C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging'de elegans

Summary

Onun küçük şeffaf gövde, iyi belgelenmiş nöroanatomi ve müsait genetik teknikler ve reaktiflerin bir dizi ile,

Abstract

Nematod solucanı C. elegans in vivo nispeten basit, düşük maliyetli nöronal görüntüleme için ideal bir model organizmadır. Onun küçük şeffaf gövdeli ve basit, iyi karakterize sinir sistemi sağlam hayvan içindeki kimlik ve herhangi bir nöronun floresan görüntüleme sağlar. Hayvan fizyolojisi üzerinde minimal etkisi ile basit immobilizasyon teknikleri uzun time-lapse görüntüleme sağlar. Böyle Cameleon ¹ ve GCaMP ² olarak genetik olarak kodlanmış kalsiyuma duyarlı floroforlar gelişimi hücre fizyolojisi ve nöronal aktivite hem ilgili nöronal kalsiyum in vivo görüntüleme sağlar. Spesifik nöronlarda bu floroforlar eksprese eden transjenik suşların çok sayıda hazır olan veya iyi bilinen teknikler kullanılarak oluşturulabilir. Burada, GCaMP ve Cameleon ikisini de kullanarak in vivo bir nöronun içinde kalsiyum dinamikleri ölçülmesi için detaylı prosedürler açıklanmaktadır. Biz avantajları ve disadvant tartışmakHer iki yaş hem de numune hazırlama (hayvan immobilizasyon) ve görüntü analizi çeşitli yöntemleri. Travmatik lazer hasarı bir nöronun fizyolojik kalsiyum yanıtı ölçmek için Cameleon kullanarak harici bir elektrik alanı ve 2 belirli bir nöronun duyusal yanıt) ölçmek için GCaMP kullanma) 1: Sonunda, iki deney sonuçları sunmak. Bu gibi Kalsiyum görüntüleme teknikleri C. yaygın olarak kullanılmaktadır elegans ve genetik geçmişleri boyunca serbestçe hareket hayvanlar, aynı anda birden fazla nöron ve karşılaştırma ölçümleri için genişletilmiş edilmiştir. C. elegans teknik basitlik ve maliyet diğer model sistemler üzerinde avantaj ile in vivo nöron görüntüleme için güçlü ve esnek bir sistem sunar.

Introduction

Burada C. vivo kalsiyum görüntüleme için pratik yöntemler sunmak elegans nöronlar. Yüksek sinyal-gürültü oranına sahip genetik olarak kodlanmış kalsiyum duyarlı floroforlar gelişimi C. yapar nörofizyoloji ve aktivite ölçümü için nispeten basit ve maliyet etkin sistemi elegans. Bizim görüntüleme yaygın olarak kullanılabilir floroforlar geniş-alan floresan görüntüleme kullanarak standart bir bileşik mikroskop ile yapılır. Biz her birinin güçlü ve zayıf tartışarak, çeşitli floroforlar ve farklı numune hazırlama istihdam çeşitli teknikler mevcut. Veriler daha sonra, iki örnek deneyler sunulmuştur. Burada açıklanan teknikleri üzerine mükemmel bir ek kaynak WormBook, "Görüntüleme nöronlar ve kas aktivitesi" R. Kerr, (bulunabilir http://www.wormbook.org ) ^3.

Geneti iki ana sınıflarıCally kodlanmış floresan kalsiyum muhabir yaygın olarak kullanılan C. elegans: tek kanallı GCaMP ve FRET tabanlı Cameleon. Biz yöntemleri açıklamak ve her tarafından oluşturulan veriler için örnekler göstereceğiz.

GCaMP çevreleyen kalsiyum konsantrasyonu ile duyarlı olan değiştirilmiş bir yeşil floresan proteini (GFP) esas alınmaktadır. Bu, kalmodulin tarafından kalsiyum bağlayıcı etkili bir floresan teyit ² içine GFP molekül getirir, öyle ki GFP füzyon ve kalsiyum yüksek afinite protein kalmodulin ile gerçekleştirilmektedir. Bu floroforlar yılında son gelişmeler bir kalsiyum düzeylerinin fizyolojik aralığı ve ~ 95 msn yükselme zamanı ve ~ 650 msn bozunma süresi ⁴ makul hızlı kinetiği üzerinde floresan yoğunluğu% 500'e varan artış ile olağanüstü sinyal boyutunu oluşturur. Nispeten kısa sürelerle (dakika) içinde, bu büyük sinyalleri düşük çözünürlüklü görüntüleme için izin (düşük büyütme) ve iyi huylu init verilen edebilirsinizial Bazal ölçüm, sürekli bazal veya karşılaştırmalı ölçümler için gerekliliğini inkâr.

Cameleon iki bağımsız kanal ya da dalgaboyu ¹ ile karşılaştıran bir rasyometrik ölçümü üreten bir FRET tabanlı bir florofor olma avantajına sahiptir. Bir kalmodulin proteini ile bağlantılı iki ayrı floroforlar (mavi ve sarı-yayan floresan proteinleri, CFP ve YFP) oluşmaktadır. Karmaşık CFP heyecanlandıran mavi ışık (440 nm) ile aydınlatılır. Kalsiyum bağlama YFP (alıcı) için CFP (donör) floresan rezonans enerji transferi (FRET) artırılması ve CFP emisyon (480 nm) azaltmak ve YFP emisyon (535 nm) artırmak için neden birbirlerine daha yakın floroforlar getiriyor . Göreli kalsiyum seviyeleri YFP / CFP yoğunluk oranı olarak ölçülmüştür. Cameleon kinetiği ~ 1 sn yükselme zamanı ve ~ 3 sn ⁵ bir çürüme zaman için in vivo ölçülen GCaMP, bu daha yavaştır. Bununla birlikte,zıt hareket eden sinyallerin oran sinyali boyutunu artırır ve nedeniyle florofor konsantrasyon, hareket veya odak kayması ve ağartma değişiklikler mümkündür eşya bir sayı için dengeler.

Genetik olarak kodlanmış floresan gazetecilere Eksojen probları ve C ile birlikte gerekli numune hazırlama çok inkâr elegans küçük şeffaf gövde basit geniş bir alan floresan kullanarak sağlam hayvanın içinde görüntüleme sağlar. Numune hazırlamada temel teknik zorluk güvenle hayvanların hareketsiz taşımaktadır. Farklı sık kullanılan teknikler avantaj ve dezavantajları ile her biri bir dizi vardır. Hayvanlar felç bir farmakolojik ajan kullanarak uygulamak kolaydır ve izin (Levamizol, ele geçirmek için kas dokusu sebep genellikle ⁶ kullanılan bir kolinerjik agonist) bir hazırlık birden hayvanların montaj. C. elegans da fiziksel olarak onları monte edilerek immobilize edilebilirsert% 10 agaroz ^{7, 8.} Hayvan fizyolojisi üzerindeki bu etkisi en aza indirir, uzun süreli görüntüleme (saat) ve çoklu hayvan kurtarma sağlar ama daha teknik olarak zordur. Bu tekniklerin her ikisi hayvan (olan bir kapak slipi altında) için fiziksel erişimi kısıtlamak ve bu nedenle sadece belirli deneysel uyaranlara (örneğin ışık, ısı, elektrik alanı lazer ya da hasar gibi) ile birlikte kullanılabilir. Bu tür kimyasallar touch veya yönetim gibi fiziksel erişimi gereklidir uyaranlar için, birçok çalışma başarıyla C. yapıştırılmış yerde elegans (veterinerlik notu tutkal kullanarak) ^9. Bu teknik olarak daha zordur, tek bir hayvan, hazırlık ve hayvan kurtarma izin vermez. Son olarak, çok sayıda mikroakışkan cihazlar fiziksel C. dizginlemek olduğu istihdam edilmiştir elegans, hayvan fizyolojisi koruyarak uyaranlara (cihazın tasarımına bağlı) birçoğuna maruz izin ve hayvanların hızlı değişim ve iyileşme sağlayabilir

Burada sunulan yöntemler C. nöronal aktivite ve hücre fizyolojisi ölçmek için kullanılabilir elegans. Her bir örnek vereyim: bir dış elektrik alan için ASJ nöronun duyu yanıtı ölçmek için GCaMP kullanarak ve bir nöronun lazer hasara fizyolojik kalsiyum yanıtı ölçmek için Cameleon kullanarak. Bu örnekler floroforlar iki tip yararları ve sakıncaları göstermek ve sistem ile nelerin mümkün olduğunu göstermektedir.

Protocol

1. Optik Kurulumu

1. Epifloresans görüntüleme yetenekleri ile standart bir bileşik mikroskop kullanın. Biz bir Intensilight HG Aydınlatıcı bir Nikon Eclipse Ti-U inverted mikroskop kullanın.
2. En iyi görüntü ve sinyal kalitesi için yüksek bir büyütme, yüksek sayısal diyafram objektif kullanın. Biz tipik bir Nikon X60 1.4 NA yağ immersiyon objektif kullanın. Bazı durumlarda, florofor ve sinyal gücünü ifade seviyesine bağlı olarak (X40, X20) alt büyütme kullanmak mümkündür.
3. Örneğin görüntü hassasiyetini maksimize ve arka plan gürültüsünü en aza indirgeyen bir Andor Clara Kamera gibi, CCD kamera soğutmalı yüksek hassasiyet kullanın.
4. Tek renk floroforlar fluorofor belirli dalga boyu için tasarlanmış belirlenen standart mikroskop floresan filtre kullanın. GCaMP kullanmak için standart bir GFP filtresi 525 nm 488 nm ve emisyon eksitasyon için optimize ayarlayın. Daha başka optik değişiklikler gereklidir.
Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu oluşur:
1. 440 ± 20 nm eksitasyon filtresi ve 455 nm ile ayarlanan bir mikroskop filtre uzun dikroik ayna geçmektedir.
2. Hemen mikroskop görüntüleme portu (kamera CCD sensör genellikle oturup nerede) dışında ilk görüntü düzlemi yerleştirilen bir görüntü maskesi. Bu kamera sensörü sadece yarısını dolduracak böyle görüş alanını kısıtlar. İki fotoğrafı yan yana öngörülen keskin görüntü sınırları içinde ilk görüntü düzlemi sonuçları ve hiçbir çakışma bu maske yerleştirme.
3. İlk röle lensleri t bir odak uzunluğunu ayarlamako ışık collimates böyle ilk görüntü düzlemi.
4. (<515 nm, camgöbeği) diğer iletim sırasında tek renk (> 515 nm, sarı) yansıtan iki ayrı görüntüleme dalga veya kanallar içine ışık bölünmeler dikroik ayna.
5. Daha da spesifik bir görüntüleme dalga boyunda (485 azından göbeği 535 ± 40 nm ve sarı ± 30 nm): için geçen ışık yayma kısıtlayan filtreler (bant-geçişli filtreler),
6. Bu CCD kamera ikinci bir görüntü düzlemine ışık yeniden odaklayan bu tür ışın yolları yerleştirilen ikinci röleye lensleri (Her kanal için bir tane).
7. Aynalar ve ikinci bir dikroik ayna bir çift iki görüntünün yeniden birleştirilmesi, bu gibi huzme yolu yönlendirir ve CCD kamera sensörünün üzerine yan yana tahmin edilmektedir. Şekil 4A elde edilen görüntünün bir örneğini göstermektedir.
5. İlk Optik Hizalama: Yüksek kontrast imag ile optik kurulumu ve hizalaması başlatındüşük bir büyütme merceği ve bulaşan geniş alana ışık aydınlatması (bir mikroskop lamı üzerine çizilmiş siyah bir sharpie iyi çalışır) kullanarak e. Mikroskop Okülerin yoluyla odaklanmak görüntü getirin ve daha sonra kullanılmak üzere mikroskop noktasına geçti. Ile yüksek ışık aydınlatma başlangıç ​​odak düzlemi (mikroskop liman dışında birkaç cm) bir dizin kartı üzerindeki görüntü. Işın yolu ilk röle lens (C) yerleştirin bunu ilk odak düzlemi bir odak mesafesine ve ışın yolu (yani doğrudan ışın yolu ortalanır) saptırma değilken ışığı collimates böyle. Görüş yarı sahadan kısıtlamak ve görüntüde keskin bir yatılı üretmek için ayarlanabilir ilk odak düzlemi, de maske yerleştirin. Şekil 1B 'de gösterildiği gibi ışın yolu, tablo yüzeyine paralel kalır ve iki paralel yol yan yana çalışan böyle bir ayna ve filtrelerin (D, E, G) yerleştirin. Merkezi ikinci röleye kendi ışın yolları lensler (F) veKamera CCD sensör olacak idi yerleştirilen bir dizin kartı üzerinde bir odak görüntüleri getirmek için yollar boyunca ileri geri hareket ettirin. Doğru şekilde yapılırsa, iki görüntü mikroskop oküler ve diğer kamera portu ile parfocal olmalıdır. Nihayet konumdaki kameranın yerleştirin ve hizalamayı ince ayar.
6. İnce Ayar Optik Hizalama: ince ayar optik hizalama için CCD kamera tarafından görüntülenen çift görüntü kullanın. Yüksek kontrastlı bir resim kullanın ve nihai hizalama için yüksek büyütme geçiş, düşük büyütme ile başlar. Yansıyan görüntü (Şekil 1B sarı kanalı) alanın diğer yarısını kapsayacak şekilde X ve Y. Pozisyonu kamera hareket ettirerek görüş kamera görüş alanının yarısını kapsayacak şekilde iletilen görüntü (Şekil 1B camgöbeği kanalı) konumlandırın kendi ışın yolunda son iki aynalar (G) ayarlayarak görüntüleyebilirsiniz. Işın yolu boyunca ileri geri her kanal için ikinci röleye objektif hareket ettirerek odaklanmak optimize edin. Bırakılırsadeğiştirilmemiş optik kurulum kararlı olmalı ve yalnızca nadir ince ayar ayar gerektirir.

2. Numune Hazırlama ve Veri Toplama.

1. Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC) ya da diğer kaynaklardan ilgi nöron bir kalsiyum duyarlı fluorofor ifade hayvanlar edinin. Alternatif olarak transgenik hayvanlar standart C kullanılarak inşa edilebilir elegans teknikleri. Tek hücre ifade (ve bazen de arzu edilmez çoklu nöronlar araştırılması için ise, ¹²⁾ görüntü ve birden fazla hücre ölçümleri, kolayca ayrılabilir sürece gerekli değildir. Florofor transgen genomunun içine bütünleşik hale değilse, ifade önemli değişiklik hayvandan hayvana oluşabilir. Bu durumda, bir flüoresan mikroskop kullanarak yüksek ifade seviyeleri ile hayvanlar preselecting sinyal-gürültü oranını arttırır ve ölçümler artırır. Florofor ifade seviyelerini neekolayca deneme tarafından gerekli tedarik parametreleri altında kamera ile görüntülenmek üzere yeterli olması d.
2. Laboratuvar bant iki parça tarafından aralıklı iki cam slaytlar arasındaki erimiş agaroz küçük bir damla basarak istediğiniz immobilizasyon tekniği (aşağıya bakınız 2.3) için gerekli agaroz pedleri olun. Eğer gerekirse, agaroz pedler hayvanlar monte edilmeden önce bir cam kapak slipi transfer edilebilir. Şekil 2'ye bakınız.
3. C. hareketsiz aşağıdaki tekniklerden birini kullanarak görüntüleme için elegans:
   1. Farmakolojik Paralyzation:% 2 agaroz pedleri (2.2 yastıkları yapmadan önce erimiş agaroz içine karıştırarak) 0.05% Levamizol ekleyin. Ped üzerine 5-10 hayvanlar Pick up ve bir kapak kayma ile kaplayın. Bu konumda tutmak için kapak kayma köşelerine sıcak balmumu karışımı küçük miktarlarda (% 50 parafin ve% 50 vazelin) sürün. B etkisi ve hayvan almak Levamizol için 5-10 dk bekleyintamamen hareketsiz ecome.
   2. Stiff Agaroz İmmobilizasyon: C. elegans fiziksel sert% 10 agaroz pedleri ve 0.05 mikron çaplı polistiren nanopartiküller kullanılarak immobilize edilebilir. 2.2 gibi% 10 agaroz pedleri (ağırlıkça NGM tamponunda 10% agaroz) olun. Ped üst boncuk çözeltisi ~ 3 ul (hacimce NGM içinde 1:10 oranında polistiren mikro kürecikler) ekleyin. Çabuk, 5-10 C almak pad üzerinde boncuk çözüm havuza ve yavaşça elegans bir kapak kayma ile kaplayın. Bu konumda tutmak için kapak kayma köşelerinde uygulanan erimiş balmumu kullanın. (Bu tekniği hakkında ek ayrıntılar için de bir önceki vallahi Madde ⁸ olarak ^7'ye bakınız)
   3. Yapıştırma: C. elegans hayvan bir tarafına uygulanır veteriner derece yapışkan küçük miktarlarda kullanarak yerine yapıştırılabilir.
   4. Mikroakışkan Cihazlar: Sayısız mikroakışkan cihazlar fiziksel C. tutmak için dizayn edilmiştir görüntüleme için yerinde elegans.
   </ Li>
4. Mikroskop hazırlanmış slayt yerleştirin ve istenilen nöron odaklanmak. Bu C. bulmak için en kolay yolu aydınlık alan aydınlatması ve düşük büyütme kullanarak elegans. Sonra yüksek büyütme ve bulmak ve belirli bir nöron odaklanmak floresan görüntüleme geçiş.
5. Uyarıcı: Belirli bir uyarıcı, bir nöronal tepkisi (ışık, elektrik alanı, tat ve koku ipuçları, sıcaklık vs) istenirse, uyarı cihazları o da hayvanlara tatbik edilebilir, öyle ki mikroskop kurulumu, uygun şekilde dizayn edilmelidir görüntüleme sırasında numune hazırlama.
6. Mikroskop CCD kamera kullanarak görüntü elde edin. Pozlama süreleri ve uyarma ışık seviyesi konkordan az zaman çözünürlüğü ile uzun pozlama süreleri gerektiren zayıf sinyallerle, temel sinyal ve fluorofor ifadesi düzeyine bağlı olacaktır. Biz genellikle ~ 300 milisaniye pozlama süreleri kullanın.
7. Bireysel veya bir ti olarak görüntüleri Edinmefilm beni-lapse. Çünkü C. elegans nöronlar genellikle yavaş aktivasyon dinamikleri (yani sodyum bazlı aksiyon potansiyelleri eksikliği) görüntülemek, ~ 1 sn nispeten yavaş kare hızları genellikle nöron dinamiklerini ölçmek için yeterlidir. Toplama oranları kadar ~ bu zayıf floresan için gerekli entegral süre ile sınırlı olabilir ancak saniyede 90 kare kullanılmıştır. Immobilizasyon hazırlık istikrarlı ve kare hızı nispeten yavaş eğer tek bir nöronun Bireysel filmleri kolayca birkaç dakika (~ 5-10 dk) veya daha uzun süre uzatabilir.

3. Veri Analizi

1. ImageJ ve NIS-Elements gibi dinamik ve rasyometrik analiz yetenekleri ile mevcut farklı floresan görüntüleme yazılım paketleri bir dizi vardır. Biz bir ilgi seçilen bölge üzerinde ortalama floresan sinyal ölçen basit bir özel MATLAB programı kullanın.
2. Görüntüleri tek tek (veya kalır time-lapse film içinkıpırdamadan) görüntülü nöron ve arka ölçüm için ayrı bir yakındaki bölgede faiz (ROI) bir bölge seçin. Ikili görüntülerin her biri için benzer YG ve arka plan seçin bölgeleri rasyometrik görüntüler için.
3. Time-lapse film içinde görüntülü nöronların küçük bir hareketi otomatik olarak çok sayıda nesne izleme düzenleri kullanılarak yapılabilir her çerçeve içinde ROI seçmek için ek bir analiz gerektirir. Bizim program bir kaba sınırı (tüm çerçeveler içinde çıkarların nesneyi kapsayan) elle seçilmiş ve bağımsız bir arka plan bölgesi seçildiği filmde tüm görüntüleri bir sıkıştırılmış görüntüler. İlk çerçeve için bir ROI el ile sınır bölgesi içinde arasından seçilir. Sonraki her çerçeve için, programın doğru boyutu (yani manuel ilk kare ROI olarak piksel aynı sayıda) bir yatırım getirisi oluşturmak için sınır bölgede en parlak piksel seçer. Görüntüler için nereye objecçıkarlarının t bu protokol her kare için makul bir yatırım getirisi seçer sınır bölgede çevreleyen arka planı sonra yeteri kadar parlaktır.
4. Her çerçeve için floresan sinyal, F, YG ortalama piksel yoğunluğu eksi arka bölgedeki ortalama yoğunluğu olarak hesaplanır. Oranlı metrik değerler -0.65 / iki sinyal oranı (YFP-YFP _{arka plan)} (CFP-CFP _{arka plan)} olarak hesaplanır. 0.65 faktör floroforlar bağlı olarak (bu değer genellikle Cameleon kurulumları için ~ 0.6) kullanılan belirli bir filtre grubu olacak YFP kanalı içine CFP kanalının akmasını dengeler.
5. , Hızındaki / F = (F (t)-F _o) / F: _o her çerçeve için göreceli kalsiyum seviyesi ilk karesi (veya çerçeve serisi) itibaren ölçülen ilk bazal değere normalize yoğunluğu yüzde değişim olarak hesaplanmıştır F (t) zaman t ve F _o da floresans neredeİlk taban değeridir.
6. Hücre gövdesi seçilmesi İB güçlü en güçlü sinyaller üretir fakat sinir süreçleri boyunca bir ROI gelen sinyal seçmek ve ölçmek için de mümkündür.

4. Problem Çözme

1. Bleaching: uyarma ışığa maruz fluorofor ağartma ve maruziyet düzeyleri bağlıdır sinyal sürekli bir azalma ile işaretlenmiş neden olabilir. Oranlı metrik ölçümler bunu telafi etmek için yardımcı olur. Bir dalga boyu ağartma Ancak seçici hala (hızlı sonra genellikle CFP ağartıcılar YFP) oluşabilir. Ağartma pozlama süreleri ve / veya uyarma yoğunluğu (aydınlatma yolağındaki nötral yoğunluk filtreleri ile) azaltarak ışığa maruz kalma seviyesini azaltmak oluşursa. Eğer gerekirse, bir sahte denemeler çalıştırma (tahrik maruz kalma aynı fakat hiçbir nöronal uyarıcı ile) ve sinyal çürüme zaman sabitini ölçülmesi ile ağartma telafi edebilir.
2. C.. elegans kayıt sırasında hareket ettirmek için en olası hale ışığa maruz kalma ve deneysel uyaranlara yanıt verir. Akson süreçlerinden ölçüm özellikle hafif hareketi ölçüme önemli paraziti üretebilir. Rasyometrik analizi hücre gövdesinden bir ölçüde ve ölçümlerde daha sağlam bu etkileri azaltmaya yardımcı olur. Dikkatli yürütme ve immobilizasyon prosedürlerin arıtma tamamen hareketsiz hayvanlarda neden olacaktır.
3. Arka plan Seçimi: bir arka plan bölgenin dikkatli seçimi başarılı bir görüntü analiz için gereklidir. Arkaplan bölgelerde makul üniforma ve görüntülü nöron sonra daha koyu olmalıdır. Bu yeterince görüntülü nöron gelen dağınık ışık (ve böylece alıcı bir sinyal) önlemek için kaldırılmalıdır. Biz bir üniforma bölge 20-5 bulabilirsinizROI, 0 mikron çoğu durumda iyi çalışır.
4. Rasyometrik Optik: görüntüsüz optikler Doğru uyum net bir çift görüntü üretmek için önemlidir. Rasyometrik görüntüleme için Ticari mikroskop ekleri mevcuttur. Alternatif bir teknik her biri için ayrı görüntüleri kaydederken hızla emisyon dalga boylarında arasında geçiş yapmak için hızlı bir filtre tekerleği kullanılarak hızlı sıralı görüntüleme istihdam etmektir.
5. Rasyometrik Analiz: analiz Burada anlatılan bir yatırım getirisi üzerinden ortalama sayesinde güçlü sinyaller üretir nispeten basit bir tekniktir. Bu ROI seçmek için tanınabilir parlak bir nesne gerektirir. Daha sofistike rasyometrik analizi tam floresan oranı piksel piksel hesaplanabilir böyle ikili görüntüleri hizalayarak ve haritalama ile mümkündür.

Representative Results

Burada iki ayrı deney sonuçlarını sunmak. İlk floresan kalsiyum gazetecilere optik bozulmadan C. nöronal etkinliği izlemek için nasıl kullanılabileceğini iyi bir örnek vererek, tanımlı bir dış uyarana belirli bir duyusal nöronun yanıtı ölçmek için GCaMP istihdam elegans. İkinci Cameleon geçici hücre içi kalsiyum böylece kalsiyum fizyoloji in vivo olarak, tek bir hücre içinde ölçülebilir nasıl çalıştığını gösteren, spesifik lazer hasara yanıt olarak bir nöron içinde tetiklenen ölçmek için kullanır. Her ölçümün teknik yönleri bireysel çalışma sonuçlarının detaylı olarak sunulmuş ve tartışılmıştır odaklanmak. Çoğu zaman (uyarıcı göre her bir zaman noktasındaki ortalama bir tepki olarak hesaplanır) veya belirli bir metrik (örneğin yanıt ortalama genliği gibi) üzerinden ortalama yanıt sayısız çalışmalar boyunca hesaplanır. Genellikle 10-20 denemeler kabul edilebilir ortalama ölçüm üretmek için gerekli fakat t vardıronun sayı yanıt doğal değişkenlik de bağlı olacaktır. Burada açıklanan deneyler için bu tür verilerin ^{analizi, 12} ve ¹³ içinde bulunabilir.

Duyusal yanıt GCaMP ölçümü: Güçlü bir dış elektrik alan (≥ 3 V / cm), C. tabi elegans aktif hassas yönettiği hareketi ile alanın negatif kutbuna doğru sürün. Biz daha önce bu electrotactic davranışı öncelikle hayvanın kafası ¹² bulunan sol ve sağ ASJ nöronlar, amphid duyusal nöronlar aracılık ettiğini göstermiştir. Bu tepki görselleştirmek için biz gpa-9 promotör altında sol ve sağ ASJ nöronlarda özellikle GCaMP3 ifade transgenik bir zorlanma kullanılır. Biz iki kapak camları (as prosedürlerde anlatıldığı) arasında sıkışmış 0.05% Levamizol içeren agaroz pedleri kullanarak görüntüleme için hayvanları hareketsiz. Elektriksel uyarı uyar özel yapılmış bir görüntüleme odası kullanılarak uygulandıters Nikon Ti mikroskop aşaması ^(12). Kısaca, kapak kayma hazırlık kapak kayma ile görüntüleme altında ve standart amaçları için erişim sağlayan küçük bir plastik odasında bir delik üzerinde (aşağı solucanı tarafı) yerleştirilir. Oda 0.25 mM NaCI ile doldurulmuş ve 50 mM gliserol tampon ve elektrik alanı uyarıcı odasının uçlarını kaplayan iki tane platin elektrot kullanılarak uygulanmıştır. Yukarıda tarif edildiği gibi, bir tek ASJ nöron CGaMP bir X100, 1.4 NA yağ daldırma objektif ve standart GFP filtresi kümesi kullanılarak görüntülendi ifade edilmesi. Üç ayrı çalışmada her biri 10 sn (Şekil 3) için harici 3 V / cm elektrik alan için hayvan tabi iken bir time-lapse film, 80 sn (1 kare / sn, 300 msn maruz kalma süresi) için satın alınmıştır. Yukarıda tarif edilen görüntü analizi ile hücre gövdesi floresans yoğunluğu ölçülmüştür. Video deney boyunca hareket ve odak kayması hem hafif hataları görüntüler. StGCaMP sinyal rength Ancak ^1. ve ^3. uyaranlara hem yanıt floresans büyük bir ~% 250 artış gösteren sağlam kalır. Ikinci uyarıcılara karşı sonuç esasen nöronal yanıt olarak değişkenlik gösteren azaltılır. Beyazlatma tutarlı bir başlangıç ​​seviyesine dönüş göre belirgin olarak azdır.

Hücresel kalsiyum fizyolojisi Cameleon ölçümü: Travmatik hücresel hasarın fizyolojik yanıtı dikte hücresel kaderi (yani hücre ölümü vs tamir süreçlerinin başlatılması) önemli bir rol oynayan bir nöronun içinde geçici büyük kalsiyum tetikler. Biz bireysel C. sever bir femtosaniye lazer kullanılarak in vivo bu hasarın bağlı yanıtı ölçebilirsiniz elegans nöronlar ¹⁴ aynı anda Cameleon YC3.60 ^{13, 15} kullanarak, hücre içi kalsiyum sinyallerini ölçme iken. Altı mechanosensory nöron (altında Cameleon YC3.60 ifade Hayvanlarmec-4 promotör) gibi işlemleri tarif% 10 agaroz ve polistiren nanopartiküller ile immobilize edildi. Biz prosedürlerde anlatıldığı CFP ve YFP floresans kanalları hem gelen sinyalleri kaydetmek için çift görüntüleme optik istihdam. Tek bir ALM nöron görüntülenmiş ve lazer akson ~ hücre gövdesi (Şekil 4A), 20 mikron hedeflenmiştir. Akson görüntüleme nesnel (lazer cerrahisi ile ilgili ayrıntılar için bkz: ¹³⁾ tarafından akson boyunca hedef noktasına odaklanmış kızılötesi lazer darbeli bir femtosaniye gelen ışık kısa (<1 sn) maruz tarafından kesildi. Lazer cerrahisi ve rasyometrik analizi kullanılarak hesaplanan kalsiyum düzeyleri yaparken 400 msn pozlama süreleri ile bir çerçeve her 3 sn de Time-lapse görüntüler 320 sn kaydedildi.

Sinyaller hücre gövdesi (Şekil 4B) de ve kesim noktası (Şekil 4C) 5 mikron olan akson segment için ayrı ölçüldü. Rakamlar hem C gösterinAP ve YFP yoğunlukları hem de sonuçta ortaya çıkan oran FRET. Hücre vücut ölçümü de CFP hızla azalmakta ve YFP t = 0 sn (kırmızı ok) lazer hasara yanıt olarak artan davrandım edilir. Yakın taban seviyelerine kadar inmeden önce ~ 90 saniye boyunca devam rasyometrik sinyali (hızındaki / F) bir derhal ~% 200 artış ile sonuçlanır. Beyazlatma tutarlı başlangıca belirgin olarak azdır.

Kesme noktasına yakın akson segmentinde, fluorofor lokal miktar sinyal karmaşıklaştırarak, deney boyunca değişir. Lazer cerrahisi akson koparır ve kısaca fluorofor kaçmak ve geçici yerel sitoplazmik konsantrasyonu azaltmak için izin zarlarını. Bu Şekil 4C YFP iz bir başlangıç ​​azalma ve çarpı t = 0 sn ve t = 6 sn, Şekil 4A YFP görüntüleri hasar noktasının yakınında akson segmentinde bir karşılaştırma bellidir. La Atter zaman noktalarında, kopmuş sonunda daha fazla lokalize fluorofor ve yoğunluğu artış sonucunda, devam eden kurtarma parçası olarak şişer. Bu Şekil 4C ve çarpı t = 0 sn ve t = 270 sn, Şekil 4A CFP görüntülerde akson segmentinde bir karşılaştırma yavaş artan CFP iz en belirgindir. Ancak bu varyasyonlar eşit iki kanal etkileyen ve FRET oranının etkin dengeler. Ortaya çıkan ölçüm sinyali hemen bir ~% 150 artış (hızındaki / F), ~ 90 sn yakınında başlangıca dramatik bir iyileşme ve daha sonra ~ 150 sn ek küçük orta yanıtı hücre gövdesine benzer bir tepki gösterir. Bu nöron nöron ve cerrahi cerrahi yaygın olarak değişebilir diğer etkilerden kalsiyum sinyali ayırmak için son derece zor olacak gibi rasyometrik analizi bu ölçüm için çok önemlidir. Akson sinyal floresans sönük öncelikle nedeniyle hücre gövdesi sinyali vermek ve kıyasla daha fazla gürültü vardar akson daha küçük ROI.

Şekil 1. Temel kurulum ve rasyometrik optik. A) fotoğraf bir ters mikroskop bileşik ve rasyometrik optik görüntüleme oluşan deney düzeneği gösterilmektedir. B) rasyometrik FRET bazlı ölçümler için gerekli optik görüntüleme gösteren bir şematik diyagramdır. Görüntü CCD dizi yan yana öngörülen iki dalga boyu veya kanallar, ayrılmıştır.

Şekil 2. Numune hazırlama. C. elegans görüntüleme için agaroz ince pedler üzerine monte edilir. A) Agaroz pedler, küçük bir damla sandviçlenmesine yapılırİki mikroskop arasında erimiş agaroz laboratuvar bant iki adettir. B) Hayvanlar agaroz ped üzerine transfer edilir ve dört köşe her birinde wax küçük bir miktar ile yerinde tutulan bir lamel ile kaplanmıştır ile aralıklı kayar.

Şekil 3,. GCaMP örnek veri. GCaMP sinyali, bir / elektrik alanı (yeşil iz) kapalı alternatif yanıt ASJ nöronun hücre gövdesi in vivo olarak kaydedilen hızındaki / F,. Kalın çizgiler gri harici elektrik alanını (3 V / cm) bir hayvana uygulanan süreleri göstermektedir. Ölçek çubuğu floresan yoğunluğu% 100 artış gösterir.

Şekil 4. Cameleon örnek veriler. A) Üç ayrı karelerde çift görüntü gösterenhücre gövdesinden akson 20 mikron lazer cerrahisi öncesi ve sonrası bir ALM nöronun görüntüleyebilirsiniz. Orta panelde kırmızı ok kesim noktasını gösterir. Alttaki panel hücre gövdesi ve B ve C sinyallerini üreten akson segmentinde gösterir. B) lazer cerrahisi (kırmızı ok). C) Cameleon YC3 öncesi ve sonrası ALM nöronun hücre gövdesi ölçülen Cameleon YC3.60 sinyali .60 sinyal lazer cerrahisi öncesi ve sonrası kesim noktası 5 mikron olan akson segmentinde ölçülür. Sarı izleri mavi izleri çıkan oran FRET olan OBP sinyalleri ve portakal izlerini göstermektedir YFP sinyalleri göstermektedir. Tüm Zamanlar lazer cerrahisi zaman görecelidir. Ölçek çubuklar floresans şiddetinin% 100'lük bir artışı ifade etmektedir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Discussion

Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri yaygın C. kullanılmıştır elegans nörobiyoloji. Birçok grup bir elektrik alanına ASJ yanıtı burada gösterildiği gibi dış uyaranlara primer duyu nöronlarının yanıt incelemek için bu teknikler istihdam var. Tanınmış örnekler mekanik dokunma hissi, özel kimyasallar, sıcaklık ve elektrik alan ^{12, 16-19} içerir. Interneuron ve kas hücrelerinin aktivitesi uyarıcıya tepki olarak ve hayvan davranışı kontrol hem de izlenmiştir. Bu çalışmaların çoğu bu teknikler kısmen bağlanmış ya da hatta serbestçe hareket eden hayvanlar hem de aynı anda birden fazla nöronların kayıt nöronların bir kayıt sağlamak için resim tanıma ve izleme teknikleri kullanılarak daha ileri bir adım itmiştir. Ek çalışmalar, hem de burada gösterildiği gibi nöronal hasar ^{13, 20} karşı tepki olarak kalsiyum fizyoloji diğer yönlerini araştırmıştıruzun zaman ölçeklerinde ²¹ nöronal dejenerasyon.

Belirli bir deney tasarımında yaygın olarak kullanılan kalsiyum gazetecilere ve hayvan immobilizasyon ilgili alternatif tekniklerin her biri dikkatle düşünülmelidir. İmmobilizasyon teknikleri tür hayvanın fiziksel erişim için ihtiyaç, görüntüleme ya da yüksek verimlilik ihtiyacını takiben hayvanlar kurtarmak için yeteneği gibi teknik yönlerini tarafından dikte edilecektir. Farklı flüoresan kalsiyum gazetecilere sıra özgü avantajları ve dezavantajları vardır. GCaMP basit tek kanallı görüntü analizi kullanır ve büyük sinyal-gürültü oranı birçok durum için uygulanabilir hale getirir. Öte yandan Cameleon daha karmaşık görüntüleme ve analiz gerektirir, ancak oluşan rasyometrik ölçüm potansiyel olarak büyük bir eşya ile durumlarda kritik öneme sahip olabilir. Örneğin, fluorofor miktarı (lazer hasar örnekte olduğu gibi) dalgalanmalar da uzun zaman periyotları boyunca oluşabilir(Saat) ifade düzeylerindeki değişiklikler nedeniyle. Ek ikili görüntüleme stratejilerini gibi (ya da fiziksel olarak bağlı) bir TTT florofor ile birlikte ifade GCaMP olarak da mümkündür. FRET dayalı olmasa da gerçek zamanlı bir temel ölçü olarak kırmızı kanal kullanırken bu modern GCaMP varyantlarının geniş dinamik aralık yararlanmak istiyorsunuz.

O çok iki kanal görüntüleme mikroskop sistemleri ve analiz yazılımları genellikle daha pahalı ise, burada açıklanan ev inşa sistemi oluşturmak için isteksiz araştırmacılar için cazip olabilir, hangi piyasada mevcuttur dikkat etmek önemlidir. Ticari çift görüntüleme sistemleri (DualView2-DV2, Fotometrik) genellikle bizim ev inşa sistemine benzer optik kullanın ancak standartlaştırılmış uyum prosedürleri ile tek bir mikroskop eki içinde yer alır. Alternatif olarak, hızlı filtre değişimi sistemleri (Lambda DG-4/DG-5 Plus, Sutter Aletleri) iki renk kanalının hızlı gerçek zamanlı sıralı görüntüleme wi izinEk görüntüsüz optikler thout ama aynı zamanda pahalı ve filtre değişimi ve kamera satın alma arasındaki hassas senkronizasyon gerektirir.

Özet olarak, C. elegans in vivo görüntüleme sistemi içinde olduğu gibi bir çok avantaj sunar. Genetik olarak kodlanmış floroforlar genellikle hücreye özgüdür ve enjekte veya eksojen floroforlar yönetimi ihtiyacını ortadan kaldırabilir. C elegans optik erişilebilirlik kolay ve korumak için uygun maliyetli olan bozulmamış hayvanlardan içinde görüntüleme, karmaşık diseksiyon veya nöronal kültür gerektirir ve hücre fizyolojisi korumak değil sağlar. Buna ek olarak, C. elegans mevcut genetik reaktifler ve iyi bilinen teknikler çok sayıda Genetik analiz için büyük yetenekleri vardır. Elbette dezavantajları sistemi vardır, birincil endişe belki de bir omurgasız olmak olduğunu. Buna ek olarak, floroforlar kalsiyum konsantrasyonu rathe göreli değişiklikleri rapormutlak değer ve ölçümler zaman çözünürlüğü daha r fluorofor dinamikleri, aynı zamanda zayıf floresan sinyallerin gerekli entegrasyonun iki kere ile sınırlı olabilir. Sonunda ise kalsiyum nöronal aktivitenin ayrılmaz bir parçasıdır ve floroforlar sinyal direkt olarak elektrofizyolojik yöntemler ile ölçülen membran voltaj potansiyeli rapor yok. Bununla birlikte, burada sunulan prosedürler C ile izah elegans nöronal görüntüleme çalışmaları geniş bir yelpazede için cazip, nispeten basit, düşük maliyetli bir sistemdir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eclipse Ti-U inverted microscope	Nikon
Intensilight HG Illuminator	Nikon	C-HGFI	Fluorescent light source
CFI Plan Apo VC 60X Oil	Nikon
Optical table or 3'X3' optical grade breadboard	Thor Labs		If an optical table is not used an optical grade breadboard on a solid laboratory bench should suffice.
Clara Interline Camera	Andor Technology		High-sensitivity CCD camera
wtGFP Longpass Emission	Chroma Technology Corp.	41015	GFP filter set for imaging GCaMP
Filter 440 +/- 10 nm	Chroma	D440/20x EX	excitation filter for cameleon
Dichroic mirror > 455 nm longpass	Chroma	455DCLP BS	microscope dichroic for cameleon imaging
Dichroic mirror > 515 nm longpass	Chroma	515DCLP BS	dichroic mirror for cameleon imaging
Filter 535 +/- 15 nm	Chroma	D535/30m EM	YFP emission filter
Filter 480 +/- 20 nm	Chroma	D485/40m EM	CFP emission filter
Lens, 200 mm, Achromat	Thor Labs	AC508-200-A1	Relay lens for FRET optics (3)
Silver broadband mirror	Thor Labs	ME2S-P01	FRET optics (2)
NGM buffer
Levamisole	Sigma
Polybead Microspheres	Polysciences, Inc.	08691-10, 2.5% by volume, 50 nm diameter	polystyrene nanoparticles for C. elegans immobilization
Transgenic strain, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg)	Sternberg Lab	Strain PS6388
Transgenic strain, mec- 4::YC3.60	Gabel Lab	Strain CG1B