Summary
Alcançar um nível de compreensão dos processos celulares de sistemas é uma meta da biologia celular moderna. Descrevemos aqui as estratégias para jornalistas luciferase multiplexação de várias funções celulares de pontos finais para interrogar a função do gene usando genoma escala bibliotecas RNAi.
Abstract
Interrogatório da função do gene usando RNA de interferência (RNAi) genoma escala detém uma grande promessa para a rápida identificação de vulnerabilidades de células de câncer quimicamente tratáveis. Limitar o potencial desta tecnologia é a incapacidade de delinear rapidamente a base mecanicista de resultados fenotípicos e, assim, informar o desenvolvimento de estratégias terapêuticas molecularmente alvo. Nós delineamos aqui métodos para desconstruir fenótipos celulares induzidas pelo gene RNAi mediado alvo usando sistemas repórter multiplexados que permitem a monitorização do câncer de processos-chave associados a células. Esta metodologia de rastreio de alto conteúdo é versátil e pode ser facilmente adaptado para o rastreio de outros tipos de grandes bibliotecas moleculares.
Introduction
Uma variedade de repórteres de luciferase de base para monitorizar uma matriz diversificada de processos biológicos celulares estão comercialmente disponíveis. A maioria destas construções de ADN que codificam proteínas de luciferase são induzidas para expressar por estímulos específicos de células ou perturbações. Os sólidos repórteres maioria baseados na transcrição colocar a expressão de uma enzima da luciferase sob o controlo de elementos potenciadores sintéticos ou regiões promotoras de genes bem estabelecidos para a sua fiabilidade em um relato de eventos de transcrição 1,2 fisiologicamente relevante. Há também sistemas de trans-repórter de luciferase que utilizam GAL4-UAS para dirigir a expressão da proteína luciferase. Gal4 é um activador da transcrição de levedura e as UAS é um potenciador para o qual se liga especificamente Gal4 para activar a transcrição de sequências de genes colocados a jusante do mesmo 3. Estes tipos de sistemas de luciferase são tipicamente suportado por dois plasmídeos de ADN - uma codifica a proteína GAL4 fundido com o regulatory porção de uma proteína de interesse e o segundo codifica uma proteína da luciferase colocado sob o controlo de uma ou mais sequências UAS. Assim, o sinal de luciferase celular reflecte o nível da actividade da proteína de interesse. Outra utilização comum de repórteres de luciferase de base é para monitorizar a estabilidade da proteína em que uma proteína de interesse é fundida a uma enzima luciferase 4. Independentemente do tipo de repórter, um caveat.emptor é notado aqui como não se pode assumir a especificidade de qualquer repórter ter sido bem interrogados. Assim, due diligence é necessária a incorporação de novas construções repórter em qualquer estratégia de pesquisa.
A selecção da enzima luciferase a leitura pode ser tão importante como a fiabilidade dos elementos de DNA que controlam a sua expressão. Considerando que a luciferase do pirilampo (FL) é a enzima mais utilizada em construções comercialmente disponíveis, o advento de novos sistemas de repórter da luciferase que não necessitam de ATP (como no casode reações baseadas FL) ou que incorporem enzimas mais estáveis que emitem sinais mais fortes prometem melhorar a eficiência ea confiabilidade desta plataforma de pesquisa. Uma nota importante sobre a selecção de repórteres de luciferase em estudos químicos é a susceptibilidade de FL para inibição química que poderia dar origem a relatórios falsos. Na nossa experiência, outras enzimas, tais como a luciferase de Renilla, ou Gaussia (RL e GL, respectivamente), que utilizam como substrato coelenterazina são menos facilmente inibidas por moléculas pequenas 5.
O formato mais comum para multiplexação de luciferase leia-outs implica a utilização de FL e RL, em grande parte devido à disponibilidade de fácil de usar kits com a capacidade de medir actividades enzimáticas sequencialmente a partir de uma única amostra. Na maioria dos jogos, as amostras são expostos primeiro a luciferina para revelar os níveis de actividade FL seguido por um reagente de extinção que é depositado simultaneamente com coelenterazina para originar um em segundasinal RL dary. Com a adição de outras luciferases de que podem ser segregadas, tais como GL ou que o uso de um outro substrato, tal como a luciferase Cypridina (CL), um maior número de possibilidades para a geração de dados de conteúdos elevados utilizando luciferases emergiram. Um exemplo de uma tela de RNAi do genoma usando esta técnica pode ser encontrada aqui 6. Estes avanços tecnológicos têm por sua vez, estimulou o desenvolvimento de mecanismos específicos para extinguir cada tipo de enzima luciferase a fim de limitar a conversa cruzada 7. Em nossas mãos, notamos uma maior freqüência de "efeitos de borda" (tendências inexplicáveis na atividade celular associada à beira de placas de cultura de alta titulação), com luciferases secretadas como GL ou CL. Por outro lado, tais luciferases secretadas são úteis para ensaios cinéticos, pois permitem a amostragem do sinal sem adulterar a viabilidade celular.
Para o nosso estudo apresentado aqui, vamos monitorar simultaneamente a atividade de três câncer relevanteprocessos celulares: o p53, Kras, e vias de sinalização Wnt. Os repórteres incorporados no nosso estudo são a FL repórter PP53-TA-Luc de Clontech (doravante referido como o repórter p53-FL) 8, um sistema repórter Elk1-GAL4/UAS-CL (doravante, Elk-1 repórter; Agilent), eo 8X TCF RL repórter que incorpora vários elementos potenciador sintéticos reconhecidos pela via Wnt reguladores de transcrição, conhecidos como fatores de células T (ou TCFs) 9-11.
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Protocol
Protocolo inteiro leva cerca de 4 dias.
1. Preparação de células para siRNA e Reporter transfecção
Vamos introduzir aqui um protocolo para interrogar bibliotecas de siRNA usando um pequeno conjunto de siRNAs (384 matriz diferente piscinas siRNA em formato de 96 poços com cada conjunto constituído por siRNAs 4x destinada a um único gene) a partir de uma biblioteca de siRNA de todo o genoma para fins ilustrativos. Para este estudo particular, vamos explorar HCT116 células que apresentam sinalização Wnt e Kras desviantes e atividade p53. A linha celular adequada em estudos destinados a interrogar outros processos celulares de interesse terão de ser identificado e avaliado de uma maneira semelhante.
- Lavar 5 x 10 cm 2 placas de 80-90% confluentes, as células HCT-116 com PBS, em seguida as células por tripsinização de colheita utilizando 1 ml de solução de tripsinização / placa, seguido de neutralização com 10 mL de Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 2% feTal soro de bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina / placa.
- Transferência de células em suspensão para um tubo cónico de 50 ml e centrifugar a ~ 130 x g durante 5 minutos, remover o sobrenadante, e re-suspender o sedimento celular em 10 ml de DMEM / FBS a 2% / 1% de penicilina / estreptomicina.
- Conte o número de células com um contador de células e em seguida, fazer uma solução de células com 10 5 células / ml, manter 150 ml de suspensão celular para o próximo passo. Placa 10 4 células (100 ul) em cada poço de uma placa de cultura de células de 96 poços utilizando um dispensador de liquido Multidrop automatizado (doravante Multidrop). A suspensão de células deve ser suficiente, neste caso, para chapeamento de 12 x placas de 96 poços.
- Incubar as placas com as células a 37 ° C numa incubadora com 5% de CO 2 durante a preparação da mistura de transfecção.
2. Preparando-se construir o Reporter Banco Solution
- Isolar repórter de alta qualidade construir DNA usando o padrão midiprep kits (NucleoBond Xtra Midi produzido porClontech) e diluir o ADN para uma concentração final de 1 mg / ml para cada repórter.
- Prepare a 100 ul de solução de reserva de construção repórter combinando 30 ul de p53-FL, 30 ul de 8X TCF-RL, 30 ul de Elk1-Gal4, 6 ul de UAS-CL e 4 mL de H 2 O para obter uma mistura de ADN com uma proporção final 1:1:1:0.2 dos repórteres. Concentração de ADN final desta solução estoque mistura de ADN é de 0,3 mg / ml.
3. Preparando o siRNA / DNA Mix transfecção
Nesta parte do protocolo, vamos preparar siRNA / DNA misturas de transfecção, que será suficiente para a transfecção de 12 x placas de 96 poços. Para este ensaio de biblioteca de 4 x placa de 96 poços de siRNAs, vamos transfectar cada pool de siRNA em triplicado. O reagente de transfecção usaremos é chamado Effectene (Qiagen). Nas nossas mãos este é o único reagente, que funciona para a entrega simultânea de siRNA e DNA em células em cultura.
- Diluir 80 ml de repórter construção estoque soluição em 8 ml de tampão de CE (Effectene Kit) para obter uma solução de DNA com uma concentração final de 3 ng / ml. Em geral, preparar suficiente mistura solução de ADN para uso imediato.
- Placa de 20 ul desta solução de ADN para cada poço de um de 96 poços / placa. O número de placas de 96 poços vai depender de quantas piscinas siRNA será testado. Por exemplo, neste caso, vamos precisar de 4 x placas de 96 poços para avaliar 384 diferentes conjuntos de siRNA.
- Os siRNAs a serem testadas devem estar a uma concentração de estoque de 5 mM. Caso contrário, eles podem ser semeadas réplicas e diluída para esta concentração, utilizando o tampão de diluição recomendada associado com cada biblioteca.
- Transferir 2 ul de cada unidade siRNA 5 uM para o correspondente poço da placa de PCR contendo o estoque de ADN diluída com uma Biomek Automated Liquid Handler. Dependendo da escala do estudo, uma pipeta multi-canal pode ser suficiente.
- Agora, será adicionado 1 ul de solução de realçador (Effectene kit) para cada poço de DNA / siRNA plate. Isto também pode ser conseguido ou com um manipulador de líquidos ou automatizado pipetador multicanal.
- Permitir que a reacção Enhancer a ocorrer à temperatura ambiente durante 5 min, em seguida, adicionar 3 ml de reagente de transfeco Effectene a cada poço e incubar à temperatura ambiente durante um adicional de 10 min.
- Para parar a formação de complexos de transfecção, adicionam-se 10 ul de DMEM / FBS a 2% / 1% de penicilina / estreptomicina a cada poço da placa de PCR.
- Transferem-se 10 ul da mistura de transfecção a cada poço da placa de 96 poços contendo as células (recuperados a partir da célula incubadora). À medida que cada transfecção serão realizados em triplicado, a mesma mistura será aplicada a duas placas de 96 poços contendo células adicionais.
- Incubar as células com misturas de transfecção adicionados a 37 ° C num ambiente humidificado com 5% de CO 2 durante 36 horas.
4. Determinar as respectivas actividades de luciferase a partir de amostras de células
Após 36 horas, as atividades de luciferase estão prontos para a mediçãoem células transfectadas. O desfecho deve ser determinada em uma base per-experimento. Em nosso estudo, um tempo de incubação de 36 horas já havia rendido um sinal suficientemente robusta para significando determinação resultado. Como este estudo incorpora múltiplos repórteres (um segregada para o meio de cultura, e os outros dois expresso no citoplasma da célula), vamos obter a partir de medições tanto meio de cultura, assim como um lisado celular.
- Detecção de actividade de CL no meio de cultura:
- 20 mL de meio de cultura é réplica banhado em uma placa de 96 poços opaco branco (usando o líquido Handler Biomek ou pipeta multicanal).
- Adicionar 20 ul de tampão de ensaio CL (Targeting Systems) a cada poço.
- Adicionar 10 ul de substrato luciferina Cypridina (Targeting Systems) a cada poço e detectar a actividade CL utilizando um luminómetro (o leitor de placas Pherastar produzido por BMG, por exemplo).
- Detecção de actividade de FL e RL:
- Lyse do cells primeiro por remoção do meio de cultura. Isto pode ser realizado rapidamente rodando placa invertida e jogando médio em uma pia. Meio restante pode ser removido batendo suavemente a placa de cabeça para baixo sobre toalhas de papel. Adicionar 30 ul de 1x tampão de lise passiva (Promega) a cada poço de células usando o Multidrop e coloque numa plataforma oscilante (Bélico é uma empresa que fabrica estes) definir uma velocidade média, durante 5 min à TA.
- Adicionar 20 ul de Reagente de Ensaio da Luciferase II (parte do kit Promega Luciferase Duplo) utilizando a actividade FL Multidrop e medir imediatamente usando o luminómetro. Em seguida, adicione Stop & Glo Reagente (Promega), que irá saciar a atividade FL e permitir a medição da atividade RL. Nota: a menos que você estiver usando misturas de substratos que permitem duração do sinal estendido (como Kits de luciferase Dual-Glo da Promega), o uso do flash kits exige uma rápida medição com a adição de substrato (dentro de 5 min).
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Representative Results
Apesar dos avanços no mapeamento da paisagem mutacional de vários tipos de câncer usando enormes esforços de seqüenciamento do genoma 12-14, ainda não tem em lugar de uma abordagem sistemática para traduzir estas observações em estratégias de intervenção. No câncer colorretal (CRC), as mutações que estão previstos para afetar os componentes de três processos celulares - Wnt / β-catenina, p53, e Kras sinalização - são encontrados em 99% de todos os tumores, sugerindo que eles são fatores-chave de transformação celular no intestino 13. Assim, o câncer de conjuntos de dados do genoma são provavelmente enriquecida para genes que suportam câncer denominador comum promoção de processos, e que pode ser explorada para a rápida identificação de vulnerabilidades de células cancerosas. Para investigar esta hipótese, nós planejamos estratégias passíveis de interrogatório de alto rendimento da função do gene em relação ao Wnt / β-catenina, p53, e Kras sinalização. Primeiro, demonstrar a especificidade de cada um repórter em um único reporter testes (Figura 1) e, em seguida, fornecer provas de que estes repórteres podem ser usados em conjunto para medição simultânea da actividade do gene de estas três importantes processos celulares (Figura 2).
Figura 1. Ensaios baseados em luciferase de alto rendimento para o monitoramento Wnt / β-catenina, p53 e Kras / Erk estado caminho em células de mamíferos. A robustez de três plataformas de rastreamento diferentes foram avaliados individualmente antes de multiplexação usando siRNAs controle visando componentes da via bem estabelecidas. Linhagens de células de câncer colorretal indicados foram transfectadas com o 8X TCF, PP53-TA-Luc, ou Elk-1 vaga-lume repórter luciferase-encoding constrói juntamente com piscinas de siRNAs segmentação β-catenina, p53, ou Kras, respectivamente. Pathway-genótipos relevantes para cada linha de células são indicados. A força de cada plataforma de triagem foi avaliada pela reprodutibilidade destes efeitos siRNAs induzidas na via de transdução do sinal relevante. Os siRNAs β-catenina têm nenhum efeito sobre a actividade repórter 8X TCF em células RKO, em contraste com a DLD-1 e HCT-116 células que são, respectivamente, deficiente na via da proteína supressora de APC e expressam uma forma activada de β-catenina. clique aqui para ver maior figura .
Figura 2. Multiplexação jornalistas baseados luciferase para análise celular high-conteúdo da função do gene. A. Representação esquemática de uma estratégia para monitorar simultaneamente Wnt / β-cat Lenin, p53 e atividades via Kras. FL = firefly luciferase, RL = Renilla luciferase, CL = Cypridina luciferase (enzima secretada). Actividades FL e RL no lisado são determinados utilizando luciferina e substratos coelenterazina. CL actividade no meio de cultura é medida usando a oxiluciferina. * Outros sistemas repórter pode ser incorporado neste protocolo para aumentar o conteúdo de cada experimento. Por exemplo, o ensaio Cytotox farinha pode ser utilizada para monitorizar a toxicidade celular por amostragem dos níveis de uma protease intracelular libertado para o meio de cultura. A adição do reagente de ensaio Cytotox não influencia a actividade do repórter CL. B. Identificação de vulnerabilidades específicas via utilizando RNAi. A capacidade do sistema luciferase multiplexados descrito em "A" para quantificar a dedicação de genes para a função celular foi testada usando as piscinas siRNA indicados.nk "> Clique aqui para ver a figura maior.
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Discussion
Existem vários fornecedores de sistemas repórter baseados em luciferase (tais como Promega, Targeting Systems, New England Biolabs, e Thermo Fisher) que fornecem úteis recursos on-line para aqueles entreter uma tela de alto rendimento para a primeira vez. Além disso, uma série de excelentes comentários sobre a otimização do uso de telas de alto rendimento para a descoberta dos genes e como baseada em RNAi resultados de rastreio pode ser integrado com conjuntos de dados-omics baseados outro deve ser útil 15,16. Os métodos para a seleção de "hits" de telas de alto rendimento são o tema de outra discussão que está além do escopo deste relatório. Vários comentários sobre este tópico estão disponíveis 17,18. No entanto, um critério importante para a validação de acessos selecionados de telas baseadas na utilização de repórteres transcricionalmente activados é a capacidade para a mesma perturbagen (RNAi ou quimicamente com base) para induzir o mesmo efeito sobre os genes alvo validados como medido por RT-PCR, qPCROu análise de microarray. Para além disso, ter em mente que a magnitude da resposta medida pelo repórter é tipicamente maior do que a indução de uma repórter endógeno, dado que uma característica de um repórter com sucesso sintético é proporcionar um sinal robusto. Finalmente, uma vantagem desta estratégia de co-transfecção é a facilidade com que se pode montar rapidamente cocktails diferentes repórter para monitorizar um conjunto desejado de actividades celulares. Apesar de ser mais trabalhoso, a utilização de linhas celulares de forma estável, contendo os repórteres provavelmente aumentar a relação sinal-ruído, dada a variabilidade da resposta agora é principalmente limitada a eficiência de transfecção de siRNA sozinho.
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Disclosures
OK e LL são autores de uma patente pendente relativa ao multiplexados tecnologia luciferase.
Acknowledgments
Reconhecemos o apoio financeiro do CPRIT (RP100119) e da Fundação Welch (I-1665).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| PathDetect Elk1 Trans-Reporting System | Agilent Technologies Inc. | 219005 | |
| Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector | Clontech Lab Inc. | 631914 | |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen Inc. | 301427 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega Corp. | E1960 | |
| Cypridina Luciferase Assay reagent | Targeting Systems | VLAR-1 | |
| HCT116 cells | ATCC | CCL-247 | |
| CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay | Promega Corp. | G9260 | |
| EQUIPMENT | |||
| MultiFlo Microplate Dispenser | Labsystems Inc. | Model 832 | |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter Inc. | A31842 | |
| PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader | BMG Labtech Inc. | 0471-101A | |
| Bright-Line Reichert Hemacytometers | Hausser Scientific Company | 1490 | |
References
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