Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תת קבוצות של מבשר B-תאים מדם הטבורי. כמות ואיכות מספקת של חומצות גרעין עשויה להיות מופקים מהתאים והשתמשו במבחנים הבאים ניצול DNA או RNA.
Abstract
דם חבל טבור מועשר לתאי אבות היווצרות דם בשלבי מחויבות שושלת שונים. פתחנו פרוטוקול לבידוד מבשר תאי B בארבעה שלבים שונים של בידול. בגלל גנים בא לידי ביטוי ושינויי epigenetic להתרחש באופן ספציפי רקמות, הוא חיוני, כדי להבדיל בין רקמות וסוגי תאים כדי להיות מסוגל לזהות שינויים בגנום וepigenome שעלול להוביל להתפתחות של מחלה. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לכל סוג של תא בהווה דם טבורים בכל שלב של דיפרנציאציה.
שיטה זו כוללת 4 שלבים עיקריים. ראשית, תאי mononuclear מופרדים על ידי צנטריפוגה צפיפות. שנית, תאי B מועשרים באמצעות נוגדנים מצומדות ביוטין שמכירים ולהסיר תאי B שאינם מתאי mononuclear. שלישית את B-תאים מסומנים fluorescently עם נוגדני חלבון בתא שטח ספציפיים לשלבים בודדיםהתפתחות תא B-. לבסוף, את התאים שכותרתו fluorescently מסודרים ואוכלוסיות בודדות הם התאוששו. התאים התאוששו הם בכמות ובאיכות מספקות כדי להיות מנוצלת במבחני חומצות גרעין במורד זרם.
Introduction
על מנת לזהות את הסטיות שנמצאות במחלה, חשוב וחיוני שאנו משתמשים רקמות או תאים שמתאימים לסוג הרקמה או תא המושפע מהמחלה בריאות. אחת סיבות לכך היא שוריאצית epigenetic בין סוגי רקמות היא אחראית לויסות התבטאות של גנים שהן קריטי להתמיינות תאים במהלך ההתפתחות האנושית 1,2 הנורמלי. סיבה שנייה היא שהרגולציה של הגנים ספציפית החריגה הרקמה עלולה להיות השלכות חמורות על התפתחות נורמלית וידועה לתרום למספר רב של מצבי מחלה, כוללים סרטן. לכן, הבנה טובה יותר של מחלה המערבת תאי hematopoietic דורשת ידע בתאי hematopoietic בריאים.
הפיתוח של תאי hematopoietic בתמורת מח העצם באמצעות סדר שיטתי של אירועים המתאפיינים בשינויים בביטוי של סמנים פני תא 3. מחקרים שכלל משתתף מבוגרים ישהראה כי מוח עצם מכיל בדרך כלל מספר נמוך של מבשר תאי B 4,5, ואילו מחקרים שכלל ילדי משתתפים הראו כי אחוז מבשר תאי B הוא גבוה יחסית אצל אנשים פחות מ 5 שנים של גיל 6. דם חבל טבור משמש כמקור לתאי גזע hematopoietic בטיפול בהפרעות ומחלות ממאירות הקשורות בדם, הוא זמין דרך בנקי דם טבורים ומועשר לB לא בוגר ותאי T 7 שהם תאי המטרה של הפרעות רבות, כולל לוקמיה ו לימפומה.
מבשר תאי B במח העצם כבר phenotyped הרחבת 8,9 ויכול להיות מוגדר על ידי הנוכחות של סמנים בתא שטח ספציפיים שניתן להשתמש בם כדי למיין תאים אלה לקבוצות משנה נפרדות. תמורה נורמלית B-cell בידול באמצעות סדרה של שלבים במח העצם, החלו בתאים המוקדמים פרו-B וכלה בתאי B בשלים או נאיביים. פיולאן Zelm ועמיתים 10, תאים פרו-B מאופיינים על ידי הנוכחות של CD34 ובמעבר לשלב 2 (Pre-BI) CD19 נרכש. שלב 3 (Pre-BII) תאים אינם מפורשים CD34 ולהתחיל לבטא IgM cytoplasmic. לבסוף, מאפיין בולט של שלב 4 (לא בוגר תאי B) הוא הביטוי של IgM פני שטח. אסטרטגית המיון המתואר בפרוטוקול זה תואר לראשונה על ידי קאלדוול ועמיתים 6 וכוללת את השימוש של רק 3 סמנים בתא שטח אשר מקטינים מאוד את המורכבות והעלות של ביצוע ניסויי מיון תא. בעבודתם, יחסים בין CD45 ושלבי התמיינות תא B הוקמו. הם הבחינו כי B-תאים במח עצם הצגת רמות משתנות של ביטוי של CD45. באופן ספציפי, תאים שהביעו רמות גבוהות של CD45 התכתבו לתאים המבטאים את IgM משטח (-B תאים לא בשלים), אלה שהביעו רמה בינונית של CD45 התכתבו לתאים שהביעו cytoplasmic IgM (תאים טרום BII), ואלה שהביעו רמות נמוכות של CD45 התכתב לתאים שלא מבטאים IgM cytoplasmic (תאים טרום BI). פרוטוקול זה משתמש באסטרטגיה שפותחה על ידי קאלדוול ועמיתים 6 לבודד תת קבוצות של מבשר תאי B מדם הטבורי (איור 1) אשר ניתן להשתמש במבחנים הדורשים זרם חומצות גרעין באיכות גבוהה כגון assay התאוששות האי מפוגל-CPG (מירה ) 11 ומבחנים PCR כמותיים בזמן אמת. השיטה מעסיקה הפרדה ראשונית באמצעות חרוזים מגנטיים לרוקן את כל התאים שאינם B מדם חבל טבור ודורשת הכתמה עם רק 3 נוגדנים (CD34, CD19 וCD45). התאים שהם התאוששו מייצגים 4 שלבי התמיינות תא B: 1) CD34 +; CD19 + (מאוחר פרו B-ובתחילה מראש BI), 2) CD34 -; CD19 +; CD45 הנמוך (מאוחר מראש BI); 3) CD34 -; CD19 +; CD45 מד (לפני BII); ו4) CD34 -; CD19 +; CD45 גבוה (לא בשל תאי B).
Protocol
1. בידוד של תאי mononuclear מדם טבורים
- הכן EDTA-PBS חיץ להוסיף 5 מיליליטר פתרון שור אלבומין (BSA) מלאה לחיץ שטיפת מ"ל 95 (1:20 דילול). דגת חיץ ולשמור על החיץ על קרח. החשוב: אי דגת המאגר עלול לגרום לפחות מתוצאות אופטימליות כאשר בידוד CD19 + תאי B בגלל בועות עלולות לחסום את טור הבידוד.
- הכן 50 צינורות חרוטי מ"ל לצנטריפוגה שיפוע הצפיפות. לקבוע את מספר הצינורות הנדרשים לעיבוד דם הטבורים (צינור 1 יכול לעבד דם מ"ל 8) ומוסיף 15 מ"ל של PLUS Ficoll-Paque לכל צינור.
- דלל 8 מ"ל של דם טבורים עם 24 המ"ל DPBS (1X) ושכבה בזהירות את תערובת דם הטבורים המדוללת על גבי PLUS Ficoll-Paque בכל אחד מצינורות חרוטי 50 המ"ל. אין לערבב את הדם וPLUS Ficoll-Paque. חשוב: כדי להימנע מערבוב של דם הטבורים וPLUS Ficoll-Paque, מחזיק את הצינור בזווית של 45 מעלות ושכבת תערובת הדם באיטיות.
- צנטריפוגה XG ב 400 במשך 40 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס תאי mononuclear (MNC) יישארו ב- Ficoll-Paque פלזמת PLUS ממשק אילו גרנולוציטים ואריתרוציטים משקעים עקב צפיפות גבוהה יותר בלחץ האוסמוטי של Ficoll-Paque PLUS. תווית 7 5 צינורות מיליליטר ישבן עגול שישמשו בחלק 3 עם מדגם הזהות, התאריך והבא:
| שפופרת | מדבקה | מטרה |
| 1 | בתוליים | תאי בתוליים לנורמליזציה במהלך הזרימה cytometry |
| 2 | 7AAD | כדי לקבוע כדאיות במהלך הזרימה cytometry |
| 3 | + + + | מכיל את התאים שיסודרו |
| 4 | 34 + | לאסוף CD34 + / CD19 +(מאוחר פרו-B - מוקדם מראש BI) תאים |
| 5 | 45 נמוכים | לאסוף CD34 - / CD19 + / CD45 הנמוך (טרום BI) תאים |
| 6 | 45 מד | לאסוף CD34 - / CD19 + / CD45 (לפני BII) תאי med |
| 7 | 45 גבוהים | לאסוף CD34 - / CD19 + / CD45 גבוה (B) תאים לא בשלים |
מעייל צינורות 4, 5, 6, 7 ועם 2% FBS ולמקם את כל הצינורות על קרח.
- לשאוב את השכבה העליונה בזהירות הפלזמה ולהימנע ממגע עם שכבת תא mononuclear. באמצעות 10 מיליליטר זכוכית פיפטה, להעביר את שכבת תא mononuclear זהירות לצינור חרוטי מ"ל חדש 50. שלב את תאי mononuclear משלושה צינורות יחד לתוך צינור מ"ל אחת 50.
- מלא את הצינור עם PBS, מערבב בעדינות וסרכזת ב 300 XG עבור 10 דקות ב20 ° C. בזהירות לשאוב supernatant מבלי להפריע לתא הגלול. חזור על 1x. לאחר השטיפה הראשונה, resuspend את הכדורים ולהעביר לצינור מיליליטר חרוטי 50 אחת.
- עדינות resuspend התא גלול ב 200 μl של PBS. הסר μl 1 להשעית התא, להוסיף אותו ל1 מ"ל של PBS בצינור microcentrifuge מ"ל 1.5 ומניח בצד לספירה (ספירת תאים לאחר ביצוע השעית התא 50 המ"ל בצנטריפוגה). מלא את הצינור עם PBS וסרכזת ב 200 XG במשך 15 דקות כדי להסיר הטסיות. הסר את supernatant לחלוטין מבלי להפריע לתא הגלול.
2. בידוד תא B שונה מתאי mononuclear באמצעות הפרדת MACS
- Resuspend הגלולה מצעד 1.7 עם קור μl 160 (4 מעלות צלזיוס) חיץ EDTA-PBS.
- הוסף 40 קוקטייל נוגדני μl B-CLL ביוטין. פיפטה לערבב היטב ודגירה במשך 10 דקות ב 4 ° C.
- שטוף תאים - להוסיף 1 מ"ל קר (4 ° C) חיץ EDTA-PBS לכל 10 מיליון תאים (תאים נוmber קבע בשלב 1.7) וסרכזת ב 300 XG למשך 10 דקות. לשאוב supernatant לחלוטין ואז resuspend התא גלול ב קר μl 320 (4 מעלות צלזיוס) חיץ EDTA-PBS.
- הוסף 80 microbeads μl אנטי ביוטין, מערבב היטב ודגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C.
- שטוף תאים - להוסיף 1 מ"ל קר (4 ° C) חיץ EDTA-PBS לכל 10 מיליון תאים וצנטריפוגות XG בטמפרטורה של 300 למשך 10 דקות. Resuspend עד 100 מיליון תאים ב500 μl של קר (4 ° C) חיץ EDTA-PBS. נפח חיץ בקנה מידה בהתאם למספר תא.
- הכן עמודות מקים ומפרידי מקים בצנטריפוגה (שלב 2.5). הנח עמודת LS בשדה המגנטי של מפריד MACS, להוסיף 3 מ"ל של קר (4 ° C) חיץ EDTA-PBS על העמודה ולאפשר החיץ לטפטף דרך העמודה. השתמש בכלי קיבול לתפוס את הזרימה דרכו. השלך את הזרימה דרכו.
- הנח צינור חרוטים 50 מ"ל מתחת לעמודה ופיפטה השעית התא על העמודה. לאפשר את התאים ללא תווית לטפטף through העמודה ולתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. חשוב: אלו הם תאים שישמשו לתיוג נוגדן ומיון תא. אל תמחק את הזרימה דרכו. כדי לשחזר את כל התאים מצעד 2.5, להוסיף מ"ל נוסף של 1 קר (4 ° C) החיץ EDTA-PBS לקירות צינור החרוטים. מערבב בעדינות ופיפטה השעית התא שנותר על העמודה. חזור על 1x. המשך לשלב 2.8 שימוש בתאים ללא תווית שנאספו בצינור החרוטים לאחר שעבר דרך העמודה.
- מלא את צינור החרוטים המכילים תאים ללא תווית עם PBS וצנטריפוגה XG ב 300 למשך 10 דקות. הסר בזהירות את supernatant מבלי להפריע לתא הגלול. הוסיפו 200 μl של חיץ EDTA-PBS ועדינות resuspend התאים.
3. תיוג נוגדן והכנה למיון תא
- לשאוב μl 1 להשעית התא והמקום לצינור כותרתו "כתם" (שלב 1.4). הוסף 500 חיץ μl EDTA-PBS ולאחסן את הצינור על קרח.
- הוסף 20μl של כל נוגדן (CD19, CD34 ו CD45) למיליון תאים לתוך השעית התא הנותרת. מערבב היטב ומניח את השפופרת בחושך למשך 30 דקות ב RT. נוגדני CD הם צעדים רגישים לאור, להשלים 2-4 עם האורות כבויים.
- לאחר 30 דקות של דגירה עם נוגדנים, לשאוב 40 μl של השעית התא ולמקם אותו לתוך הצינור שכותרתו "7AAD". הוסף 1 המ"ל PBS לתוך הצינור וצנטריפוגה XG ב 500 במשך 2 דקות. הסר את supernatant ו resuspend התאים ב100 μl של חיץ מחייב. הוסף 7 μl של 7AAD (7-Aminoactinomycin D) ודגירה בחושך למשך 10 דקות בRT. במהלך שלב דגירת 10 דקות המלאה 3.4.
- הוסף PBS לראש של הצינור המכיל את התאים הנותרים שכותרתו עם נוגדני CD. צנטריפוגה הצינור ב 500 XG ל3 דקות. הסר את supernatant, להוסיף 500 μl EDTA-PBS חיץ וresuspend התא הגלול. להעביר את כל הנפח של השעית התא לתוך הצינור שכותרתו "+ + +". כדי לשחזר את כל השעית התאdd 1 חיץ נוסף מ"ל EDTA-PBS לצינור 50 מיליליטר חרוטים והעברה לתוך צינור כותרתו "+ + +".
- לאחר דגירה (שלב 3.3), להוסיף חיץ מחייב 300 μl לתוך צינור 7AAD. "כתם", "7AAD" ו "+ + +" דגימות ו" 34 + "," 45 נמוכים "," 45 מד "ו" 45 "גבוהים צינורות מוכנים לcytometry זרימה.
4. מיון נייד באמצעות Cytometer התזרים XDP MoFlo
- הגדרת MoFlo למיון: יישור לייזרים; לייצב זרם אגל; לקבוע עיכוב ירידה.
- הכן פקדי פיצויי צבע אחד באמצעות Invitrogen ABC עכבר חרוז ערכה (או דומה) על פי הוראות היצרן. הפעלת פקדי צבע אחד, כדי להתאים את המתחים של ערוצי קרינה להפרדה אופטימלית של אוכלוסיות חיוביות ושליליות. הגדר מקדמי פיצויים ולהחיל פרמטר פיצוי לפרוטוקול אוסף. להקים מחדש מקדמי פיצויים בכל פעם הרבה חדש של נוגדן מתקבל.
- יצירת פרוטוקול כולל חלקות כפי שמוצג באיור 2.
- הפעל מדגם כתם, להגדיר מתח ורווח לפיזור קדימה וצד, ולזהות אוכלוסיות קרינה שליליות. בגלל התאוששות הדנ"א היא המטרה של המיון, הסף צריך להיות מוגדר נמוך (≤% 1), כך שפסולת דנ"א המכיל לא לזהם את הדגימות שנאספו. * ודא שמערכת פינוי התרסיס פועלת בכל העת שגרות תאים אנושיים מתנהלים בMoFlo.
- הפעל aliquot קטן של + + + מדגם (~ 50,000 אירועים) להגדיר את אסטרטגית gating (איור 2). בגלל אבות B-cell לא פיזור זהה להתבגר תאי B, backgate CD19 + ungated / CD34 + אוכלוסייה על עלילת SSC vs FSC כדי להבטיח את שער הלימפוציטים כולל תאים פוטנציאליים Pro-B. מתוך מדגם זה גם להגדיר את אוכלוסיית פלואורסצנטי השלילית ל7AAD.
- הפעל את מדגם 7AAD כדי לקבוע כדאיות מדגם. רק תאים למיין במדגם עם כדאיויות גבוהות במלכתחילה (≥ 95%) כתאים מתים יהיה כתם ללא הבחנה ועלול לזהם אוכלוסיות מיון.
- הגדר את החלטות מיון לאסוף 4 אוכלוסיות: CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 נמוך; CD19 + / CD34 - / CD45 מד; וCD19 + / CD34 - / CD45 גבוה. כלול את הלימפוציטים ושערי אפלית מקטורן בהחלטות המיון של כל האוכלוסיות.
- כדי למנוע סתימות בקצה המיון, סינון + + + מדגם דרך מסננת תא 40 מיקרומטר מייד לפני המיון והסינון מחדש אם בכלל צבירה מתרחשת במדגם במהלך מיון.
- מיין את התאים לתוך צינורות איסוף (שלב 1.4) מצופים 2% FBS ב PBS בבעל צינור מקורר או קרח וגדוש.
- מייד לאחר המיון יושלם, לחלץ דנ"א.
Representative Results
בין מדגם וריאציה משחקת תפקיד בהצלחה של מיון התא (טבלה 1). את הדגימות עם שיעורי הצלחה טובים יש רמות נמוכות של פסולת מזהמת (איור 3 א) ואת הדגימות עם שיעורי הצלחת עניים יש רמות גבוהות של פסולת מזהמת (איור 3 ב '). בין מדגם וריאציה ניתן לשלוט במידה מסוימת אם דגימת דם הטבורים שנאספה תוך 24 שעות ממשלוח (העדיפות הראשונה O / N).
התאים הממוינים הזרימה מכל תת מבשר תא B הם כמות ובאיכות לביצוע בידודי חומצות גרעין מספיק. דנ"א המבודד הוא באיכות גבוהה והוא יכול לשמש בניתוחים במורד זרם. אנחנו באופן שגרתי לנצל דנ"א זה ב11 מירה להעשיר לDNA מפוגל (איור 4).
| נתוני מתקן דם טבורים | מיין עניים | |
| נפח עבודת דם עם נוגד קרישה (מ"ל) | 110 | 104 |
| תאי דם לבנים [10 3 / μl] | 8.68 | 11.19 |
| הלימפוציטים [10 3 / μl] | 3.88 | 3.76 |
| הלימפוציטים (%) | 44.70 | 33.6 |
| תאי דם אדומים [10 6 / μl] | 3.65 | 3.05 |
| נתונים בתוך הבית | ||
| מספר סלולרי לאחר Ficoll-Paque | 206 M | 309 M |
| מספר סלולרי לאחר הפרדת MACS | ז 22 | 16.5 M |
| רוזן אירועים סה"כ (MoFlo XDP) | 30.57 M | 19.97 M |
| כדאיות (%) | 98.00 | 98.00 |
| תאים בשער ימפוציט (%) 17.00 | 50.00 | |
| CD19 + / CD34 + | ||
| סה"כ מספר סלולרי | 10959 | 48316 |
| % של סה"כ אירועים | 0.04 | 0.24 |
| יעילות | 88% | 88% |
| CD19 + / CD34 - / CD45 הנמוך | ||
| סה"כ מספר סלולרי | 16619 | 26941 |
| % של סה"כ אירועים | 0.05 | 0.13 |
| יעילות | 89% | 87% |
| CD19 + / CD34 - / CD45 רפואה | ||
| סה"כ מספר סלולרי | 469745 | 507540 |
| % של סה"כ אירועים | 1.54 | 2.54 |
| יעילות | 89% | 89% |
| CD19 + / CD34 - / CD45 הגבוה | ||
| סה"כ מספר סלולרי | 1896062 | 2047142 |
| % של סה"כ אירועים | 6.2 | 10.25 |
| יעילות | 91% | 90% |
טבלת 1. סטטיסטיקת נציג תא מיון. 1-5 שורות הן ספירות הניתנות על ידי מתקן דם הטבורים. את השורות שנותרו הן נתונים שנאספו במעבדה שלנו. עלובים הכיל רמות גבוהות של פסולת ואחוז נמוך של תאי הלימפוציטים בשער.
Figuמחדש 1. תרשים זרימה של הליך. דם טבורי מעובד ותאי mononuclear מבודדים באמצעות תוספת Ficoll-paque. צעד לשטוף נוסף כלול להסיר טסיות מזהמות. תאי B מבודדים מתאי mononuclear באמצעות ערכת MACS האנושית B-תא הבידוד (B-CLL). צעד זה נעשה שימוש בנוגדנים חד שבטי ביוטין-מצומדות (CD2, CD4, CD11b, CD36, Anti-IgE וCD235a) כדי להסיר את כל התאים שאינם B. את B-התאים התאוששו מסומנים עם CD19-APC, CD34-PE ונוגדני CD45-FITC לאחר מכן ממוינים באמצעות cytometer MoFlo XDP הזרימה להתאושש תת מבשר B-cell: CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 נמוך ; CD19 + / CD34 - / CD45 מד; וCD19 + / CD34 - / CD45 גבוה.
איור 2. אסטרטגית gating לזיהוי ומיון פופulations. חיצים אדומים מציין את השער שחל על מגרש בהמשך. R4, R5, R6 וR7 שערים מצביעים אוכלוסיות ממוינות.) קדימה לעומת עלילת פיזור צד הצגת אוכלוסיית הלימפוציטים מועשרים. שער R1, הלימפוציטים. ב) גובה מול רוחב של עלילת פיזור קדימה לזיהוי תאים לעומת כפילויות בודדות. R2 שער, תא בודד. ג) תאים חיוביים CD19-APC לנפול לאוכלוסיות CD34-PE שליליות וחיוביות. R3, CD19 + / CD34 - שער; R4, CD19 + / CD34 + אוכלוסיית מין רצוי המציין שער ד) CD19 + / CD34 - תאים מתחלקים לשלוש אוכלוסיות שונות במקצת CD45-FITC.. R5 ו R6, CD19 + / CD34 - / CD45 נמוך וCD19 + / CD34 - / CD45 אוכלוסיות med, בהתאמה. R7, בגלל מספר תאים גבוה בCD19 + / CD34 - / CD45 אוכלוסייה גבוהה, שער מסוג זה מקיף רקחלק מהאוכלוסייה. כל התאים של אוכלוסייה זו לא צריכות להיות שנאספו עבור ניתוחים במורד זרם.
איור 3.) רמות נמוכות של זיהום פסולת לאחר העשרת עמודה. R1, שער לימפוציטים. ב) רמות גבוהות של זיהום פסולת לאחר העשרת עמודה.
איור 4. העשרה של DNA המפוגל מתת קבוצות של מבשר תאי B. DNA) sonicated המבודד מתת מבשר B-cell היא באיכות גבוהה. לדנ"א בניית הספרייה sonicated לממוצע של 200-600 נקודתי בסיס. 1 ליין: 100 סולם Promega נ"ב (קטלוג # G2101); ליין 2: DNA סה"כ מבודדים מCD19 + / CD34 + תאים; 3 ליין: DNA סה"כ מבודדים מCD19 + - / תאי CD45 נמוכים; ליין 4: 100 ng DNA המבודד מCD19 + / CD34 - / תאי CD45 מד; ליין 5: 100 ng DNA המבודד מCD19 + / CD34 - CD45 / תאים גבוהים. DNA היה sonicated באמצעות Bioruptor Diagenode על גבוה עבור סכום כולל של 9 דקות (30 שניות על; 30 השניות OFF). ה-DNA הייתה מטוהרת עמודה ומדמיינת על 1% agarose ג'ל עם ג'ל חומצות גרעין SYBR הכתם הירוק. ב) לאחר מירה באמצעות ActivMotif MethylCollector Ultra הערכה, PCR עם SLC25A37 (1-6) וAPC1 (7-12) מבוצע כדי לאשר העשרה של DNA המפוגל. 1 & 7: DNA sonicated גנומית (לא מירה); 2 & 8: מירה-CD19 + / CD34 + DNA; 3 & 9: מירה-CD19 + / CD34 - / CD45-DNA הנמוך; 4 & 10: מירה-CD19 + / CD34 - / CD45 התרופה ה-DNA; 5 & 11: מירה -CD19 + / CD34 - / CD45-DNA גבוה; 6 & 12: שליטת מים. הגברה גבוהה יותר של SLC25A37 מאשרת את ההעשרה של ה-DNA המפוגלבתת קבוצות של מבשר תאי B.
Discussion
הגורם בעל ההשפעה הגדולה ביותר על הצלחתו של הפרוטוקול הוא הנוכחות של זיהום פסולת. אם מבקש דם מבנק דם טבורים חשוב לי הדם נשלח מייד לאחר גבייה ככל האפשר. בנוסף, דגימות שסווגו כlymphocytosis להכיל מספרים גבוהים יותר של לימפוציטים, אך הדגימות הללו אין מספרים מספיקים של מבשר תאי B ולא צריך להיות בשימוש. כדי להגדיל את ההסתברות לקבלת כמות מספקת של תאים לכל אחת מקבוצות המשנה המבשר אנו ממליצים מתחילים עם לפחות 85 מ"ל של דם טבורים.
חשוב לציין כי בניגוד להפרדות דם היקפיות בוגרות, כאשר fractionating דם טבורי שכבת mononuclear לעתים קרובות מזוהמת בתאי דם אדומים 12. פרוטוקול זה כולל שטיפת צעד נוסף כדי להסיר טסיות מזהמות. פרוטוקולים מתארים הפרדות mononuclear מדם הטבורי מציעים כולל לא צעד תמוגהo להסיר תאים אדומים לא רצויים. אנו לא ממליצים על הצעד הזה, כי זה מייצר פסולת מזהמת ויש לו השפעה שלילית על ההצלחה של סוג התא.
על מנת להקטין את מספר התאים שצריכים להיות מכובדים על ידי הזרימה cytometry יש צורך לבצע העשרת תא B לפני מיון תא. הפרוטוקול המסופק על ידי Miltenyi BIOTEC, המלווה את ערכת בידוד תא B (B-CLL), כבר מותאם לדם היקפי וממליץ להשתמש 10 קוקטייל μl B-CLL ביוטין נוגדן לכל 10 מיליון תאים. צעד זה נעשה שימוש בנוגדנים נגד CD2 (תאי T, תאי NK), CD4 (תאי T), CD11b (גרנולוציטים; מונוציטים; מקרופגים), CD16 (תאי NK; מקרופגים; תאי פיטום), CD36 (טסיות דם), CD235a (תאי erythroid) כדי לרוקן את התאים שאינם B מדם חבל הטבור. חשוב להשתמש בערכה שתוארה ולא ב-צינוק הערכה השנייה כי הערכה לשעבר מכילה נוגדנים נגד CD43 אשר שוהים בתאים פרו-B. במהלך אופtimization של פרוטוקול זה, מצא כי סכום כולל של 40 μl של קוקטייל נוגדני ביוטין B-CLL הוא מספיק כדי לייצר תוצאת סוג תא חיובית. בנוסף מצאנו כי שימוש μl קטן כמו 5 יותר מקוקטייל נוגדני ביוטין B-CLL היו השפעות שליליות על סוג התא. לכן, מומלץ מאוד להשתמש ב 40 μl של קוקטייל נוגדני ביוטין B-CLL למספרים סלולריים mononuclear כלל בין 175-250000000. אם מתחיל עם מספרים נמוכים יותר או גבוהים יותר של תאים ייתכן שיהיה צורך להרחיב את ריאגנטים בהתאם.
יש פרסומים סותרים רבים המתארים את הסמנים שיכולים לשמש כדי להבדיל תת אוכלוסיות של תאי B. רוב הפער יכול להיות מוסבר על ידי העובדה שבידול הוא תהליך מתמשך, וכי נוכחותו או היעדריו של סמנים בתא שטח מתרחשת באופן הדרגתי ולא באופן הכל או לא כלום. בפרוטוקול זה CD34 - / CD19 + ורמת האינטנסיביות של CD45 + (ביטוי נמוך, בינוני, גבוה) שמש להבחין מראש BI, B-תאים טרום BII ובוגרים עם עלייה ברמה של CD45 ביטוי מקביל להתקדמות של בידול 6. תאי Pro-B כבר תואר על ידי כמה להיות CD19 + / CD34 + 13 בעוד שאחרים הראו כי תאים פרו-B CD19 - / CD34 + ותאים טרום BI הם CD19 + / CD34 + 9,10. בהתבסס על פערים אלה יש לנו מיועדים לCD19 + / CD34 + תאים כמו תאים פרו-B מאוחרים / תאים מוקדמים מראש BI. חשוב לציין כי אסטרטגיה זו פותחה לבודד תת קבוצות של מבשר תאי B המתאים לתאים המושפעים מלוקמיה לימפובלסטית המחלה החריפה. עם זאת, ישנן אסטרטגיות מיון מרובות שעשויה להיות מועסק בהתאם לתת סוג התא של עניין.
שילובי נוגדנים fluorochrome צריכים להיות נבחר על סמך היכולות של סדרן התא הזמין. כgeneraאני ככלל, fluorochrome הבהיר ביותר בלוח שלך יש להשתמש כדי לתייג את האנטיגן לפחות מאוכלס, ולהיפך. באיתור אוכלוסיות כפולות מוכתמות, במיוחד אירועים נדירים כגון אלה, אפלית כפיל (האיור 2B) היא חלק חשוב ביותר של אסטרטגית gating. הדבר מבטיח כי אירועים כפולים חיוביים הם באמת תאים בודדים מגואלים בשני נוגדנים ולא רק שני תאים בודדים מוכתמים דבקו זה לזה.
מהירות גבוהה, מיון תא 4-way בהכרח יוצרת סביבת אירוסול מבוקרת. לכן, מיון תא אנושי חי צריך להתבצע בזהירות רבה. פורסמו הנחיות בטיחות וטיהור זמינות ויש לבחון וליישם לפני הסוג 14. אישור מועדות biosafety מוסדיות או מקביליהם ייתכן שיידרש קודם למיון. לטיהור נאותה לאחר מיון, אקונומיקה, יש להוסיף למכל הפסולת לריכוז סופי של 10%. סיmilarly, כל צינורות דגימות, כמו גם את כל המשטחים בסביבה הקרובה יש לטהר ביסודיות עם 10% תמיסת כלור טרי.
לסיכום, פרוטוקול זה מספק אסטרטגיה להשגת אוכלוסיות נדירות של מבשר תאי B וניתן לשנותו לבודד אוכלוסייה נוכחת בדם טבורים כוללים תאי גזע hematopoietic ובשל תאי T נדיר. לאחרונה, תאי B בשלים זוהו בדם ההיקפי של אנשים עם מתקדם 15-HIV. לפיכך, התועלת שבשיטה זו מאריכה מעבר למחקר של סרטן הדם. לבסוף, יש לנו עדיין לא בצעו בידודי RNA בתאים הממוינים הזרימה, אך שיטה זו צריכה להיות התאמה שיש לשים לב כי בתא מיון התאים אמורים להיות מיון ישירות לתוך trizol או פתרון תואם מקביל RNA כגון RLT מערכת RNeasy זמין דרך Qiagen.
Disclosures
סופרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NCI R00 CA132784) לKT
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| LS Column | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Multi Stand | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| B-Cell Isolation Kit (B CLL) | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-660 | |
| Fetal Bovine Serum | ATLANTA Biologicals | S11195 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 ml) | MIDSCI | SS1500 | |
| BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559763 | |
| DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19 | BD Biosciences | 555415 | |
| DB Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences | 560941 | |
| CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | |
| autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352058 | |
| BD Falcon 50 ml Tube | BD Biosciences | 352098 | |
| PuraFlow Sheath Fluid, 8X | Beckman Coulter | CY30230 | |
| FlowCheck Alignment beads | Beckman Coulter | 6605359 | |
| Ultra Rainbow Alignment beads | Spherotech | URFP-30-2 | |
| ViroSafe Aerosol Evacuation Filter | Beckman Coulter | ML01330 | |
| ABC Mouse bead kit | Invitrogen | A-10344 | |
| 40 μm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Fisher Scientific Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Microscope | |||
| accuSpin Model 3R Benchtop Centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-516 | |
| MoFlo XDP flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| Aerosol Evacuation Unit | Beckman Coulter |
References
- Song, F., et al. Association of tissue-specific differentially methylated regions (TDMs) with differential gene expression. PNAS. 102 (9), 3336-3341 (2005).
- Ohgane, J., Yagi, S., Shiota, K. Epigenetics: The DNA methylation profile of tissue-dependent and differentially methylated regions in cells. Placenta. 29 (S), 29-35 (2008).
- Brown, G., et al. The sequential determination model of hematopoiesis. Trends Immunol. 28 (10), 442-448 (2007).
- Clark, P., et al. Lymphocyte subsets in normal bone marrow. Blood. 67 (6), 1600-1606 (1986).
- Loken, M. R., et al. Flow cytometric analysis of human bone marrow. II. Normal B lymphocyte development. Blood. 70 (5), 1316-1324 (1987).
- Caldwell, C. W., Poje, E., Helikson, M. A. B-cell precursors in normal pediatric bone marrow. American Journal of Clinical Pathology. 95 (6), 816-823 (1991).
- Tucci, A., et al. Are cord blood B cells functionally mature? Clin. Exp. Immunol. 84 (3), 389-394 (1991).
- Ghia, P., et al. Ordering of human bone marrow B lymphocyte precursors by single-cell polymerase chain reaction analyses of the rearrangement status of the immunoglobulin H and L chain gene loci. J. Exp. Med. 184, 2217-2219 (1996).
- Noordzij, J. G., et al. Composition of precursor B-cell compartment in bone marrow from patients with X-linked agammaglobulinemia compared with healthy children. Pediatric Research. 51 (2), 159-168 (2002).
- van Zelm, M. C., et al. Ig gene rearrangement steps are initiated in early human precursor B cell subsets and correlate with specific transcription factor expression. J. Immunol. 175 (9), 5912-5922 (2005).
- Rauch, T. A., Pfeifer, G. P. The MIRA method for DNA methylation analysis. Methods Mol. Biol. 507, 65-75 (2009).
- Kanof, E. M., et al. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , Suppl 19. 7.1.1-7.1.7 (1996).
- LeBien, T. W.
- Schmid, I., et al. International society for analytical cytology biosafety standard for sorting of unfixed cells. Cytometry A. 71 (6), 414-437 (2007).
- Malaspina, A., et al. Appearance of immature/transitional B cells in HIV-infected individuals with advanced disease: correlation with increased IL-7. PNAS. 103 (7), 2262-2267 (2006).
