Summary
Her beskriver vi isolasjon av voksne mus cardiomyoctyes ved hjelp av en Langendorff perfusjon system. De resulterende cellene er Ca2 +-tolerant, elektrisk quiescent og kan dyrkes og transfektert med adeno-eller lentiviruses å manipulere genekspresjon. Deres funksjonalitet kan også bli analysert ved hjelp av MMSYS systemet og patch clamp-teknikker.
Abstract
Bruken av primær cardiomyocytes (CMS) i kultur har gitt et kraftig supplement til murine modeller av hjertesykdom i å fremme vår forståelse av hjertesykdom. Spesielt har muligheten til å studere ion homeostase, ionekanal funksjon, cellular oppstemthet og eksitasjon-kontraksjon kopling og deres endringer i syke forhold og av sykdomsfremkallende mutasjoner førte til betydelige innsikt i hjertesykdommer. Videre er mangelen på en tilstrekkelig udødeliggjort cellelinje for å etterligne voksen CMs, og begrensningene til neonatal CMs (som mangler mange av de strukturelle og funksjonelle biomechanics karakteristisk for voksen CMs) i kultur hemmet vår forståelse av det komplekse samspill mellom signalveier, ionekanaler og kontraktile egenskaper i den voksne hjertet styrke viktigheten av å studere voksen isolerte cardiomyocytes. Her presenterer vi metoder for isolering, kultur, manipulering av genuttrykk av adenovirus-EXPREssed proteiner og påfølgende funksjonell analyse av cardiomyocytes fra den voksne mus. Anvendelse av disse teknikker vil bidra til å utvikle mekanisk innsikt i signalveier som regulerer cellulær eksitabilitet, Ca 2 +-dynamikk og kontraktilitet, og gir en mye mer fysiologisk relevant karakterisering av kardiovaskulær sykdom.
Introduction
Murine modeller av hjerte-og karsykdommer har fungert som effektive verktøy for å belyse grunnleggende sykdomsmekanismer 1,2 samt for å identifisere potensielle terapeutiske mål 1,3. Spesielt har bruken av både murine modeller av ervervet hjertesykdom (slik som trykk-overbelastning) 4,5 og transgene musemodeller utvidet vår forståelse av hjertesykdommer 6-8. Bruken av cellekulturteknikker for å undersøke signalkaskader 3,9,10 og forandringer i individuelle proteiner som ligger til grunn cellulære eksitasjon eksitabilitet og-kontraksjon kopling i hjertet 11-13 på nivået av den enkelte celle er supplert med in vivo-musemodeller. Imidlertid har mangelen på egnede cellelinjer som reflekterer voksen CM struktur og funksjon har vært en vesentlig begrensning. Forskere har forsøkt å løse dette ved å studere de enkelte proteiner, slik som ione-kanaler, i heterologe ekspresjonssystemer
Primære neonatal rotte ventrikkel cardiomyocytes (NRVMs) er relativt lett å kultur, kan være infisert med adenovirus og lentiviruses å manipulere genekspresjon 15, ennd har derfor vært brukt med hell 1, men har begrensninger i sin egen. Selv om de gir en fysiologisk mikromiljøet en og har vært arbeidshesten av signalanlegget feltet, betydelige forskjeller mellom morfologi og subcellulære organisering av NRVMs og voksne cardiomyoctyes gjøre dem en utilstrekkelig modell for etterforskningen av ioniske flussmidler og eksitasjon-kontraksjon kopling i den voksne hjertet . Mest spesielt NRVMs mangler en definitiv t-rørformet delsystem fire. Siden Ca 2 + flux og dynamikk er kritisk avhengig av moden t-rør og sarkoplasmatisk retikulum (SR) struktur 6, Ca 2 + dynamikk og funksjonelle studier av hjertets kontraktilitet i NRVMs er ikke en nøyaktig refleksjon av disse kritiske prosesser i voksen cardiomyocytes. Videre, noen komponenter i signalveier varierer mellom neonatal og voksen mus 9, og gir dermed en annen begrensning for å studere sykdomsprosesser og deres jegmPACT på mobilnettet oppstemthet og kontraktilitet i NRVMs. Endelig fordelingen av kontraktile maskiner fører til flerveis-og ikke-uniform celle forkorting begrenser nøyaktigheten av kontraktile målinger.
Bruken av isolerte voksen kardiomyocytter gir derfor en mer nøyaktig in vitro modellsystem. Den ekstraordinære veksten av kunnskap gjort mulig av den genetiske manipulering av mus som understreker betydningen av å skaffe funksjonelle isolerte kardiomyocytter fra mus. Faktisk, har karakterisering av voksne CMs isolert fra musemodeller belyse mange biologiske og patologiske hendelser. Isolerte CMs fra transgene musemodeller har åpnet for studier av gevinst eller tap av funksjon av proteiner på de sammentrekkende egenskapene til enkeltceller 2,16, og levedyktighet i sykdomsmodeller som iskemi / reperfusjon 17,18, og dermed utfyller informasjonen han fikk fra i vivo-studier påSE mus. Bruk av isolert voksen CMs fra murine modeller av ervervet hjertesykdom 3,19,20 (for eksempel tverrgående aortic innsnevring-indusert press overbelastning, som etterligner hypertensjon eller Aortastenose) eller trening 5,21 (for modellering fysiologisk hypertrofi) gir mulighet for undersøkelse av interaksjonen av signalkaskader innblandet i disse prosessene med cellulær eksitabilitet og eksitasjon-kontraksjon kopling på nivået av den enkelte celle. Videre, evnen til å manipulere genekspresjon ved hjelp adenovirus-drevet genuttrykk i voksen CMs gir oss muligheten til å dissekere komponentene i komplekse signalveier.
Fra en elektrofysiologisk perspektiv, har hel-celle spenning og strøm klemme eksperimenter på isolerte voksen CMs vært avgjørende i å belyse innholdet i ioniske flukser ved baseline og i ulike sykdomstilstander. På grunn av den komplekse struktur av cellemembranen, og differensial protei stillaskonstruksjoner mellom voksen CMs og NRVMs eller heterologe cellelinjer, evnen til å lappe voksne celler gir en mye bedre representasjon av effekten av visse membranproteiner, strukturelle proteiner, og ionekanal samvirkende partnere på de elektrofysiologiske komponenter av voksent hjerte.
Til tross for slike fremtredende fordeler i å studere voksen murine cardiomyocytes, isolering og dyrking av voksne mus cardiomyocytes har vært utfordrende, oppfordret behovet for en systematisk og nøyaktig beskrivelse av metoden for å isolere levedyktige mus cardiomyocytes og å opprettholde dem i kultur for å tillate ytterligere genetisk manipulasjon ved hjelp av viral vektorer. Tidligere studier har brukt enten akutt isolert mus voksen CMs eller kultivert rotte voksen CMS. Sistnevnte er lettere å kultur enn voksen mus CMS, og de fleste eksperimenter manipulere genekspresjon in vitro har brukt rotte voksen CMS. Få studier har blitt endret og undersøkt funksjonelleonal genekspresjon i mus voksen CMs, presentere en stor begrensning på omfanget av eksperimenter. Derfor, her presenterer vi i detalj slike metoder, endret fra tidligere undersøkelser, for isolering 7,8,22, kultur 3,10,15,23, adenovirus infeksjon 11-13,15, og funksjonell analyse av voksen mus ventrikulære cardiomyoctyes. Denne isolasjonen protokollresultatene i Ca 2 +-tolerante, hissige cardiomyocytes at vi har lykkes dyrket i opptil 72 timer, og forbigående tilført med adenovirus. Funksjonaliteten til disse isolerte celler kan vurderes ved hjelp av MMSYS imaging system 14,24 og patch clamp, som også vil bli diskutert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Cardiomyocyte Isolation
Materialer (Figur 1)
Microdissecting tang
Tissue tang
Delikat hemostatic tang
Hemostatic tang
Microdissecting, taggete, buede tang
Drifts saks, rett
Drifts saks, buet
15 ml Falcon-rør (5)
60 mm petriskål
Fosfatbufret saltvann (PBS)
Nylon Mesh - 400 mikrometer porestørrelse
Liten trakt
Voksbelagte, flettet silke 4-0, 19 mm, 7-10 cm lang
Non-kanyle, butte enden, 24 G eller kommersiell dyr-fôring nål (24 x 1 i, W/1-1/4)
Heparinnatrium
Ketamin / xylazin blanding
Pasteur Pipettes
OptiVision Dissecting Goggles
IonOptix MMSYS system
Merk: Hvis dyrkning celler, se punkt 2 på cellekultur før du begynner denne protokollen.
Merk: Alle mus ble tatt vare på ien barriere anlegget og ofret i henhold til godkjente IACUC regelverk, rutiner og prosedyrer.
Merk: Før start av framgangsmåten, bør hele systemet være forvarmet for å sikre at alle elementer av Langendorff-systemet (figur 2A, figur 3) blir oppvarmet til 37 ° C for å sikre korrekt og fullstendig collagenase-aktivitet.
- Injisere voksne mus (~ 12 uker) med 150 USP enheter heparin natrium inn i mage plass.
- Anesthetize med en injeksjon av en ketamin / xylazin blanding ved en vektavhengig dose (tabell 1).
- 80:12 mg / kg ketamin: xylazin oppskrift: 2,6 ml ketamin (100 mg / ml) + 0,4 ml xylazin (100 mg / ml) + 37 ml PBS. Slutt: ketamin = 6,5 mg / ml; xylazin = 1 mg / ml
- Fest bedøvet musen til drifts pad, skjære hjertet, og legger inn et fat med romtemperatur PBS eller 0,9% saltvann (figur 1J). Physiologic saltvann lar det intakte hjertet til å trekke seg sammen for bedre ekstrudering av blod i kammeret og enkel identifisering av aorta før trinn 1.6. Mus ble sjekket for å sikre at de er dypt bedøvet via tap av hind lem tå klype refleks og demping av respirasjonsfrekvens før utbruddet av Thoracotomi.
- Bruk OptiVision dissekere briller (Figur 1a) å identifisere og avsløre aorta. Fjerning av vevet rundt aorta, selv om den gjør det lettere å visualiseringen av fartøyet, er ikke nødvendig for optimalisering av det celleisolasjon hvis aortaroten er klart synlig.
- Prime pumpen med perfusjon buffer (tabell 2). Temperaturen bør holdes på 37 ° C i lengden av fremgangsmåten ved hjelp av en kontrollert, sirkulerende vannbad (figur 2D).
- Monter hjertet på Langendorff Apparatus (Figur 2A). Ved hjelp av to mikro-dissekere tang (Tall 1D-E), prime aorta rundt den ikke-sprøyte, stump ende nål (24 g) med silikonrøret ved den distale enden. Alternativt kan en kommersiell dyr foring nål (24 x 1 i, W/1-1/4) kan brukes. Den silikonrøret på 24 G nål eller dyrefor nålen vil gi rom for å feste suturen over sporet. Plasser aorta på nålen som en sokk. (Figur 2C).
- Merk: Det er viktig å være sikker på at enden av nålen hviler i den stigende aorta, ideelt sett i aortaroten distalt til høyre innominate, men at den ikke strekker seg inn i aorta-ventilen inn i det venstre hjertekammer, da dette vil sterkt begrense muligheten for bufferne for effektivt perfuse gjennom hjertet gjennom koronararteriene.
- Sikre hjertet til nålen ved å binde en liten lengde på suturering silke (7-10 cm lange) (figur 1K) rundt toppen av aorta, noe som sikrer at båndet er på nivå med den stigende aorta, under høyre innominate Artery, men befinner seg over enden av kanylen.
- Senk hjertet inn i det indre av den koniske glass (figur 2B) for å bidra til å opprettholde et egnet omgivende temperatur.
- Perfuse hjerte perfusjon med buffer i 5 min ved en hastighet på 1 ml / min, og klemmes fast ved glasskammer utstrømningen for å tillate perfusatet for å samle seg i den koniske glass og konvolutten hjertet. Den skjematiske for bearbeider hjertet er vist i figur 3..
- På dette punkt skal det vises volumet av hjertet øker. I tillegg vil blod i hjertevev erstattes av perfusat, forårsaker vev blekhet.
- Slipp utstrømningen klemme å drenere perfusatet. Stopp pumpen for å bevege røret fra perfusjon bufferbeholderen til enzymet bufferbeholder (figur 2E). Start pumpen til å begynne å perfuse hjertet med enzymbuffer (tabell 2) ved 1 ml / min. Klem utstrømningen på nytt for å tillate at enzymet buffer for å omsluttehjerte.
- Her, som enzymet er perfusjon av hjertet og oppslutning av bindevevet, blir hjertet blir blekere og den strukturelle integritet vil avta.
- Å bestemme når man skal kutte ventriklene fra fordøyd hjertet, løft hjertet ut av den koniske glass, forsiktig klem hjertet med pinsett og samle noen dråper perfusat i en liten petriskål og sjekk for å se hvorvidt enkeltceller faller .
- For nybegynnere er det nyttig å koble perfusjon tråd med et manometer. Når hjertet er å bli fordøyd trykket raskt vil avta, slik at bindevev ikke holder motstanden. Manometeret er også nyttig for nybegynnere å sikre at posisjonen av nålen befinner seg over aorta-ventilen, og ikke i ventrikkelen. Lavt trykk vil indikere at nålen er i den ventrikulære kammeret og høytrykks indikerte at nålen berører ventilen.
- Skjær ventriklene fra hjertet i en tallerkenfull av overføringsbuffer (A) (tabell 2) når ventrikkel trykket begynner å falle dramatisk, eller når du er i stand til å se enkeltceller i perfusatet. Dette tar vanligvis ~ 7-10 min.
- Igjen bruker mikro-dissekere tang (figur 1C), hakke ventriklene i små biter for å distansere. En vellykket fordøyelsen vil forlate nesten ingen solide biter av vev etter hakking, med de fleste av vevet blir amorfe på dissosiasjon.
- For ytterligere å dissosiere den vev, pipettere løsningen inn / ut ved hjelp av en plast Pasteur pipette (figur 4) som spissen hadde blitt kuttet på et ~ 45 ° vinkel. Denne modifikasjon tjener til å øke den indre diametralt plass av pipettespissen og dermed redusere mengden av skjærspenning på cellene som vevet utgnis.
- Før dissekere vev med tang er det mulig å skille de enkelte kammere og hver for dissosierer atrial, ventrikulær og venstre høt ventrikulære celler.
- Fest squared mesh (figur 1M) til en liten trakt (Figur 1L) ved hjelp av klemmer og plasser denne filtreringsapparat i en 15ml Falcon tube (Figur 1I).
- Bruk modifisert Pasteur pipette for å fjerne celle løsning fra formen, og å filtrere oppløsningen inn i Falcon-røret.
- La de levende celler fikk sette seg på bunnen av røret (levende celle sedimente bør ta 2-4 min).
- Delmengde 2,5 ml av hver av de fire kalsium løsninger (tabell 3) i fire separate 15 ml Falcon-rør.
- Igjen ved bruk av en standard Pasteur-pipette, fjern forsiktig cellepelleten fra bunnen av røret, og overføre cellene til den første av kalsiumløsninger.
- La cellene fikk sette seg på bunnen av røret og gjenta trinn 1,17 i de etterfølgende kalsiumløsninger inntil cellene er i den siste løsning.
- Ikke la cellene bosette seg i fourth kalsiumløsningen. Sett lokk på røret og skru den på høykant.
2. Cell Culture
- Før isoleringen, platen 1 ug / ml naturlig mus laminin på glassdekkglass og inkuberes i minst 1 time ved 37 ° C og 2% CO2. Også la plating og kultur media (Tabell 4) å varme i inkubator ved 37 ° C og 2% CO 2. Dette gjør at oppløst CO 2 i media for å stabilisere seg.
- Ikke fjern toppen fra media. Bare løsne toppen for å unngå forurensning.
- Tillat de isolerte celler til pellet på bunnen av Falcon-røret.
- Fjern pelleten ved å bruke en standard plast Pasteur pipette og resuspender i den riktige mengde av plette media.
- Plate cellene på de Laminin-belagt Dekk i riktig størrelse parabolen og inkuberes i 37 ° C og 2% CO 2 i minst 30-60 min å la cellene til å følge Dekkglass.
- ** Hvis transfeksjon med adenovirus, fortynnes viruset i en passende mengde Plating materiale og erstatte pletteringsmateriale i formen med den virusinneholdende medium. La viruset inkuberes på cellene i 2 timer i 37 ° C og 2% CO2. **
- Fjern plating media fra fatet og erstatte med kultur media.
- Endre nøye kulturen media hver dag for ikke å forstyrre de cellene på dekkglass.
Ved hjelp av denne prosedyren, er cellene blitt dyrket i opp til 72 timer. Bilder av dyrkede og GFP transfekterte celler kan bli funnet i figur 5..
Tre. MMSYS System
- Drive MMSYS system som sikrer at buelampen startes først.
- Koble rørene fra pumpen til passende innløp og utløp for MMSYS kammeret (figur 6).
- Prime systemet med kalsium-buffer (B) (tabell 2).
- Plasser en caopriately størrelse glass dekkglass inn i kammeret og feste (Figur 6E). De fleste MMSYS kamre bruke enten 22 mm eller 25 mm firkantede dekkglass. Rådfør deg MMSYS bruksanvisningen for å finne riktig dekkglass for ditt kammer.
- Overfør 500 ul av celleløsningen til en liten Eppendorf-rør.
- Tilsett 0,5 mL Fura2-AM (stamløsning av 1 ug / mL) til det lille rør med cellene og tillate dem å inkuberes i mørke ved RT i 5-7 min. Dette gjør at Fura2-AM til "belastning" inn i cellene gjennom rask passiv diffusjon gjennom cellemembranen.
- La Fura-2 lastet celler pellet på bunnen av røret, og vaske det overskytende Fura med 500 pl av kalsium-buffer B.
- Slå av lyset i rommet.
- Ved hjelp av en standard Pasteur-pipette, slippe 1-2 dråper (avhengig av cellekonsentrasjonen) av "lastet" celle-løsning inn i midten av kammeret (figur 6C) og la cellene to bosette på dekkglass for 5 min.
- Tettheten av cellene i kammeret bør være slik at enkelt ikke-overlappende celler kan lett sees i MMSYS datainnsamling plattform.
- Nøye begynne å strømme kalsiumbuffer (B) gjennom kammeret.
- Øk kammertemperatur til 37 ° C.
- VIKTIG: Ikke slå på varmeapparatet før strømmen er igangsatt. Dette kan forårsake alvorlig skade på tilbakemeldinger thermocoupler (Figur 6A).
- Kontroller at kammeret er forbundet med MyoPacer via forbindelsesledningene (figur 6B) og begynner å avpasse cellene 5 Hz ved 1,5 x pacing terskelen for cellene.
- Velg en celle som slår på riktig frekvens og flytte det inn i rammeåpningen.
- Juster kamera og innrammingshulldimensjoner, slik at hele cellen er i sentrum av vinduet, rettet horisontalt, med sarcomeres apforelder.
- For cellelengde justere rød og grønn (høyre og venstre) fotodiode indikatorer til kanten av cellen. Endre kontrasten for å optimalisere den svart / hvit kontrast ved kantene av cellen. Se i Ionoptix manualen for ytterligere detaljer.
- Sett feltet i et område av cellen som inneholder veldefinerte sarcomeres og justere fokus for å optimalisere toppen av effektspekteret (rød). Juster også lysstyrken i mikroskop for å optimalisere den blå glatting vinduet og sort informasjon kontrast.
- Juster den grønne terskel barer å fange opp så mye av den røde spektrum (peak), og så lite bakgrunn som mulig.
- Begynn opptaket.
- Etter nok data er registrert, klikk på "Pause" for å stoppe innspillingen midlertidig og sikrer at verken fokus eller dimensjoner av visningsvinduet er endret, flytte mikroskopet scenen til et område av dekkglass der ingen celler eller cellemateriale kan være sett. Length av opptaket varierer avhengig av undersøkers forsøksprotokoll.
- Merk: Hvis du klikker "Stopp" vil avslutte innspillingen, og ingen bakgrunn vil kunne bli registrert for denne cellen.
- Klikk "Fortsett" for å spille inn en bakgrunn måling.
- Etter nok bakgrunn er registrert klikk "Stop" for å avslutte innspillingen.
- Klikk på "File >> Lagre" for å lagre alle spor for at cellen i en enkelt. ZPT fil.
- Gjenta trinn 03.12 til 03.20 fram til nok celler har blitt registrert.
- Konsultere IonOptix-MMSYS Brukerveiledning 12 for instruksjoner om analyse av de registrerte data. Karakteristiske registrerte data fra villtype cardiomyocytes er vist i på figur 7..
4. Patch Clamp
Patch klemming av ulike celletyper har blitt godt beskrevet tidligere i dette tidsskriftet 25-28. Vi vil derfor fokusere på noen kritikeral parametere for vellykket patch klamring av voksne cardiomyocytes isolert ved hjelp av vår protokoll beskrevet.
- Ved hjelp av en pipette avtrekker og borsilikatglass (med glødetråd: OD 1,5 mm, ID 0,86 mm - 10 cm lengde) trekke en pipette som viser ~ 2,0-3,0 MΩ når fylt med pipette løsning (tabell 5).
- Brann-polsk pipettespissen forsiktig ved hjelp av en Narishige eller annen vertikal brannpoleringsmaskin. Motstanden av plasteret pipette bør være 2-4 MO etter brann polering.
- Slå på datamaskinen, forsterker (Axopatch 200B), AD konverter (Digidata 1440A, Axon Instruments) og mikromanipulator (MP-285). For hele cellen patch klem, starter vi med standard parametre som beskrevet tidligere.
- For kultivert voksen CMS, fjerne dem fra inkubatoren og forsiktig vaske dekkglass som CMS er belagt med PBS ved romtemperatur.
- Fjern forsiktig dekkglass og legg den i perfusjon kammer på invertert mikroskop (Nikon TE 2000).
- Påse at innløpet for perfusjon system og utløp (for suge) er like over overflaten av dekkglasset.
- Begynn perfusert med passende ekstra-cellulære løsning (tabell 5).
- For fersk dissosiert voksen CMS, plassere en kollagen-belagt dekkglass i perfusjon system som ovenfor.
- Siden cellene vil være i løsning, forsiktig erstatte løsning med ekstracellulære buffer.
- Ved hjelp av den modifiserte Pasteur pipette (figur 4), forsiktig resuspender cellene i den ekstracellulære buffer, ta en delmengde og plassere den på dekkglass.
- La cellene feste for 10-15 min før du starter perfusjon som i 4.4.
- Back-fylle hele cellen patch pipette med intra-cellular buffer ved hjelp av en Microfil (World Precision Instruments, 28 G) nål. Pass på at det ikke er luftbobler i tuppen av pipetten, banke forsiktig på å la eventuelle luftbobler til å flyte til surface av løsningen.
- Fest fylte plaster pipette til pipetten-holderen, slik at det er kontakt mellom mikroelektroden og den indre løsning.
- Vi bruker sølvklorid elektroder, men ta vare på 'chloriding' sølvtråder minst en gang i uken ved å dyppe over natten i klorin.
- Senk forsiktig pipetten inn på badet, slik at badet elektroden er nedsenket til enhver tid i badekaret / ekstra-cellulære løsning. Oppveie eventuelle væskekoblings potensialer på dette tidspunktet. Store koblings potensialer kan være et tegn på forverret sølvklorid på elektrodene.
- Sunn sylindriske voksen CMs er identifisert i mikroskopet og sentrert i synsfeltet. Som tidligere beskrevet, tillater en kombinasjon av å bevege mikromanipulator og justere fokus for umiddelbar nærhet av plasteret pipette og overflaten av CM.
- Når de er i det samme fokalplan, bruker vi en kombinasjon av visuellesasjon av cellen og testpuls (tilgjengelig i Axopatch 200B).
- Når motstanden av pipetten avtar i to (noe som tyder på at pipetten er i kontakt med overflaten av cellen), og cellen fortsetter å se sylindrisk, etablerer vi gigaohm tetning ved hjelp av et lett sug.
- For CMs, foretrekker vi munnen sugekraft for å etablere undertrykk. Hvis en gigaseal er vellykket oppnådd, vi igjen bruke milde rytmisk munnen sug å "break-in 'til cellen for å etablere hele cellen patch modus.
- Typiske hvile potensialer av sunn CMs er i størrelsesorden -85 til -90 mV. Når en gigaseal er oppnådd, måles hvile-membranpotensialet ved hjelp av strømtang med I = 0 pA.
- Hvis det hvilende membranpotensial blir depolarisert Dette kan tyde på en skadet celle eller en dårlig forsegling.
- Fordi CMs er store celler med mye areal, må nøye oppmerksomhet som skal betales til kapasitans kompensasjon, spesielt whøne hurtig aktiverende strømninger slik som natriumkanal må studeres. Dersom tilstrekkelig kapasitans erstatning ikke kan oppnås ved hjelp av den innebygde kompensasjonsinnstillinger på pulsgeneratoren, prepulses på sub-terskel spenning og motsatt polaritet kan ha for å bli brukt, og den resulterende strøm trekkes fra det registrerte signalet. En slik protokoll er enkelt programmeres i Axopatch.
- Når hele cellen patch modus har blitt etablert, vente 15 min for å tillate vektutjevning og for å sikre stabilitet i forseglingen før begynnelsen spenning eller strømtang protokoller. Vi bruker standard protokoller som er beskrevet tidligere i denne og andre tidsskrifter, og vil ikke bli utdypet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isoleringen av voksne cardiomyoctyes resulterer i stavformede, tverrstripet, og hvilende (ikke spontant slo) celler (Figur 5A). Døde celler vil let avrundet og ingen striper vil være til stede. Hvile celler kan være kultivert og tilført med adenovirus å manipulere genekspresjon (Tall 5B og 5C). Etter 24 timer av kultur, ikke morfologi av levende celler ikke endre, er de fortsatt Ca 2 +-tolerant, og de kan være tempoet etter felt stimulering. Med den foreslåtte fremgangsmåte, kan oppnås med et utbytte på 80-90% levedyktige celler.
For å måle cellens kontraktilitet, tar MMSYS systemprogramvaren fasen informasjon fra mikroskop for å rapportere enten endringene i sarcomere eller cellelengden. Vist i (figur 7A) er en representant kontraktilitet spor via sarkomerlengde måling av en vill type C57BL6 mus. For friske voksne mus myocytes fraSE mus, er grunnlinjen sarkomerlengde ~ 1,7-1,9 mikrometer. Den MMSYS systemprogramvare er i stand til samtidig å måle kontraktilitet og kalsiumbehandling ved å måle forholdet mellom bundet til de ikke-bundne former av kalsiumaktiverte fargestoff Fura2-AM. Mens forholdet tiltak kan variere noe mellom oppsett, for friske celler, er forholdet typisk mellom 1.5 til 2.5 (figur 7B). Dersom MMSYS systemet er kalibrert for kalsium, kan dette forholdet deretter oversettes til et absolutt mål for intracellulær kalsiumkonsentrasjon. For å analysere de data som er generert fra kontraktilitet og kalsium spor, må sporene midles for å skape et karakteristisk spor for at celle (figurene 7C og 7D). De karakteristiske spor er da underlagt en monotransient dataanalyse algoritme fra MMSYS systemprogramvaren som deretter genererer parametere for systolisk og diastolisk funksjon. Ytterligere detaljer er tilstede i IonOptix manual.
Voksen mus cardiomyocytes var også gjenstand for hele celle patch clamp eksperimenter der handlingen potensiale ble spilt inn i strømtang modus (Figur 8).
| Kroppsvekt (g) | Ketamin / xylazin (ml) |
| 15 | 0,18 |
| 20 | 0,25 |
| 25 | 0,31 |
| 30 | 0,37 |
| 35 | 0,43 |
| 40 | 0,49 |
| 45 | 0,55 |
| 50 | 0,62 |
Tabell 1. Voksen Mouse vektavhengig Ketamin / xylazin Dosering (80:12).
| Oppløsning | Oppskrift |
| Tyrode Buffer * (PH 7,4) | 1 L DDH 2 O 137 mM NaCl 4 mM KCl 1 mM MgCl 10 mM HEPES 0,33 mM NaH 2 PO 4 |
| Perfusjons Buffer * (PH 7,4) | 500 ml Tyrode Buffer 10 mM D-(+)-glukose, minimum 5 mM Taurin 10 mM butanedione Monoxime (BDM) |
| Enzyme Buffer * | 50 ml Perfusjons Buffer 0.024 g Collage D (type IV) 0.018 g Collage B (Type II) 0.003 g Protease XIV fra Streptomyces griseus |
| Overføringsbuffer (A) | 45 ml Perfusjons Buffer 5 ml bovint serumalbumin (fra 5 mg / ml stamløsning) |
| Kalsium Buffer (B) | 1 L Tyrode Buffer 1,2 mM CaCl 5,5 mm D-(+)-Glukose, minimum |
Tabell 2. Voksen Cardiomyocyte Isolation Buffer oppskrifter.
| [CaCl] | Overføringsbuffer (A) | Kalsium Buffer (B) |
| 0,06 mm Ca 2 + | 9,5 ml | 0,5 ml |
| 0,24 mM Ca 2 + | 8,0 ml | 2,0 ml |
| 0,60 mM Ca 2 + | 5,0 ml | 5,0 ml |
| 1,20 mM Ca 2 + | 0 ml | 10 ml |
Tabell 3.Calcium Titrering Solution oppskrifter.
| Plating Medium | Kultur Medium |
|
|
Tabell 4. Plating og Kultur Media oppskrifter.
| Pipette Solution | Bath Solution |
|
|
Tabell 5. Patch Clamp Solutions (løsninger er oppgitt er for måling av natrium strøm).
Figur 1. .. Voksen cardiomyocyte isolasjon instrumenter A) OptiVisor optisk glass kikkerten forstørrelses B) Tissue tang, 5,5 i, 1x2 tenner -. Roboz Scientific C) Moloney tang - 4,5 i (11,5 cm) lang svak kurve, taggete -. Roboz Scientific DE) Dumont # 3 tang, Dumostar, tips størrelse 0,17 x 0,10 mm. F) Packer MosqUiTø tang fem i Straight Flat -. Roboz Vitenskapelige G) Micro dissekere saks 4,5 i Buet Sharp / Skarp -. Roboz Scientific H) Micro dissekere saks 3,5 i Straight Sharp / Sharp 20 mm -. Roboz Scientific I) 15 ml Falcon tube - Thermo -Fisher Scientific J) 60mm petriskål inneholder PBS K) Softsilk: Wax belagt flettet silke, 19 mm - Covidien L) Plastic trakt, 6,0 cm diameter M) Nylon mesh - 400μm pore størrelse.....
Figur 2. Langendorff Apparatus. A) Hele Langendorff perfusjon system som brukes for voksen cardiomyocyte isolasjon. B) forstørret riss av det hule, koniske glass samling trakt som brukes til å varme opp kanylert hjertet. C) forstørret riss av den ikke-kanylering hypodermisk nål. (Gjenbruk Feeding Needles (24. G, rett, rund tupp, 25 mm lange, fine Science Tools Inc. Element 18061-24). D) Sirkulasjons vannbad E) Vannbad for rugende perfusjon, enzym-og overføringsbuffere.
Figur 3. Viser et detaljert skjema av perfusjons-systemet.
Figur 4. Modifisert Pasteur pipette. Den pipette ble endret ved å kutte av tuppen på en ca 45 ° vinkel. Dette gir en større overflate og skaper mindre skjærspenning på cellene som de blir dissosiert. Det innfelte viser en nærmere oversikt over den modifiserte tips.
Figur 5. Dyrkede og GFP transfektert kardiomyocytter. A) Freshly isolat ed voksen cardiomyocytes fra en C57BL6 musen over 12 uker. Pilene peker til døde eller døende celler. Disse cellene er mer avrundet enn sunt, stavformet voksen CMS. B) GFP-transfektert voksen mus cardiomyoctyes etter 24 timer av kultur. C) Kultur voksen mus cardiomyocytes etter 24 timer. Inset viser økt forstørrelse av dyrkede myocytes.
Figur 6. . MMSYS system kammer Blå piler representerer flyten av perfusjon buffer (buffer B) A) Singel, in-line løsning varmeapparat -... Warner Instrument Corporation B) Koble ledninger fra MMSYS system kammeret til MyoPacer feltet stimulator C) Platinum elektroder for feltstimulering som ligger i sentrum av kammeret. D) Avløp reservoaret. E) kammeret klemmer i åpen stilling.
Figur 7. Representative MMSYS systemdata registrert for villtype C57BL6 mus hentet fra Jackson Labs. A) MMSYS basen kontraktilitet spor. B) Forhold av Ca 2 +-bundet til Ca 2 +-ubundet Fura2-AM registrert å generere basen kalsium spor. Disse sporene svarer til kontraktilitet målinger i A) C.) I gjennomsnitt basen kontraktilitet spor utarbeidet av MMSYS systemprogramvaren til et karakteristisk kontraktilitet spor. D) Karakteristisk kalsium spor hentet fra base spor i B). Analyse av sammensatte spor vil tillate forskeren å generere surrogat parametere for systolisk og diastolisk funksjon. Klikk her for å se større figur .
Figur 8. Patch klemme spor som viser handlingen potensialet i en vill-type voksen mus cardiomyocyte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne rapporten har vi beskrevet de nødvendige teknikker for vellykket isolasjon og kultur av voksen CMs fra musen hjertet. Vår teknikk som gjør det mulig for etterfølgende undersøkelse av CM funksjon og eksitabilitet ved hjelp av metodene som er beskrevet ovenfor. Den kritiske parameter for å studere funksjonen av voksen CMs er helse-og kvaliteten av det isolerte CMs. Som beskrevet ovenfor, våre teknikker gjør det mulig for et høyt utbytte av funksjonelle celler som er mottagelig for manipulering av genekspresjon ved å bruke adenovirus / lentiviral infeksjoner i kultur, og analyse av cellulær eksitabilitet og kontraktil funksjon.
En av de viktigste parametre for isolering av funksjonelle voksen mus CMs er presis og rask kanylering av hjertet på den ikke-kanyle. Det må sikres at aorta festet på den venstre ventrikkel dissekeres i tilstrekkelig lengde til å tillate enklere og raskere kanylering av hjertet. Når kanylerør tHan hjerte, er det også viktig at tuppen av nålen forblir i den stigende aorta, og strekker seg ikke forbi aorta-ventilen inn i den venstre ventrikkel for å tillate effektiv perfusjon av vev gjennom koronararteriene. Det neste trinnet er viktig å sikre aorta til spindelen av nålen ved hjelp av en silke sutur. Den sutur bør være bundet på den stigende aorta, slik at perfusjon buffer retrogradely strømmer inn i de koronare arterier og venstre ventrikulære rom, men ikke flyter antegradely ut gjennom den distale enden av den dissekerte aorta eller de store fartøyene.
Noen forskere finne det nyttig å sette opp en trykkmåler for å vurdere kvaliteten av kanylering og påfølgende perfusjon av enzymet. Ved bruk av en trykkmåler, bør initielle venstre ventrikulære trykket være ~ 80 - 100 CMH 2 O, og ved perfusjon med enzymet, vil trykket avta til ~ 40-50 CMH 2 O. Når det ventrikulære trykket når dette punktet, er detmest sannsynlig klar til å være til å bli kuttet fra nålen. For å sikre at ventriklene er godt spaltet, kan noen få dråper av gjennomstrømnings hentes fra under hjertet inn i en petriskål, og sjekket for å se om noen levende, hvilende celler er til stede.
De resulterende isolerte celler fra denne prosedyren egner seg godt til immunocytochemistry. De kan løses ved hjelp av vanlige festemetoder 29 (dvs. formalin, Paraformaldehyde, iskald metanol eller aceton), men et høyere nivå av permeabilization enn det som vanligvis brukes for neonatale cardiomyoctyes er noen ganger nødvendig å avbilde cytosoliske proteiner eller proteinstrukturer (dvs. alfa- sarcomeric aktin, beta myosin). Endelig kan cellene dyrkes og deretter infisert med adeno-eller lentiviruses å manipulere genekspresjon, eller brukes til funksjonelle analyser av celle kontraktile apparat.
Culture of voksen mus CMs har lenge blitt beskrevet somutfordrende. Ved hjelp av teknikker som er beskrevet her, kan vi rutinemessig kultur i disse cellene i opp til 72 timer, selv om utbyttet av funksjonelle celler avtar kraftig etter 36 timer. Ved dyrking av cellene, er det viktig at cellene skal bli belagt ved 37 ° C i 2% CO2. Dette er forskjellig fra neonatal CMS, som foretrekker å bli dyrket ved 10% CO 2 for den første 24 timer og deretter byttet til 5% CO 2, eller neonatal hjerte fibroblaster, som også foretrekker 5% CO 2. Pletter og kulturmedia kan ekvilibrert slik at den oppløste CO 2 er 2%.
Cellene blir sådd ut på laminin-belagte dekkglass, slik at de ikke løftes ut av glasset når mediet endret. Men, gjør cardiomyocytes ikke legge veldig godt til glasset selv med laminin belegg. Det er derfor svært viktig at man vise forsiktighet ved endring av kultur media, ved hjelp av sterile pipetter, og ikke et vakuum aspirasjon system. Når cellens er belagt, kan de bli tilført med adenovirus ved inkubering av den virus for ikke mer enn 2 timer. Tidspunktet avhenger av titer av viruset, og proteinet å være over-uttrykt, så anbefales å utføre preliminære forsøk å bestemme LD 50 og ED 50 for viruset. I de fleste tilfeller bruker vi en MOI av 20-100 for adenovirus. Når cellene er blitt inkubert med virus, foregår ekspresjon av målgenet (e) som typisk ~ 24 til 36 timer.
Isolerte celler som er belagt på dekkglass av en passende størrelse for MMSYS system kammeret kan også bli analysert for kontraktilitet og kalsiumbehandling ved hjelp av MMSYS avbildningssystem. Disse dekkglass kan plasseres direkte inn i kammeret, og kulturmediet kan fjernes ved å slå på systemet perfusjon. Dersom cellene ikke blir dyrket, og blir brukt for analyse direkte etter isolering, kan de tilsettes direkte til kammeret når et dekkglass er blitt plassert. Mensdet er ikke nødvendig å forhånds coat Dekkglass med laminin når analysere nylig isolerte celler, i vår erfaring, gjør laminin hjelpe cellene bedre følge til dekkglass. Ved hjelp av en langsom flow rate for MMSYS enheten i tillegg sørger for at cellene forblir festet til dekkglass. Til slutt må optikken i mikroskop, spesielt objektivlinsen bli omhyggelig rengjort før hvert forsøk, for å tillate nøyaktig visualisering av sarcomeres trengs for vurdering av kontraktilitet.
Det mest avgjørende komponent i MMSYS systemet er enkelt in-line væskevarmer som varmer perfusjons buffer (B) som strømmer inn i kammeret. Den termoelement av denne del av utstyret er konstruert for å utveksle varme med fluidet som passerer gjennom konvektiv varmeoverføring, slik at hvis strømmen er fraværende, vil varmeveksleren blir overopphetet og det kan medføre alvorlige skader på systemet. Det er derfor viktig at ovnen er slått på først etter at strømmen er initiert.
Andre metoder for å analysere den kontraktile apparat av voksne cardiomyocytes er blitt beskrevet tidligere, inkluderer sofistikerte metoder under anvendelse av 30 til 32 atom-kraft mikroskopi. Noen av disse fremgangsmåter tillater mer sofistikerte måling av lokaliserte kontraktile kraft og egenskaper som Youngs modul, noe som gjør dem mer egnet for måling av uregelmessig formede celler eller celler uten klart definerte sarcomeric systemer som CMs avledet fra indusert pluripotente stamceller. Disse teknikkene kan være like enkelt brukes på den isolerte voksen CMS. Fordelen med MMSYS systemet er relativt enkelt å måle kontraktilitet og evnen til å måle et stort antall celler i en kort tidsperiode i celler med klart definerte sarcomeres. I tillegg er sarcomere analyse myk-kant og systemer som kan måle lengden av cellen, eller lengden mellom sarcomeres svis gi rom for to forskjellige (men ropprømt) metoder for å måle kontraktilitet. Den datainnsamling programvare kombinert med avansert, brukervennlig programvare for analyse gjør dette systemet lett å lære og bruke. Til slutt, evnen til å måle kalsium dynamikk samtidig muliggjør korrelasjon mellom kontraktilitet og kalsium homeostase, noe som ikke er mulig med atomic force microscopy. Også, fordi datautgang er en ratiometrisk mål på kalsiumaktiverte fargestoff (Fura2-AM), med riktig kalibrering, absolutte målinger av indre kalsiumkonsentrasjoner kan samles opp.
Vellykket opptak av ionekanal signaler fra voksne cardiomyocytes krever cellene være i optimal stand. Umiddelbart etter isolering og plating av cellene de ikke er vedheftende og vil flyte i løsning, på dette stadium at de ikke kan bli studert. Innen få timer vil de holder seg til en belagt dekkglass, og det er på dette punktet at de kan studeres. I vår erfaring patching løpet av noen få timerplette gir det optimale resultat, som venter for lenge negativt påvirker cellene. Som beskrevet ovenfor, testing av hvile-membranpotensialet etter å etablere en gigaohm tetning og bryter inn i cellen, så vel som evne til å etablere en gigaohm tetning selv er to parametre som reflekterer hvor sunne cellene er ved lapping. Mens det er lettere å lappe på celler som ikke kontrahering, dette er ikke en forutsetning, tilstrekkelig sel kan fås på å slå celler også. Protokollene som brukes på dette punktet avhenger av målene i patch klem studie, ved hjelp av strømtang teknikker, kan spontan eller indusert aksjonspotensialer bli registrert. Alternativt kan spenningsklem brukes til å studere spesifikke ionekanaler. Gitt panoply av kanaler i membranen, er slike opptak vanligvis utført i nærvær av ionekanal-blokkere. Tetrodotoxin (TTX), blir nisoldipin, og cesium ofte brukt til å blokkere natrium-, kalsium-og kaliumkanaler henholdsvis although et utvalg av medikamenter har blitt benyttet, og detaljer om deres bruk er publisert i stor utstrekning. De fleste tilnærminger innebære enten opptaks strømninger før og etter påføring av ion kanalblokkere og trekke fra strømmen, og / eller blokkering av bakgrunns kanaler med de riktige blokkere før opptak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282 | |
| D-glucose minimum | Sigma | G8270 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma | B0752 | |
| Collagenase B | Roche Applied Science | 11088807001 | |
| Collagenase D | Roche Applied Science | 11088858001 | |
| Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma | A2153 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C8106 | |
| Minimum Essential Media | Sigma | 51411C | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | |
| L-glutamine | Sigma | G3126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I1884 | |
| Cesium Chloride | Sigma | 289329 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
| Cesium Hydroxide Solution | Sigma | 232041 | |
| Tetraethylammonium hydroxide solution | Sigma | 86643 | |
| OptiVisor optical glass binocular visor | Dohegan Optical Company Inc. | N/A | |
| Tissue forceps, 5.5", 1x2 teeth | Roboz Scientific | RS-8164 | |
| Moloney forceps - 4.5" (11.5 cm) long slight curve, serrated | Roboz Scientific | RS-8254 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm | Roboz Scientific | RS-4966 | |
| Packer Mosquito Forceps 5" Straight Flat | Roboz Scientific | RS-7114 | |
| Micro Dissecting Scissors 4.5" Curved Sharp/Sharp | Roboz Scientific | RS-5917 | |
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp20mm | Roboz Scientific | RS-5907 |
References
- Chlopcikova, S., Psotová, J. Neonatal rat cardiomyocytes-a model for the study of morphological, biochemical and electrophysiological characteristics of the heart. Biomedical Papers. , (2001).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat. Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
- Ballou, L. M., Lin, R. Z. Rapamycin and mTOR kinase inhibitors. J. Chem. Biol. 1, 27-36 (2008).
- Brette, F., Orchard, C. T-Tubule Function in Mammalian Cardiac Myocytes. Circ Res. , (2003).
- Sakata, Y., Hoit, B., Liggett, S., Walsh, R. Decompensation of pressure-overload hypertrophy in G?q-overexpressing mice. Circulation. , (1998).
- Lieu, D. K., et al. Absence of Transverse Tubules Contributes to Non-Uniform Ca 2+Wavefronts in Mouse and Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells and Development. 18, 1493-1500 (2009).
- Lim, H., De Windt, L., Mante, J., Kimball, T. Reversal of cardiac hypertrophy in transgenic disease models by calcineurin inhibition. J. Mol. Cell Cardiol. 32 (4), 697-709 (2000).
- Muthuchamy, M., et al. Mouse model of a familial hypertrophic cardiomyopathy mutation in alpha-tropomyosin manifests cardiac dysfunction. Circ. Res. 85, 47-56 (1999).
- Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. J. Mol. Cell. Cardiol. 34, 807-821 (2002).
- Epstein, F., Hunter, J. Signaling pathways for cardiac hypertrophy and failure. New England Journal of Medicine. 341 (17), 1276-1283 (1999).
- Snopko, R., Aromolaran, A., Karko, K. Cell culture modifies Ca 2+ signaling during excitation-contraction coupling in neonate cardiac myocytes. Cell Calcium. , (2007).
- Ranu, H., Terracciano, C., Davia, K. Effects of Na+/Ca2+-exchanger overexpression on excitation-contraction coupling in adult rabbit ventricular myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 34 (4), 389-400 (2002).
- Kaab, S., Nuss, H. B., Chiamvimonvat, N., O'Rourke, B., Pak, P. H., Kass, D. A., Marban, E., Tomaselli, G. F. Ionic mechanism of action potential prolongation in ventricular myocytes from dogs with pacing-induced heart failure. Circ. Res. 78 (2), (1996).
- Splawski, I., et al. Variant of SCN5A sodium channel implicated in risk of cardiac arrhythmia. Science. 297, 1333-1336 (2002).
- Zhou, Y., Wang, S., Zhu, W. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279 (1), 429-436 (2000).
- Sussman, M., Lim, H., Gude, N., Taigen, T. Prevention of cardiac hypertrophy in mice by calcineurin inhibition. Science. , (1998).
- Heinzel, F. R., et al. Impairment of diazoxide-induced formation of reactive oxygen species and loss of cardioprotection in connexin 43 deficient mice. Circ. Res. 97, 583-586 (2005).
- Li, X., Heinzel, F. R., Boengler, K., Schulz, R., Heusch, G. Role of connexin 43 in ischemic preconditioning does not involve intercellular communication through gap junctions. J. Mol. Cell. Cardiol. 36, 161-163 (2004).
- Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J., Chein, K. R. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).
- Nakamura, A., Rokosh, D. LV systolic performance improves with development of hypertrophy after transverse aortic constriction in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281 (3), 1104-1112 (2001).
- Boström, P., et al. A PGC1-?-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis. Nature. 481, 463-468 (2012).
- Liao, R., Jain, M. Isolation, culture, and functional analysis of adult mouse cardiomyocytes. Methods Mol. Med. 139, 251-262 (2007).
- Volz, A., Piper, H. M., Siegmund, B., Schwartz, P. Longevity of adult ventricular rat heart muscle cells in serum-free primary culture. J. Mol. Cell. Cardiol. 23, 161-173 (1991).
- Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. -S. Methods in Molecular Biology. 689, Humana Press. 205-214 (2010).
- Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. (47), e2269 (2011).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (20), e936 (2008).
- Arman, A. C., Sampath, A. P. Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation. J. Vis. Exp. (43), e2107 (2010).
- Wen, H., Brehm, P. Paired patch clamp recordings from motor-neuron and target skeletal muscle in zebrafish. J. Vis. Exp. (45), e2351 (2010).
- Maier, S., Westenbroek, R. An unexpected role for brain-type sodium channels in coupling of cell surface depolarization to contraction in the heart. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (6), 4073-4078 (2002).
- Shroff, S. G., Saner, D. R., Lal, R. Dynamic micromechanical properties of cultured rat atrial myocytes measured by atomic force microscopy. Am. J. Physiol. 269, 286-292 (1995).
- Domke, J., Parak, W. J., George, M., Gaub, H. E., Radmacher, M. Mapping the mechanical pulse of single cardiomyocytes with the atomic force microscope. European Biophysics Journal. 28, 179-186 (1999).
- Smith, B. A., Tolloczko, B., Martin, J. G., Grütter, P. Probing the Viscoelastic Behavior of Cultured Airway Smooth Muscle Cells with Atomic Force Microscopy: Stiffening Induced by Contractile Agonist. Biophysical Journal. 88, 2994-3007 (2005).
