explante analisamos uma investigação em curso do nosso laboratório. No decurso do estudo, 21 litros de explantes foram preparados, de um total de 248 embriões foram electroporadas (como descrito acima) com o CAG-GFP, e um explante hemisfério de cada embrião foi preparado. Dos explantes originais 248, 195 (79%) foram considerados adequados para a imagiologia e análise. Cerca de metade dos 53explantes que não puderam ser analisados não conseguiu expressar a GFP ou teve mis-alvo a expressão da GFP. As perdas restantes foram explicados pelo crescimento dismórfico devido a explantar desapego do filtro de cultura, ou problemas relacionados ao processamento histológico. Esta taxa de sucesso de aproximadamente 80% (Figura 5) tem tornado o sistema explante apropriado para estudos farmacológicos 26, bem como a análise de mutações recessivas 7 que afectam negativamente o desenvolvimento cortical precoce.
Figura 1. Procedimento explante todo hemisfério com eletroporação utero ex. A) E13 embriões de ratos são injectados com uma solução de ADN plasmídico e electroporadas. Os cérebros são dissecados e seccionados sagitalmente. O electroporatedhemisfério são então colocados lado medial para baixo sobre um filtro revestido de colagénio e cultivadas durante 2 DIV. Os hemisférios pode então ser trabalhada ao vivo ou fixado para histologia e a análise de imagem subsequente. B) Uma foto de 10 explantes colocados em três filtros em um prato de cultura de tecido de seis bem. C) O prato seis bem com explantes é colocado numa atmosfera de oxigénio de alta (95% O% 2/5 CO 2) no interior de um Billups-Rothenberg Incubadora de câmara, a qual é então colocada num padrão de 37 ° C de cultura de tecidos incubadora.
Figura 2. Crescimento organotípicas de placa cortical em explantes hemisfério inteiras derivadas de uma única ninhada de Eomes :: embriões EGFP. A, E) A secção coronal do cérebro de uma gota-fixo, no início do culto período ure (O DIV). Note-se que o PP está presente, mas que ainda tem de CP formar. O sinal verde é produzida por expressão da GFP em neurónios imaturos excitatórios e ao azul é corante Hoechst que rotula o núcleo de todas as células. B, F). Crescimento CP, indicado por linhas a traço interrompido, é observada em 0,5 DIV e aumenta de 1 DIV (C e G) e 2 DIV (painéis D e H). Note o aumento da espessura da GFP expressando domínio célula em AD painéis, indicando a proliferação e diferenciação da linhagem neuronal excitatória no explante. Barras de escala são 500 mm (painel A) e 50 | iM (painel H). Abreviaturas: CP, placa cortical; IZ, zona intermédia; MZ, Zona Marginal; SP, sobre placa; VZ, Zona ventricular.
/ 50271/50271fig3.jpg "/>
Figura 3. Dividindo Preplate em explantes do hemisfério total. AC) de sulfato de condroitina proteoglicano imunomarcação (CSPG) ilustra a divisão (splitting) do PP no MZ e SP. DF) Expressão do factor de transcrição Ctip2 no CP recém-formado. GI) Expressão do Tbr1 fator de transcrição na CP recém-formado. Barras de escala são 50 um nos painéis C, F, I.
Figura 4. Expressão da GFP em explantes hemisfério inteiras após a electroporação E13 utero ex. AC) expressão GFP após 2 DIV. Note-se a camada de neurónios corticais que constituem a parte superior da CP (setas). DF) nestina (vermelho) immunoreactivdade de uma secção de um explante hemisfério todo. GH) Reelin imunoreactividade (vermelho) numa secção derivada de um explante hemisfério todo. Barras de escala nos painéis C, F e I são 50 um.
Figura 5. Variabilidade na segmentação electroporações utero ex para córtex medial dorsal (campo 1). Onze embriões a partir de uma única ninhada foram electroporadas com o CAG-GFP expressão construto (0,33 mg / ml) e cultivados como explantes hemisfério inteiras. AI) Nove dos 11 explantes mostrou expressão da GFP no córtex medial dorsal. Embora a expressão da GFP varia entre explantes, em cada explante GFP é detectada em todas as três zonas corticais (isto é, VZ, IZ e CP). Barra de escala é 50 mm no painel A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Temos melhorado e avaliadas num modelo experimental - explantes hemisfério inteiros - para o estudo do desenvolvimento cortical precoce (E13-E15). O modelo mostrou-se útil para a análise de migração e diferenciação da linhagem neuronal excitatória que constitui a camada 6 do córtex cerebral 25,37. As principais vantagens do sistema são: 1) crescimento organotípica DIV para 2, 2) simplicidade de preparação, e 3) o acesso aos neurónios experimental para a manipulação de electroporação, farmacológicas e de imagem durante este período, crítica precoce do desenvolvimento do cérebro. Temos utilizado o sistema para documentar diferenças sutis na morfologia, orientação e crescimento dendrítico da camada 6 neurônios corticais 7,38 durante o período de dividir preplate.
Os neurônios excitatórios que povoam camada 6 são em grande parte composto por neurônios de projeção corticothalamic que proporcionam entrada de reciprocidade para o tálamo dorsal 39,40 41. Embora estes neurónios são fisiologicamente especializado, o processo de migração, geração e maturação dos neurónios da camada 6 partes características básicas com todos os neurónios excitatórios em camadas 2-6 do córtex. Especificamente, todos os neurónios corticais excitatórios são gerados no VZ dorsal telencefálica, migram através do IZ como neurónios multipolares e diferenciar dentro do 7 CP. A maturação dos neurónios corticais excitatórios é impulsionada por um conjunto central de factores de transcrição expressados sequencialmente: PAX6, Tbr2 e Tbr1 29. Esta seqüência é compartilhada por todos os neurônios excitatórios em camadas 2-6 42 e foi confirmada a expressão adequada de Tbr1 na CP recém-formado (Figuras 3G-3I). Utilizando esta abordagem para investigar o desenvolvimento da camada 6 neurónios corticais deve, assim, fornecer informações essenciais para o desenvolvimento da neunios que constituem todas as camadas corticais.
Explantes hemisfério inteiro complementar as abordagens existentes para estudos de desenvolvimento de neurônios corticais. Estudos anteriores têm empregado uma abordagem explante E14 todo hemisfério para estudar o desenvolvimento cortical para uma DIV 22,23. Temos acoplado explantes hemisfério inteiros com eletroporação utero ex investigar 2 dias de desenvolvimento cortical durante o período de formação e divisão L6 preplate. Ao contrário do que electroporações útero na E13, a taxa de sucesso de electroporações utero ex seguido por explante hemisfério inteiro é maior: em nossas mãos conseguir ~ 80% de sucesso na segmentação eletroporação ao telencéfalo dorsal. Além disso, em electroporações útero exigem uma cirurgia de sobrevivência e tomar esforço consideravelmente mais técnico do que o todo abordagem utero hemisfério ex. Finalmente, em estudos in utero não são facilmente recuperáveis para farmacológica precisamanipulações e abordagens de imagem. Controlo temporal preciso na entrega ou a activação de drogas e agentes moleculares (vectores de expressão, as construções silenciadores, etc), a concentrações definidas é fornecido com os explantes hemisfério inteiros, mas é mais difícil de alcançar no útero. Vivo de monitorização óptica dos efeitos resultantes de tais manipulações, com resolução espacial na gama de micron, está prontamente disponível com EUEP, mas não IUEP. Tal precisão é provável que melhorar substancialmente o poder interpretativo dos dados coletados a partir de experimentos que envolvem o desenvolvimento cortical e função. Assim, para os estudos iniciais do desenvolvimento cortical explantes hemisfério inteiros possuem vantagens distintas sobre a abordagem experimental no útero. Neste momento, no entanto, para os estudos de neurônios corticais camada superior e experiências que requerem a coleta de dados> 48 horas, explantes fatia e em abordagens útero permanecer preferível.
Tem vários requisitos críticos para o sucesso de toda a técnica hemisfério explante. Em primeiro lugar, o crescimento do explante é altamente sensível para a integridade mecânica das meninges. Danos físicos para as meninges (furos ou seja, ou lágrimas) vai no mínimo perturbar o desenvolvimento local do córtex subjacente. Em segundo lugar, o crescimento do explante é sensível ao volume total do material no interior da cultura assim: com meios demasiado os explantes irá desengatar a partir do filtro e desenvolver arquitetura CP distorcida, com meios muito pequenos e os explantes são susceptíveis de desidratar e experimentar morte celular excessiva . Por fim, com os explantes técnica atual temos documentado crescimento cortical para 2 DIV. Ao iniciar a E13 esta janela de tempo de desenvolvimento, apesar de admitir muitas investigações valiosas, restringe a análise a um período anterior à sinaptogênese e comunicação neuronal canônico. Embora os neurónios corticais em E14.5 mRNAs que codificam proteínas expressas muitas sinápticas ("target =" _blank w.genepaint.org "www.genepaint.org>), sinaptogênese não começa até ~ E15 no córtex lateral, e este se limita a sinaptogênese preplate células, em vez de camada 6 neurônios 43. Algumas questões importantes relativas ao a formação de sinapses cortical e função são, por conseguinte, não está endereçável com o sistema como um todo hemisfério explante.
Em conclusão, a preparação do explante todo hemisfério pode ser usado de forma confiável e consistente para investigar o desenvolvimento cortical no início de modelos de ratos hereditárias malformações cerebrais. A técnica é facilmente adaptável para RNAi, shRNA, e outras manipulações moleculares e farmacológicas. O explante hemisfério inteiro é também adequado para estudos envolvendo aplicada proteína recombinante, drogas, toxinas ambientais.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado doações de NINDS (NS066071) e da NIAAA. (P50AA017823) para ECO. Os autores agradecem ao Dr. Robert Quinn e os funcionários do Departamento de Recursos Animais de Laboratório para cuidar dos animais. Agradecemos Judson Belmont para suporte técnico, Nicole Belletier de assistência como um pesquisador Verão Graduação (SURF). Agradecemos também o Dr. David Cameron para comentários e edições em uma versão anterior do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 + GlutaMAX | GIBCO | 10565 | |
| G5 Supplement 100X | Invitrogen | 17503-012 | |
| B27 Serum-Free Suppl. 50X | Invitrogen | 1504-044 | |
| Pen / Strep Liquid 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| HBSS 500 ml | GIBCO | 14025 | |
| Culture insert collagen coated | Costar | 3492 | |
| Bovine skin gelatin | Sigma | G9382 | |
| H–chst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 7906 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Equipment | |||
| BTX 830 Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Tweezer electrodes 10mm | Harvard Apparatus | 450166 | |
| Incubator | Billups Rothenberg | MIC-101 | |
| Hamilton syringe (5uL) | Hamilton | 87930 | |
| Hamilton syringe needle | Hamilton | 7803-04 | Specify 1" and style 4 |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11251-10 | |
| Fine Scissors Tough Cut 9 cm | FST | 14058-09 |
References
- Rakic, P. Principles of neural cell migration. Experientia. 46, 882-891 (1990).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J. Neurosci. 23, 9996-10001 (2003).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat. Neurosci. , (2004).
- Olson, E. C., Kim, S., Walsh, C. A. Impaired neuronal positioning and dendritogenesis in the neocortex after cell-autonomous Dab1 suppression. J. Neurosci. 26, 1767-1775 (2006).
- Takahashi, T., Goto, T., Miyama, S., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. Sequence of neuron origin and neocortical laminar fate: relation to cell cycle of origin in the developing murine cerebral wall. J. Neurosci. 19, 10357-10371 (1999).
- Marin-Padilla, M. Early prenatal ontogenesis of the cerebral cortex (neocortex) of the cat (Felis domestica). A Golgi study. I. The primordial neocortical organization. Z. Anat. Entwicklungsgesch. 134, 117-145 (1971).
- Nichols, A. J., Olson, E. C. Reelin promotes neuronal orientation and dendritogenesis during preplate splitting. Cerebral Cortex. 20, 2213-2223 (2010).
- Sheppard, A. M., Pearlman, A. L. Abnormal reorganization of preplate neurons and their associated extracellular matrix: an early manifestation of altered neocortical development in the reeler mutant mouse. J. Comp. Neurol. 378, 173-179 (1997).
- Manzini, M. C., Walsh, C. A. What disorders of cortical development tell us about the cortex: one plus one does not always make two. Current Opinion in Genetics & Development. 21, 333-339 (2011).
- Jones, L., Fischer, I., Levitt, P. Nonuniform alteration of dendritic development in the cerebral cortex following prenatal cocaine exposure. Cereb. Cortex. 6, 431-445 (1996).
- Olney, J. W. Fetal alcohol syndrome at the cellular level. Addict. Biol. 9, 137-149 (2004).
- Levitt, P., Reinoso, B., Jones, L. The critical impact of early cellular environment on neuronal development. Prev. Med. 27, 180-183 (1998).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
- O'Rourke, N. A., Dailey, M. E., Smith, S. J., McConnell, S. K. Diverse migratory pathways in the developing cerebral cortex. Science. 258, 299-302 (1992).
- Elias, L. A., Wang, D. D., Kriegstein, A. R. Gap junction adhesion is necessary for radial migration in the neocortex. Nature. 448, 901-907 (2007).
- Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Muller, U. Reelin regulates cadherin function via Dab1/Rap1 to control neuronal migration and lamination in the neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
- Gotz, M., Bolz, J. Formation and preservation of cortical layers in slice cultures. J. Neurobiol. 23, 783-802 (1992).
- Cameron, R. S., Rakic, P. Identification of membrane proteins that comprise the plasmalemmal junction between migrating neurons and radial glial cells. J Neurosci. 14, 3139-3155 (1994).
- Lizarraga, S. B., Coser, K. R., Sabbagh, M., Morrow, E. M. Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex. J. Vis. Exp. (63), e3621 (2012).
- Jossin, Y., Goffinet, A. M. Reelin signals through phosphatidylinositol 3-kinase and Akt to control cortical development and through mTor to regulate dendritic growth. Mol. Cell Biol. 27, 7113-7124 (2007).
- Jossin, Y., Ogawa, M., Metin, C., Tissir, F., Goffinet, A. M. Inhibition of SRC family kinases and non-classical protein kinases C induce a reeler-like malformation of cortical plate development. J. Neurosci. 23, 9953-9959 (2003).
- Kingsbury, M. A., Rehen, S. K., Contos, J. J., Higgins, C. M., Chun, J. Non-proliferative effects of lysophosphatidic acid enhance cortical growth and folding. Nat. Neurosci. 6, 1292-1299 (2003).
- Rehen, S. K., et al. A new method of embryonic culture for assessing global changes in brain organization. J. Neurosci. Methods. 158, 100-108 (2006).
- Jossin, Y., et al. The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 24, 514-521 (2004).
- O'Dell, R. S., et al. Layer 6 cortical neurons require Reelin-Dab1 signaling for cellular orientation, Golgi deployment, and directed neurite growth into the marginal zone. Neural. Dev. 7, 25 (2012).
- Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ethanol-induced disruption of Golgi apparatus morphology, primary neurite number and cellular orientation in developing cortical neurons. Alcohol. , (2012).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 16-22 (2004).
- Suter, B., Nowakowski, R. S., Bhide, P. G., Caviness, V. S. Navigating neocortical neurogenesis and neuronal specification: a positional information system encoded by neurogenetic gradients. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of The Society for Neuroscience. 27, 10777-10784 (2007).
- Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. J. Neurosci. 25, 247-251 (2005).
- Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo. Genesis. 45, 208-217 (2007).
- Pearlman, A. L., Sheppard, A. M. Extracellular matrix in early cortical development. Prog. Brain Res. 108, 117-134 (1996).
- Milev, P., et al. Differential regulation of expression of hyaluronan-binding proteoglycans in developing brain: aggrecan, versican, neurocan, and brevican. Biochemical and Biophysical Research Communications. 247, 207-212 (1998).
- Kwan, K. Y., et al. SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 16021-16026 (2008).
- McKenna, W. L., et al. Tbr1 and Fezf2 regulate alternate corticofugal neuronal identities during neocortical development. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 549-564 (2011).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J. Neurosci. 30, 7028-7036 (2010).
- Powrozek, T. A., Zhou, F. C. Effects of prenatal alcohol exposure on the development of the vibrissal somatosensory cortical barrel network. Brain Res. Dev. Brain Res. 155, 135-146 (2005).
- O'Dell, R., et al. Society for Neuroscience. , Washington D.C. (2011).
- Tombol, T., Hajdu, F., Somogyi, G. Identification of the Golgi picture of the layer VI cortic-geniculate projection neurons. Experimental Brain Research. Experimentelle Hirnforschung. Experimentation Cerebrale. 24, 107-110 (1975).
- Brumberg, J. C., Hamzei-Sichani, F., Yuste, R. Morphological and physiological characterization of layer VI corticofugal neurons of mouse primary visual cortex. Journal of Neurophysiology. 89, 2854-2867 (2003).
- Jones, E. G. Synchrony in the interconnected circuitry of the thalamus and cerebral cortex. Annals of the New York Academy of Sciences. 1157, 10-23 (2009).
- Kowalczyk, T., et al. Intermediate Neuronal Progenitors (Basal Progenitors) Produce Pyramidal-Projection Neurons for All Layers of Cerebral Cortex. Cereb. Cortex. , (2009).
- Konig, N., Roch, G., Marty, R. The onset of synaptogenesis in rat temporal cortex. Anatomy and Embryology. 148, 73-87 (1975).
