Summary
Lokalisering og fordeling af proteiner giver vigtige oplysninger for at forstå deres cellulære funktioner. Den overlegne rumlig opløsning af elektronmikroskopi (EM) kan anvendes til at bestemme den subcellulære lokalisering af et givet antigen efter immunohistokemi. Til væv i centralnervesystemet (CNS), at bevare strukturel integritet under opretholdelse af antigenicitet er særlig vanskeligt i EM-studier. Her, vælger vi en fremgangsmåde, der har været anvendt til at bevare strukturer og antigener i CNS til undersøgelse og karakterisering af synaptiske proteiner i rotte-hippocampale CA1 pyramidale neuroner.
Abstract
Immunoelektronmikroskopi er et kraftfuldt værktøj til at studere biologiske molekyler på det subcellulære niveau. Antistoffer koblet til elektrontætte markører såsom kolloidalt guld kan afsløre lokaliseringen og fordelingen af specifikke antigener i forskellige væv 1. De to mest anvendte teknikker er før indlejring og efter indlejring teknikker. I præ-indlejring immunogold-elektronmikroskopi (EM) teknikker, skal vævet permeabiliseres for at tillade antistof penetration før det er indlejret. Disse teknikker er ideelle til konservering strukturer, men dårlig penetration af antistoffet (ofte kun de første få mikrometer) er en væsentlig ulempe 2. De post-indlejring mærkningsmetoder kan undgå dette problem, fordi mærkningen finder sted på sektioner af faste væv, hvor antigener er mere let tilgængelige. I årenes løb er et antal modifikationer forbedret efter indlejring metoder til at øge immunreaktivitet og bevare ultrastruktur Vævsfiksering er en afgørende del af EM undersøgelser. Fikseringsmidler kemisk tværbinde makromolekylerne at låse vævsstrukturer på plads. Valget af fixativ påvirker ikke kun strukturel konservering, men også antigenicitet og kontrast. Osmiumtetroxid (OSO 4), formaldehyd og glutaraldehyd har været standard fiksativer i årtier, herunder for det centrale nervesystem (CNS) væv, der er særlig tilbøjelige til strukturelle skader i løbet af kemisk og fysisk behandling. Desværre er OSO 4 er meget reaktiv og har vist sig at maskere antigener 6, hvilket resulterer i dårlig og utilstrækkelig mærkning. Alternative metoder til at undgå kemisk fiksering omfatte frysning af væv. Men disse teknikker er vanskelige at udføre og kræver dyre instrumenter. For at løse nogle af disse problemer og forbedre CNS-væv mærkning, Phend et al. erstattet OSO 4 med uranylacetat (UA) og garvesyre ACId (TA), og med held indført yderligere ændringer for at forbedre følsomheden af påvisning af antigen og strukturel bevarelse i hjerne og rygmarv væv 7. Vi har vedtaget denne osmium-fri post-embedding metode til at rotte hjernevæv og optimeret immunogold mærkning teknik til at opdage og studere synaptiske proteiner. Vi præsenterer her en fremgangsmåde til bestemmelse af ultrastrukturelle lokalisering af synaptiske proteiner i rotte-hippocampale CA1 pyramidale neuroner. Vi bruger organotypiske hippocampal dyrkede skiver. Disse skiver bevare trisynaptic kredsløb i hippocampus, og er således særligt anvendelige til at studere synaptisk plasticitet, en mekanisme bredt menes at ligge til grund for indlæring og hukommelse. Organotypiske hippocampale snit fra postnatal dag 5 og 6 mus / rotteunger kan fremstilles som beskrevet tidligere 8, og er især nyttige til akut knockdown eller overudtrykker exogene proteiner. Vi har tidligere brugt denne protokol til characterize neurogranin (Ng), et neuron-specifikt protein med en kritisk rolle i reguleringen af synaptiske funktion 8,9. Vi har også anvendt den til at karakterisere den ultrastrukturelle lokalisering af calmodulin (CaM) og Ca2 + / CaM-afhængige proteinkinase II (CaMKII) 10. Som illustreret i de resultater, denne protokol giver mulighed for god ultrastrukturelle bevarelse af dendritiske Torner og effektiv mærkning af Ng at hjælpe karakterisere sin distribution i ryggen 8. Endvidere kan denne fremgangsmåde, har bred anvendelighed i at studere mange andre proteiner involveret i neuronale funktioner.
Protocol
1. Fiksering
Fikseringsmidler er kræftfremkaldende, handsker og håndtere fiksativer i et stinkskab. Medmindre andet er bemærket, er alle inkubationer udført på is, og alle opløsninger skal filtreres inden brugen. Anvender elektron-mikroskopi-reagenser.
Dag 1
- Efter forsøgsbetingelser (fx viral injektion, lægemiddelbehandling), anbringes membranen med organotypiske hippocampusskiver i en 60 x 15 mm polystyren petriskål indeholdende iskold 0,1 M phosphatbuffer (Sorensens phosphatpuffer), pH 7,3. Tilsættes fra 1 til 2 ml 0,1 M phosphatpuffer direkte oven på skiverne til at holde dem kolde.
Afgørende skridt: Brug altid frisk tilberedte buffere og fikseringsmidler. Kontroller, at pH af pufferen er inden for det ønskede område. En undladelse af at gøre dette kan beskadige cellulære strukturer.
- Til isolering af CA1 underfelt af skiven, skal du bruge enengangs skalpel til forsigtigt tværs udsnittet ud for GD, parallelt med CA1 cellelag (figur 1). Derefter skæres den resterende skive lodret til fjernelse af CA3 subfelt og subiculum. Skær et hjørne af skive til at identificere den øvre overflade af vævet.
BEMÆRK: Hvis der ikke viralt levering af protein af interesse er påkrævet, kan hele væv skive fastsættes, når mediet fjernes med en blid skyl iskold buffer. Dette efterfølges af udskæring af CA1.
Afgørende skridt: Hold styr på oversiden af væv, for korrekt inddeling af nettene senere.
- Fjern forsigtigt væv fra membranen under anvendelse af bagsiden af skalpellen. Anvend en Pasteur-pipette til forsigtigt at overføre vævet til en plade med 12 brønde indeholdende 0,1 M phosphatbuffer.
- Fjern puffer i brønden fra pladen, og der tilsættes 500 & mu, l - 1 ml iskold fikseringsvæske (pH 7,3) bestående af følgende: 0,1% picrinsyre, 1% paraformaldehyd og 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M phosphatpuffer. Der inkuberes i 2 timer ved 4 ° C.
BEMÆRK: Picrinsyre kan være eksplosive, når tør. Hold det befugtet med vand i en beholder tæt lukket. Opbevares på et tørt og godt ventileret sted.
- Fjern fiksermiddel fra brønden og vask prøverne 3 gange (20 minutter hver) i 0,1 M phosphatbuffer.
- Inkuber i 40 minutter i 1% garvesyre (vægt / volumen) i 0,1 M maleat-puffer, pH 6,0.
- Skylles to gange (20 minutter hver) i maleat-puffer.
- Inkuber i 40 minutter i 1% uranylacetat (vægt / vol) i maleat-puffer i mørke. Uranylacetat er følsom over for lys og er radioaktivt. Bægerglasset dækkes med Parafilm ved opløsningen og gemme ubrugt buffer i mørke ved 4 ° C.
- Skylles to gange (20 minutter hver) i maleat-puffer.
- Inkuber i 20 minutter i 0,5% platin kloride (vægt / vol) i maleat-puffer.
- Skylles to gange (20 minutter hver) i maleat-puffer. Opbevare prøverne ved 4 ° C indtil de er klar til yderligere bearbejdning.
2. Dehydrering og Embedding
Propylenoxid er kræftfremkaldende. Undgå dampe ved at arbejde med det i et stinkskab. Anvende absolut, 100% ren ethanol, som indeholder spor af vand. Fortynd denne absolut ethanol for at producere forskellige koncentrationer for dehydrering.
Dag 2
- Inkuber i 5 minutter i 50% ethanol og derefter i 5 minutter i 70% ethanol.
- Inkubér i 15 min i frisk fremstillet 1% p-phenylendiamin (PPD) i 70% ethanol.
- Skylles tre gange i 70% ethanol.
- Inkuber i 5 minutter i 80% ethanol og derefter i 5 minutter i 95% ethanol.
- Inkuber i 100% ethanol to gange 5 minutter hver.
- Forbered hætteglas med skruelåg og sørg for at de er rene og helt tørre. Overføre skiver til hætteglas ogmærke hvert hætteglas enkelt og klart.
- Inkuber i 5 minutter i 1:1 ethanol: propylenoxid.
- Inkuber i 100% propylenoxid to gange 5 minutter hver.
- Tilføj resin (Epon) til hvert hætteglas til at gøre en 1:1-blanding med propylenoxid. Bland forsigtigt i 2 timer. Ryst ikke hætteglassene for strengt for at forhindre bobler, der kan forstyrre indlejring.
- Læg harpiksen for at frembringe en 3:1-blanding med propylenoxid, og der blandes i 2 timer.
- Overførsel til 100% harpiks og inkuberes O / N.
Dag 3
- Sandwich prøver mellem strimler af ACLAR plast og hærdning i 24 timer ved 60 ° C.
3. Sektionering og Montage på Grids
Dag 4
- Skær semi-tynde (0,5 um) sektioner og plette med 1% toluidinblåt + 1% borax at bestemme den korrekte orientering af prøver.
- Skær ultratynde sektioner (60 nm) og montere på nikkel gitre, én sektion pr gitter.
4. Immunhistokemi
Alle buffere og vand skal filtreres før brug.
Dag 5
- Anbring en dråbe (ca. 50 ul) af 1% Tween-20/phosphate puffer (T / PB), pH 7,5, på et stykke rent Parafilm på en flad overflade. Forsigtigt opfanger nettet med rene pincet ved kanten og flyde den på puffer, sektion ned, og der inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Dræne overskydende væske fra nettet ved at anbringe sektionen opad på filtrerpapir og derefter flyde på 50 mM glycin i T / PB i 15 minutter ved stuetemperatur.
Afgørende skridt: For at undgå overdreven "carry-over" af løsninger fra én løsning dråbe til den næste i løbet af inkubationer overskydende væske dryppe ved forsigtigt at røre kanten af nettet på # 1 filterpapir mellem hver løsning ændring. Også fjerne enhver løsning fanget mellem armene på EM tangen holder gitteret ved forsigtigt vægevirkning med en splint af filterpapir mellem pincet arme, mens ensuring sektionerne ikke tørre helt ud.
- Tør gitteret med filtrerpapir og derefter flyde på blokeringsopløsning indeholdende 2,5% BSA og 2,5% serum fra dyret af det sekundære antistof i T / PB i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Inkuber med primært antistof (i T / PB) ved stuetemperatur eller O / N ved 4 ° C. Den optimale tid og temperatur af inkubation såvel som antistofkoncentration, skal bestemmes eksperimentelt.
- Vask gitteret tre gange (2 min hver) med T / PB.
- Inkuber med sekundært antistof (1:20 anti-kanin eller anti-mus koblet til 10 nm guld) i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask tre gange (2 min hver) med T / PB.
- Postfix med 2% glutaraldehyd i T / PB i 5 minutter.
- Vask tre gange (2 min hver) med T / PB og derefter tre gange (2 min hver) med filtreret vand.
- Inkuberes med 2% uranylacetat i vand i 10 minutter.
Når nettet farvning, forberede en CO 2-fri kammer ved placinga stykke Parafilm i centrum af en glas-petriskål. Derefter placere 4-6 piller af NaOH i skålen omkring Parafilm til at absorbere CO 2 i luften. Holde toppen lukket i et par minutter. Anvend en Pasteur-pipette og hurtigt overføre et lille volumen Reynolds blycitrat løsning på Parafilm i glasset petriskålen. Åbne toppen lige nok til at indsætte Pasteur-pipette for at minimere genindførelse af CO2 ind i kammeret.
BEMÆRK: For at gøre Reynolds blycitrat løsning, koge 100 ml deioniseret vand i en mikrobølgeovn og lad afkøle i en lufttæt beholder. I en 50 ml målekolbe med prop, blandes 1,33 g blynitrat, 1,76 g natriumcitrat og 30 ml af kogt vand ved kraftig omrystning i 1 min. Derefter rystes med mellemrum i 30 min. Til denne uklare opløsning, 8 ml 1 M natriumhydroxid tilsættes og langsomt vende kolben et par gange. Løsning bliver klar. Bring opløsningen til 50 ml med den kogte waTer. Opløsningen opbevares tæt lukket. Hvis bundfald, kasseres og lave en ny.
- I tre mindre bægre forberede varm, friskkogt deioniseret vand. Vaske uranylacetat ved dypning nettet i det første bægerglas og omrystes forsigtigt den rundt i 30 sek. Gentag dette trin i de to andre bægre.
- Åbne toppen af glasset petriskål lige nok til at placere risten på dråbe Reynolds blycitrat opløsning. Hvis det er muligt, bære en maske, mens du gør dette for at undgå at trække vejret på blycitrat og at forhindre dannelse af bundfald. Inkuber i 10 minutter.
- Åbne toppen lige nok til at fjerne nettet. Undgå at indånde den blycitrat. Vask nettet tre gange ved at dyppe den sekventielt i tre bægre med varm, friskkogt destilleret vand. Lad gitteret tørre på et stykke filtrerpapir, afsnit op. Prøven er nu klar til den elektronmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2B viser et eksempel på fordelingen af endogene Ng molekyler i dendritiske spidser i CA1-hippocampale pyramidale neuroner. Nikkel net med ultratynde (60 nm) væv, der indeholder CA1-regionen af hippocampus (som det ses i figur 2A) blev dækket med 1% T / PB, 50 mM glycin, derefter blokeret med 2,5% BSA og 2,5% serum før inkubation med anti -Ng-antistof. Efter vask med T / PB, blev gitre derefter dækket med anti-kanin sekundært antistof koblet til 10 nm guld. Endelig blev gitre vasket med T / PB og postfikseret med 2% glutaraldehyd, efterfulgt af 2% uranylacetat og Reynolds blycitrat farvning for at forbedre kontrasten. Venstre, repræsentative elektronmikrofotografier viser asymmetriske synapser. Identifikation af postsynaptiske rum lettes ved elektrontæt PSD (pilespids) og veldefineret plasmamembran. Højre, den korteste afstand mellem hver Ng (pile) og plasmamembranen var ingenrmalized til radius af rygsøjlen. Ng molekyler i ryggen (men ikke på PSD) udviser præferentiel lokalisering til plasmamembranen. Dette histogram blev oprindeligt offentliggjort i EMBO Journal 8.
Figur 1. Skematisk af CA1-området dissektion fra hippokampalskivekulturer. Efter eksperimentel behandling til skiven, fx medicinsk behandling eller virusinfektion blev membranen indeholdende skive anbragt i iskold phosphatpuffer. Skiven blev først skåret vandret under den tandede gyrus (DG), parallelt med CA1 cellelag. CA1-underfelt blev derefter isoleret ved fjernelse af CA3 subfelt og subiculum (under). Til at identificere den øvre overflade af CA1, blev et hjørne skåret at orientere det væv (i dette tilfælde den øvrehøjre hjørne).
Figur 2. Immunogold mærkning af neurogranin på CA1 synapser i organotypiske hippokampalskivekulturer. (A) Transmission elektronmikrofotografier viser rotte-hippocampale CA1-området og synapser. Dendritter (d) af CA1 pyramidale neuroner er lette at skelne. Identifikation af asymmetriske synapserne mellem axonal terminal 9t) og dendritiske spidser (s) lettes af tilstedeværelsen af post-synaptiske density (PSD, pilespids) og veldefineret plasmamembranen. (B) Fordeling af neurogranin (Ng) i dendritiske spidser. Venstre, transmission elektronmikrofotografier viser immunogold-EM mærkning af nG (pile). Til kvantificering, fra afstanden af hvert guldpartikler (undtagen dem på PSD, pilehoved) plasma Membrane er normalisere (x-akse) til radius af rygsøjlen. Derfor 0 svarer til en partikel liggende på membranen og 1 til en partikel ligger i midten af rygsøjlen. Højre, er en tilfældig fordeling (lyserød) genereres ved hjælp af en generator af tilfældige tal makro (Microsoft Excel) i en rygsøjle-formet overflade. Ng (blå) viser den højeste top fordeling tæt på plasmamembranen. Scale bar, 200 nm. Dette histogram blev oprindeligt offentliggjort i EMBO Journal 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol, har vi vedtaget Phend og Weinberg metode til hjerne og rygmarv væv til at studere dendritiske Torner i rotte hippokampalskivekulturer. Dendrit udløberne i hippocampus CA3-CA1 område er sarte strukturer, der indeholder en bred vifte af proteiner, der spiller en vigtig rolle i reguleringen af neuronale funktioner. I denne procedure giver en afbalanceret tilgang til at opnå øget antigenicitet under opretholdelse af god ultrastrukturelle præservering (figur 2A), hvilket tillader rimelig mærkning effektivitet og god reproducerbarhed anvendelige til at karakterisere fordelingen af specifikke antigener i rygsøjlen. Her har vi mærket Ng med 10 nm kolloidt guld. Vi derefter kvantificeres guldet til at generere mærkning mønster af Ng, der hjalp til at forstå sin rolle i synaptisk funktion (figur 2B) 8.
Kvantitativ analyse af immunogold kan gøres på mange forskellige måder 11-13 14-17.
Udskiftningen af osmium af TA, UA og p-phenylendiamin (PPD) i denne tilgang stærkt forbedret følsomheden af påvisning af antigen i neuronale væv i forhold til tidligere metoder 7. Anvendelse af formaldehyd og glutaraldehyd sikrer strukturel konservering og opbevaring af små opløselige antigener, såsom aminosyrer. Epoxy-harpikser, snarere end akryl plastharpiks, give bedre stabilitet til indlejring under elektronstrålen uden at kompromittere antigenicitet 7. Sammenlignet med standard osmium protokol, Phend et al. </ Em> havde vist, at TA, UA, og PPD også forbedret strukturel konservering (se figur 1 i den oprindelige Phend papir) 7, og at effektiv immunfarvning blev fundet for flere proteiner, herunder substans P, calcitonin-gen-relateret peptid (CGRP), AMPA-receptor subunit 1 (GluA1), og gamma-aminosmørsyre (GABA) 7. Disse resultater viser evnen af denne procedure for at studere forskellige proteiner i neuronale væv. En anden fordel ved denne metode er, at TA, UA og PPD er nemme at fremstille og håndtere, og udgør langt mindre farlige risici end osmium, som er ekstremt volatile og meget giftigt ved indånding og ved kontakt med huden.
En begrænsning ved denne metode er, selv om den bevarer og tilbageholder små antigener såsom aminosyrer, betyder det ikke udviser forbedret immunolabeling for disse molekyler sammenlignet med konventionel osmium behandling. Fordelen ved tungmetallet platinchlorid at bevare structure og øge immunreaktivitet synes også at være begrænset til rygmarven, af årsager, som ikke helt forstået 7. Selv om den osmium-fri metode forbedrer antigenicitet og væv Derimod synes det ikke at fungere godt til konservering af andre strukturer, såsom præsynaptiske vesikler (se figur 2). Desuden havde Phend et al. Bemærkes, at fravær af osmium resulterede også i reduceret myelin konservering, som TA har en begrænset gennemtrængelighed i de intracellulære komponenter for at bevare membraner 7. Af disse grunde kan frysemetoders til prøveforberedelse være bedre alternativer, hvis ultrastrukturelle konservering er den vigtigste bekymring. Ultrarapid frysning af prøven tillader bevarelsen af molekyler i en mere naturlig måde 18, uden potentielle artefakter, som kunne indføres ved anvendelse af kemiske fikseringsmidler.
Før udførelse af EM, tilstedeværelsen afantigenet i prøven bør bekræftes ved måder, såsom Western blot-analyse. Som med alle immunolabeling undersøgelser, bygger korrekt fortolkning af data om anvendelsen af passende, specifikke antistoffer. Stærkt oprensede monoklonale antistoffer bør altid anvendes hvis den er tilgængelig. Kontrolforsøg er vigtigt, at mærkningen genererede mønster er på grund af den specifikke interaktion mellem det primære antistof og immunogenet. Specificiteten af mærkning kan testes ved at udføre negative og positive kontroller. For eksempel, i en negativ kontrol kan det primære antistof erstattes med et ikke-beslægtet kontrol-serum fra ikke-immunt IgG, uden at ændre nogen andre trin i farvningsprotokol. For det andet kan et protein, som er til stede i en cellekammer men ikke i andre anvendes som en positiv kontrol. For eksempel i glutamaterge synapser, er PSD-95 en postsynaptisk markør, mens GAP-43 er primært til stede i den præsynaptiske terminal 19-22.Hvis mærkningen ses, når primært antistof udelades eller i rum, hvor proteinet vides ikke at være til stede, så etiketten ikke er specifik.
Når specificiteten af primært antistof nøje testes, bør man være opmærksom på, at prøver med god mærkning ikke bør udvise mange sammenklumpning eller har for store guldpartikler i baggrunden, hvor der ikke væv er til stede. Hvis mængden af guld er for højt eller for lavt, justere niveauet eller varigheden af blokering og koncentrationen af antistof i overensstemmelse hermed. Maunsbach og Afzelius giver nogle fremragende eksempler og tips til immunolabeling 23.
God strukturel konservering af prøver kan fjerne artefakter, der kan forstyrre morfologi og forvirre fortolkning af data. Derfor den overlegne facadebeskyttelse illustreret ved denne metode gør denne teknik anvendes på en række biologiske væv især hvor fine strukturer kan værelet forvrænget eller ødelagt under prøve behandling. Derfor ud over organotypiske hippocampus-skiver, kan denne fremgangsmåde også være uhyre værdifulde til andre neuronale præparater, herunder akutte hjernesnit og primære neuronale kulturer. Organotypiske hippocampusskiver er let kan ændres til narkotikabehandling og ekspression af proteiner gennem viral infektion, som kan være gældende for at studere hippocampus synaptisk plasticitet. Denne fremgangsmåde er også egnet til at undersøge virkningerne af forskellige forsøgsbetingelser på antigen distribution eller lokalisering i cellelegemet, dendritter eller dendritiske spidser. Endvidere kolloide guldpartikler med størrelser på 6, 10, 15 eller 25 nm er tilgængelige, hvilket gør det muligt at udføre multipel mærkning uden overlapning. Vi mener, at fordelen ved forøget antigenicitet, fleksibilitet af prober og reproducerbarhed af immunogold mærkning demonstrere kraften i denne teknik for at studere en række forskellige antigener. Det er potentielt useful at karakterisere lokalisering og fordeling af receptorer, receptor-vekselvirkende proteiner, transportproteiner, ionkanaler og mange andre i forskellige hjernevæv, herunder cortex, thalamus, cerebellum og lugtekolben.
Sammenfattende er den nuværende protokol for en osmium-fri, post-embedding immunogold mærkning af rotte hippokampalskivekulturer et værdifuldt redskab til at studere forskellige antigener inden dendritiske Torner. Den potentielle anvendelighed af denne metode i andre sarte centralnervesystemet væv vil være meget nyttigt at undersøge de ultrastrukturelle karakteristika forskellige vigtige molekyler og til at hjælpe med at forstå deres rolle i biologiske funktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Matthew Firenze til fremstilling af de hippokampalskivekulturer. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra US National Institute on Aging og Alzheimerforeningen til NZG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 x 15 mm polystyrene Petri dish | Falcon | 351007 | |
| Disposable scalpel | EXELINT | 29552 | |
| Cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| 10 nm Goat-anti-rabbit gold | Electron Microscopy Sciences | 25108 | |
| Anti-Neurogranin antibody | Millipore | AB5620 | |
| 100% Picric acid | Electron Microscopy Sciences | 19550 | |
| 96% Paraformaldehyde | Acros Organics | AC41678-0030 | |
| 25% Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma | G5882 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
| p-Phenylenediamine | Sigma | P6001 | |
| Platinum (IV) chloride | Sigma | 379840 | |
| Tannic acid | Electron Microscopy Sciences | 21710 |
References
- Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Stirling, J. W. Immuno- and affinity probes for electron microscopy: a review of labeling and preparation techniques. J. Histochem. Cytochem. 38, 145-157 (1990).
- Phend, K. D., Weinberg, R. J., Rustioni, A. Techniques to optimize post-embedding single and double staining for amino acid neurotransmitters. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 40, 1011-1020 (1992).
- Berryman, M. A. Effects of tannic acid on antigenicity and membrane contrast in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 40, 845-857 (1992).
- Akagi, T., et al. Improved methods for ultracryotomy of CNS tissue for ultrastructural and immunogold analyses. J. Neurosci. Methods. 153, 276-282 (2006).
- Stirling, J. W. Ultrastructual localization of lysozyme in human colon eosinophils using the protein A-gold technique: effects of processing on probe distribution. J. Histochem. Cytochem. 37, 709-714 (1989).
- Phend, K. D., Rustioni, A., Weinberg, R. J. An osmium-free method of epon embedment that preserves both ultrastructure and antigenicity for post-embedding immunocytochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 43, 283-292 (1995).
- Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin. Embo J. 28, 3027-3039 (2009).
- Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation. Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).
- Zhong, L., Gerges, N. Z. Neurogranin targets calmodulin and lowers the threshold for the induction of long-term potentiation. PloS one. 7, e41275 (2012).
- Horisberger, M., Vauthey, M. Labelling of colloidal gold with protein. A quantitative study using beta-lactoglobulin. Histochemistry. 80, 13-18 (1984).
- Bendayan, M. A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology. Biotech. Histochem. 75, 203-242 (2000).
- Racz, B., Weinberg, R. J. Spatial organization of coflin in dendritic spines. J. Neuroscience. 138 (2), 447-456 (2006).
- Posthuma, G., Slot, J. W., Geuze, H. J. Usefulness of the immunogold technique in quantitation of a soluble protein in ultra-thin sections. J. Histochem. Cytochem. 35, 405-410 (1987).
- Howell, K. E., Reuter-Carlson, U., Devaney, E., Luzio, J. P., Fuller, S. D. One antigen, one gold? A quantitative analysis of immunogold labeling of plasma membrane 5'-nucleotidase in frozen thin sections. Eur. J. Cell Biol. 44, 318-327 Forthcoming.
- Yokota, E., Kawaguchi, T., Kusaba, T., Niho, Y. [Immunologic analysis of families with complement receptor deficiency]. Nihon. Rinsho. 46, 2040-2045 (1988).
- Kehle, T., Herzog, V. Interactions between protein-gold complexes and cell surfaces: a method for precise quantitation. Eur. J. Cell Biol. 45, 80-87 (1987).
- Bozzola, J. R., Lonnie, Ch. 2. Electron Microscopy. 30, Second Edition, Jones and Bartlett Publishers. (1992).
- Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
- Hunt, C. A., Schenker, L. J., Kennedy, M. B. PSD-95 is associated with the postsynaptic density and not with the presynaptic membrane at forebrain synapses. J. Neurosci. 16, 1380-1388 (1996).
- Gispen, W. H., Leunissen, J. L., Oestreicher, A. B., Verkleij, A. J., Zwiers, H. Presynaptic localization of B-50 phosphoprotein: the (ACTH)-sensitive protein kinase substrate involved in rat brain polyphosphoinositide metabolism. Brain Research. 328, 381-385 (1985).
- Biewenga, J. E., Schrama, L. H., Gispen, W. H. Presynaptic phosphoprotein B-50/GAP-43 in neuronal and synaptic plasticity. Acta Biochim. Pol. 43, 327-338 (1996).
- Maunsbach, A. A., Bjorn, Ch. 16. Biomedical Electron Microscopy Illustrated Methods and Interpretations. , Academic Press. 383-426 (1999).
