Beurteilung der Magenentleerung in Non-adipösen diabetischen Mäusen mit a [ Published: March 23, 2013 doi: 10.3791/50301

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Christopher T. Creedon¹, Pieter-Jan Verhulst¹, Kyoung M. Choi¹, Jessica E. Mason¹, David R. Linden¹, Joseph H. Szurszewski¹, Simon J. Gibbons¹, Gianrico Farrugia¹

¹Enteric Neuroscience Program, Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic

Summary

Bestimmung der Magenentleerung mit einem nicht-invasiven [

Abstract

Magenentleerung Studien an Mäusen haben durch die Unfähigkeit, Magenentleerung Veränderungen im gleichen Tier, da die am häufigsten verwendeten Techniken erfordern das Töten der Tiere und postmortale Erholung der Mahlzeit ^1,2 folgen beschränkt. Dieser Ansatz verhindert Längsschnittstudien Änderungen in Magenentleerung mit dem Alter und das Fortschreiten der Erkrankung zu bestimmen. Die allgemein verwendete ^[13 C]-octansäure Atemtest für Mensch ³ wurde für die Verwendung bei Mäusen und Ratten ^{4-6 7} modifiziert und wir zuvor gezeigt, dass dieser Test zuverlässig und den Veränderungen der Magenentleerung ist als Reaktion auf Arzneimittel und während diabetischer Krankheitsprogression ^8. In diesem Video-Präsentation das Prinzip und die praktische Umsetzung dieser modifizierten Test erläutert. Wie in der vorherigen Studie werden NOD LTJ Mäuse verwendet, ein Modell des Typ 1 Diabetes ^9. Ein Teil dieser Mäuse entwickeln die Symptome der Gastroparese, eine Komplikation der diabetes durch eine verzögerte Magenentleerung ohne mechanische Obstruktion des ^Magen-10 gekennzeichnet.

Dieses Papier zeigt, wie die Mäuse zum Testen zu trainieren, wie man den Test Mahlzeit zuzubereiten und erhalten 4 hr Magenentleerung Daten und wie die gewonnenen Daten zu analysieren. Der Kohlenstoff Isotopenanalysator in der vorliegenden Studie verwendet ist geeignet für die automatische Abtastung der Luftproben aus bis zu 12 Mäuse gleichzeitig. Diese Technik ermöglicht die Längs-Follow-up der Magenentleerung von größeren Gruppen von Mäusen mit Diabetes oder anderen langjährigen Krankheiten.

Introduction

Dieses Manuskript beschreibt die technischen und methodischen Überlegungen in nicht-invasive Messung der Magenentleerung bei Mäusen beteiligt. Indem Sie das Protokoll hier beschrieben, Ermittler können zuverlässig und reproduzierbar zu folgen Veränderungen in Magenentleerung aufgrund der Entwicklung der Krankheit, untersuchen den Einfluss von pharmakologischen Wirkstoffen auf die Magenentleerung und folgen Sie die Reaktion der Magenentleerung auf die Behandlung der zugrunde liegenden Krankheiten oder Mängel ^{6,8, 11,12.} In früheren Veröffentlichungen, die Anwendung von ¹³ C Octansäure Atemtest wurde gezeigt, dass eine sinnvolle Methode zur Messung der Magenentleerung bei Menschen und Tieren ^3,8 sein. Dieses Papier beschreibt im Detail die erforderlichen Verfahren, um verlässliche Daten über die 6 bis 8 erhalten Monate, die für eine Langzeitstudie der Magenentleerung bei Mäusen mit Diabetes. Die Vorteile der nach diesem Protokoll, wenn zuvor publizierten Methoden verglichen werden, dass der Prüfer die Daten obtaine gewährleistet werden kannd werden zuverlässig und reproduzierbar. Zusätzlich beschrieben die automatisierte System zum Sammeln und Analysieren der Gasproben hier erhöht sich die Anzahl der Tiere, die gleichzeitig in einer Studie folgen. Insgesamt ist das Ziel dieser Arbeit, die wichtigsten Faktoren, die Gewöhnung der Mäuse auf dem Prüfstand, und dass die Variabilität in erhaltenen Ergebnisse zu erhalten identifizieren.

Für die in vivo Messung der Magenentleerung, werden die Mäuse über Nacht gefastet und legte in den transparenten Kunststoff-Testkammern mit konstanter Luftstrom. Nachdem die Mäuse an den Rohren zu bekommen gewöhnt, atmete Baseline ¹³ CO ₂ bestimmt werden können und der Luftstrom entsprechend angepasst. Als nächstes wir ein verabreichen Testmahlzeit bestehend aus Eigelb mit ¹³ C-markiertem Octansäure vermischt. Da die Mäuse gefastet und ausgebildet sind, sie in der Regel essen die Testmahlzeit innerhalb von 2 min. Die verabreichte Octansäure ist nicht im Magen absorbiert wird aber bis in den Zwölffingerdarm entnommen werden eind wird in der Leber in ¹³ CO _2, das freigesetzt wird und ausgeatmete verstoffwechselt zu werden, was zu einer Anreicherung von ¹³ CO ₂ in der Umgebungsluft. Luftproben werden in bestimmten Zeitabständen gesammelt und durch den Kohlenstoff Isotopenanalysator analysiert. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in diesem Prozess ist die Magenentleerung und die pulmonale Ausscheidung von ¹³ CO ₂ direkt entspricht Magenentleerung des markierten Mahlzeit.

Abbildung 1. Schematische Darstellung der Magenentleerung Apparat. Nach nächtlichem Fasten, werden die Mäuse in transparenten Kammern so dass sie sich zu bewegen und drehen frei platziert. Ein Einlassrohr ermöglicht frisch und konstante Luft Zustrom und einen Auslass führt zur Isotopenanalysator die ^{13 C-to-12} messenC-Verhältnis im ausgeatmeten Atem. Die Kammer weist auch eine zentrale Schnittstelle für Lieferung von Lebensmitteln mit ^[13 C]-octansäure.

Protocol

Ein. Schulung und Gewöhnung der Mäuse

1. Vor der Analyse, legte alle Mäuse in den Testkammern für 2-4 h mit konstanten Luftstrom, um sie auf die Prüfbedingungen zu gewöhnen. Dies reduziert deutlich Stress, die andernfalls möglicherweise abweichende Erfassung verzögerte Magenentleerung. Behandeln Sie die Maus auf die gleiche Weise, als ob die Magenentleerung Experiment ausgeführt wurde. Bereiten Eigelb (siehe weiter unten) ohne Zugabe von Octansäure und füttern 0,2 g jeder Maus.
2. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Mäuse ausreichend geschult sind (in der Regel 2-3 Mal). Die Mäuse sind typischerweise leicht so lange Gewöhnung als die Umgebungsbedingungen gehalten werden dieselben.

Hinweis: Nicht gewöhnt Mäusen weiter zu bewegen für ca. 1 Stunde nach der Übertragung in die Kammer, und entleeren und urinieren häufig, während habituierten Mäusen schnell in ihre neue Umgebung und Ruhe leise zu begleichen.

Nichtte: Während des Experiments: Monitor auf Anzeichen des Verlustes der Gewöhnung wie überschüssige Wasserlassen, Stuhlgang, mangelndes Interesse an dem Essen das Ei. Ist dies der Fall zu betrachten erneut habituating in einer leeren Kammer 1-2 mal vor dem Erhalten Magenentleerung Daten. Konsistenz ist sehr wichtig, während Sie dieses Experiment. Dinge zu tun, genau die gleiche Weise jedes Mal ist der einzige Weg, um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Dies beinhaltet geben Behandlung (zB Insulin) jeden Tag zur gleichen Zeit, nicht die Trennung der Mäuse aus ihrem Käfig-Kollegen, wenn es unbedingt erforderlich, das Fasten, die Mäuse und Starten der Magenentleerung Test zur gleichen Zeit, und die Handhabung der Maus auf die gleiche Weise.

2. Vorbereitung der Isotope enthaltenden Testmahlzeit

1. Beginnen Sie mit einem Gewicht von 5 g Eigelb in einem 50 ml Falcon-Röhrchen. Wiederholen Sie diese Schritte jedes experimentelle Tag eine frische Testmahlzeit vorzubereiten.
2. Fügen Sie 10 ul Octansäure mit einer konzentration von 2 ul / g zu der 50 ml-Falcon-Röhrchen mit dem Ei und mischen kräftig für 1 min mit einem Spatel in Falcon-Röhrchen.
3. Das Ei wird dann in ein Becherglas überführt und erhitzt über einem Bunsenbrenner bis es koaguliert und seine Konsistenz eignet, um kleine Kugeln machen. Dies dauert in der Regel etwa 30 Sekunden.

Hinweis: Die Kugeln aus Eigelb sollte 0,2 g pro Maus wiegen. Dies ist wichtig, um die kumulative Dosis konstant in allen Mäusen.

3. Beginn des Experiments

1. Einmal ausgebildet und bereit für die Magenentleerung, schnell die Mäuse über Nacht (12 h) auf einer Metalloberfläche "Mesh-unten" Fasten Zahnstange coprophagia verhindern. Stellen Sie sicher, sie haben freien Zugang zu Trinkwasser. Da diabetischen Mäusen im aktuellen Experiment verwendet werden, sollten sie nicht länger als 16 Stunden gefastet werden.
2. Beginnen Sie mit dem Einrichten der Magenentleerung Kammern. Verwenden Sie saubere Kammern und Abdeckungen, die schon an der Luft getrocknet wurden. Auch irgendeinemRohre die Kammern verbindenden dem Analysator oder dem CO _2-Luftzufuhr sollte feuchtigkeitsfreien; Wasser kann mit dem Signal von dem Analysator zu lesen interferieren
3. Verbinden der Kammern mit den Einlaßrohren, die einen konstanten Luftstrom bereitzustellen. Anschließend verbinden Sie die Auslassrohre von den Kammern zu der Maschine. Schließen Sie die Rohre und schalten Sie den Luftstrom.

Hinweis: Tragen Sie eine sehr kleine Menge Vaseline am Ende der Deckeln so schließen sie einfach und sicher verschlossen. Diese Abdichtung ist erforderlich, um die Kohlensäure von den Mäusen hergestellt sammeln.

4. Experimentelle Verfahren

1. Starten Sie durch Wiegen jeder Maus. Das Körpergewicht ist ein Maß für ihre fortwährende gute Gesundheit. Dann legen Sie jede Maus in der entsprechenden Kammer. Es ist natürlich wichtig, haben die strömende Luft in die Kammern zu diesem Zeitpunkt.
2. Um die Messung zu starten, damit die Mäuse zu den Kammern, bevor anzupassen akklimatisierenING die Luft Ebenen.
3. Sobald die Mäuse ruhig erscheinen, kann das einige Minuten dauern, stellen Sie die Luftmenge für jede Maus Kammer. Dies kann für jede Maus. Typischerweise wird der Luftstrom am Beginn des Experiments angepasst werden, um sicherzustellen, dass ausgeatmete CO ₂ erreicht Nachweisgrenze, was Geräten verwendet wird, und dafür zu sorgen, dass das Niveau niedrig genug, um gesunde Luftzirkulation zu gewährleisten bleibt. Wir verwenden anfänglichen CO _2-Gehalt zwischen 1.000 und 1.500 Teile pro Million.
4. Wenn Schwierigkeiten mit Anpassungen, Leckagen zu überprüfen. Dann wiederholen Sie den Vorgang für jede der Kammern und achten Sie auf eine weitere Runde von Messungen zu sehen, ob Anpassungen vorgenommen, um die Luftströmung die CO _2-Ebene korrigiert wurden. Es ist wichtig, eine stabile Basislinie gerade vor dem Einspeisen der Mäuse zu erhalten. Wir verwenden eine Maschine mit einer Selbstkalibrierung Funktion. Ist dies nicht der Fall sollte die Kalibrierung überprüft.
5. Wenn dies erreicht ist, die Verwaltung der Ei Mahlzeitdie erste Maus und Aufzeichnung der Zeit jede Maus bekommt das Essen.
6. Wir führen das Verfahren für 4 h bis genügend Werte für die Montage des ¹³ CO _{2-Anreicherung} Kurve für jede Maus zu erhalten. Überprüfen Sie auf der Mäuse jede 30-60 min, um sicherzustellen, dass die CO _2-Gehalt noch für die Mäuse sicher.
7. Bereiten Sie neue Kisten mit Lebensmitteln vor dem Ende des Tests, so dass die Mäuse können anfangen zu essen unmittelbar nach der Test beendet ist.

Representative Results

Eine repräsentative Daten aus drei verschiedenen Mäusen zu setzen ist in Abbildung 2 dargestellt. Der Graph stellt die schwarze Datenpunkte von einer Maus mit normaler Magenentleerung. Es zeigt die Fraktion von ¹³ C, die in der ausgeatmeten Luft als Prozentsatz der verabreichten Dosis pro Stunde als Funktion der Zeit, ausgedrückt zurückgewonnen wird. Die blaue Kurve ist von einer Maus mit einer beschleunigten Magenentleerung mit einem T Halbwert von 40 min und der rote Kurve ist von einer Maus mit einer verzögerten Magenentleerung mit einem T Halbwert von 168 min. Wie in einer früheren Studie in unserem Labor ^7, der normale Magen ein halb Entleerungszeit für eine nicht-diabetischen NOD-Maus Alter etablierten 9-15 Wochen reicht von 62 bis 131 min, wie durch den grauen Kästchen dargestellt. Die Datenpunkte werden dann von einer nicht-linearen Regressionskurve der folgenden Gleichung ⁸ eingepasst:

y = at ^{b e-ct}

Wobei y der Anteil der 1/2)

aus einem numerischen Integrationsverfahren Verwendung einer inversen Gamma-Funktion berechnet. Wir haben Ergebnisse mehrerer Studien erhaltenen tausend mit einer biologischen Intra-Maus Variabilität von etwa 10%.

Abbildung 2. Vertreter Magenentleerung Daten aus drei verschiedenen Mäusen mit normaler (schwarze Kurve), verzögert (rote Kurve) und beschleunigt (blaue Kurve) Magenentleerung. Das graue Feld zeigt normale Werte. Die Gleichung der nichtlinearen Regressionskurve wird in dem Feld angezeigt.

Discussion

Die hierin beschriebene Technik ermöglicht wiederholten und nicht-invasiven in-vivo-Messung von festen Magenentleerung bei Mäusen. Dieses System hat den Vorteil, dass die Tiere nicht in der Messkammer zurückgehalten, so dass sie sich zu bewegen und sich frei drehen können. Da dies eine ungewohnte Umgebung, die Mäuse müssen noch geschult werden und gewöhnt den Testkammern zu Auswirkungen von Stress auf die Magenentleerung zu verhindern. Im Allgemeinen nehmen wir die Magenentleerung Daten zuverlässig sind, wenn das intra-Maus-Variabilität zwischen aufeinanderfolgenden Magenentleerung Tests weniger als 10%.

Dieser Bericht ist eine detaillierte Beschreibung unserer bisherigen Berichte über Magenentleerung Messungen in Mäusen ^8,11,12 und enthält zusätzliche Informationen zur Fehlerbehebung Probleme mit dem System. Die wichtigste Modifikation ist die Verwendung der LGR Isotopenanalysator zum Messen Gaskonzentrationen. Der Analysator wir in der vorliegenden Studie verwendet misst ¹² CO 13 CO ₂ und H ₂ O Konzentrationen jede Sekunde. Die computergesteuerte Ventile in der Multiple-Input-Einheit schaltet automatisch Strömung zu dem Detektor zwischen Maus Kammern alle 25 sec. Daher 12 Mäusen kann gleichzeitig mit einer 5 Min. Intervall zwischen Ablesungen analysiert werden. Es ist anzumerken, dass die Daten auch durch manuelle Abtastung der ausgeatmeten Luft und anschließender Analyse erhalten werden kann. Bei manueller Probenahme oder mit einem anderen Gerät, stellen Sie sicher, Lesungen bei etwa 10 min Intervallen erhalten. Die Empfindlichkeit von unserem System und die Frequenz der Probenentnahme bedeutet, dass die Magenentleerung Kurven zuverlässiger und einfacher zu montieren und so haben wir festgestellt, dass wir reproduzierbarer Daten mit dieser verbesserten Verfahrens zu bekommen sind.

Die wichtigsten Fallstricke dieser Technik auftreten, wenn die Mäuse, die Mahlzeit innerhalb der vorgegebenen Zeit zu essen, wenn die Mäuse ihre Gewöhnung verlieren die Kammer und wenn technische Probleme ergeben sich bei der Erfassung sys scheiterntem. Failure, um die Mahlzeit und Verlust der Gewöhnung zu essen sind in der Regel eine Folge der nicht nach den entscheidenden Schritt der mit einem regelmäßigen Zeitplan für die Prüfung. Nach 3 aufeinanderfolgenden Tests von 7 Tagen oder weniger voneinander getrennt, werden unsere Mäuse auf dem Prüfstand gewöhnt und fressen die Mahlzeit. Sobald gewöhnt sind zuverlässige Daten erhalten werden, wenn die Mäuse mindestens einmal alle 2 Wochen für den Rest des Experiments getestet werden. Wenn aus irgendeinem Grund die Mäuse nicht für 3 oder mehr Wochen getestet dann zwei Trainingseinheiten innerhalb einer Woche wird in der Regel sicher Gewöhnung. Wenn das Personal den Umgang mit den Tieren ändern, dann Umschulung der Mäuse wird empfohlen und es ist besonders wichtig, um den Einsatz von stark duftende Seifen und / oder Duftstoffe von den Menschen den Umgang mit den Mäusen zu entmutigen. Schwierigkeiten mit dem Detektionssystem sind oft auf dem niedrigen Niveau von ¹³ CO ₂ durch ein kleines Tier wie eine Maus erzeugt. Der Detektor muss kalibriert werden und für einige Detektoren wie Infrarot-basierten Systemen, ist es sehr important den Wassergehalt der Probe auf ein Minimum vor den Messungen verringern.

Es gibt nur wenige Einschränkungen dieser Technik sei denn, der Prüfer will Magenentleerung häufiger studieren als einmal alle 3 Tage in der gleichen Maus. Es ist nicht zu schnell die Maus so oft und beraten wie diätetische Einschränkung auf einer regelmäßigen Basis können Magen-Funktion ändern. Modifikationen der Technik werden können, um flüssige Magenentleerung zu messen, und dass eine nützliche potentielle Anwendung des Verfahrens.

Andere Verfahren zur Messung der Magenentleerung, einschließlich Szintigraphie oder Messen zurückgehalten Inhalt, nachdem eine feste Zeit signifikant mehr Beschränkungen einschließlich Probleme mit dem Streß des Prozesses oder durch die Notwendigkeit, das Tier am Ende jedes Tests töten. Stressoren gehören Magensonde der Testmahlzeit oder Zurückhaltung des Tieres während der Messung. Die Vorteile des Atemtests sind, dass die Maus frei bewegt und nicht narkotisiertenoder in irgendeiner Weise sediert.

Zusammenfassend ermöglicht das ¹³ C-Octansäure Atemtest die Studie des Fortschreitens der Krankheit mit dem Alter und Behandlung und diese Daten können dann mit Änderungen in anderen physiologischen Parametern und histologische Auswertung in demselben Tier zu korrelieren. Unter anderen Anwendungen, der Test erlaubt auch Studie, wie Medikamente können direkt ändern Magenentleerung sowie die Untersuchung der Reaktion auf die Behandlung an Tieren, die Veränderungen in der Magenentleerung durch Krankheit oder anderen Eingriffen entwickeln.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A source of constant air-supply, flow as well as composition	central air supply in the research facility
130 ml sampling chamber that has air inlet, air outlet, and food administration opening Plastic tubes for air supply	In-house built
Octanoic acid	Cambridge isotope laboratories (Andover, MA)	CLM-293-1
To prepare the egg meal: small beaker 50 ml plastic tube Bunsen burner egg spatula	Any supplier		Try to be consistent with the egg supplier since the nutritional content and palatability of the eggs can affect ingestion and gastric emptying of the meal
Carbon dioxide isotope analyzer	Los Gatos Research Inc. (Mountain View, CA)