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Neuroscience

Genetische Manipulation der Maus entwickeln Hypothalamus durch Published: July 24, 2013 doi: 10.3791/50412
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1
1Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Heidelberg, 2Institut de recherches cliniques de Montreal
* These authors contributed equally

Summary

Trotz der funktionalen und medizinische Bedeutung des Hypothalamus,

Abstract

Genetische Modifikation von bestimmten Regionen des sich entwickelnden Gehirn von Säugetieren ist ein sehr mächtiges experimentellen Ansatz. Die Erzeugung neuartiger Mausmutanten ist oft frustrierend langsam. Es wurde gezeigt, dass der Zugang zum Gehirn der Maus zu entwickeln in der Gebärmutter mit hinreichender Post-OP-Überleben möglich ist. Dennoch Ergebnisse mit diesem Verfahren wurden fast ausschließlich für die meisten oberflächlich und leicht zugänglichen Teil des sich entwickelnden Gehirns gemeldet, dh die Rinde. Der Thalamus, ein schmaler und medialen Bereich, hat sich mehr schwer vorbei. Transfektion in tiefere Kerne, insbesondere diejenigen des Hypothalamus, ist vielleicht die größte Herausforderung und daher nur sehr wenige Ergebnisse gemeldet wurden. Hier zeigen wir ein Verfahren, um die gesamte Hypothalamus neuroepithelium oder ein Teil davon (Hypothalamus Regionen) für die Transfektion durch Elektroporation Ziel. Der Schlüssel zu unserem Ansatz sind länger Narkose mal, Injektion in den third Ventrikel und geeignete Art und die Positionierung der Elektroden. Darüber hinaus zeigen wir Ergebnisse von Targeting und anschließende histologische Analyse der meisten vertieften Hypothalamus Kern, die mammillary Körper.

Introduction

Genetische Manipulation des embryonalen Gehirn der Maus ist eine bevorzugte Ansatz über Entwicklungsregulation lernen. Die Erzeugung von mutierten Maus Linien ist jedoch langsam und teuer. Eine leistungsfähige Methode, um spezifische genetische Veränderungen in sich entwickelnden Neuronen des Gehirns von Säugetieren einzuführen, ist in utero Elektroporation. Im Wesentlichen besteht die Technik der DNA-Transfektion in die embryonalen Gehirn neuroepithelium mittels elektrischer Impulse, dann ermöglicht der Embryo für eine bestimmte Zeit überleben, sammeln das Gehirn und prüft sie auf mögliche neue, informative Phänotypen. Auf diese Weise kann der Experimentator Hypothesen fast sofort zu testen, ohne die langen Wartezeiten, die für die Produktion von Maus-Mutanten.

Transfektion von DNA in sich entwickelnden Embryonen begann mit in ovo Elektroporation auf Hühnerembryonen 1. Der wesentliche Proof-of-Concept für die Maus wurde in Kultur durchgeführt in utero 3,4 gefolgt.

Das Hauptproblem ist, das Gehirn des Embryos in der Gebärmutter entwickeln ohne sie zu töten oder die Mutter transfektieren. Lernen, um die notwendige Operation durchführen (Laparotomie, Injektion, die Elektroporation) erfordert eine lange Einarbeitungszeit. Sobald die Operation bis zu dem Punkt, wo der Embryo Überlebensverhältnis akzeptabel ist gemeistert, ist der nächste entscheidende Frage: Welche Hirnstrukturen zugänglich sind? Nicht überraschend, die ersten veröffentlichten Arbeiten zeigt erhaltenen Ergebnisse mit in utero Elektroporation auf die kortikale Entwicklung 5-9 konzentriert. Dies ist immer noch für die meisten Veröffentlichungen mit dieser Technik gilt, da der Bereich der Entwicklung Gehirn der Maus am besten zugänglichen chirurgischen Eingriffen ist der Kortex (Abbildung 1). Das Verfahren für die in utero Elektroporation in der Hirnrinde wurde beschriebenprint 10 und in Video 11-14. Eine Modifikation der Technik kann verwendet werden, um einen ventralen Teil des telencephalon, die Basalganglien 15 abzuzielen.

Jenseits der telencephalon ist das Zwischenhirn (klassisch in Thalamus und Hypothalamus geteilt) eine Region des Vorderhirns mehr schwer zu erreichen. Eine kleine Anzahl von Papieren Berichte Targeting seiner Rückenflosse und am leichtesten zugängliche Teil, der Thalamus 16-19.

Der Hypothalamus ist die ventralen Teil des Vorderhirns, damit die einen lokalisierten am tiefsten von der dorsalen Fläche (cortex) (Abbildung 1). Diese Region bleibt eine schwierige Herausforderung für die Forscher verpflichtet genetisch zu manipulieren das Gehirn der Maus in der Gebärmutter. Nach unserem Wissen, berichten nur sehr wenige Artikel über die Ergebnisse der in utero Transfektion in der Maus Hypothalamus 20,21. Allerdings ist die funktionelle Bedeutung des Hypothalamus cannot überbewertet werden, da sie Verhaltensweisen wie Essen und Trinken, Paarung, Aufzucht und Erziehung 22 regelt. Darüber hinaus tragen Veränderungen in Hypothalamus Entwicklung im späteren Leben Erkrankungen wie Übergewicht, Bluthochdruck, Diabetes und vorzeitige Pubertät 23 stammen. Die Möglichkeit, genetisch verändern die Hypothalamus während der Entwicklung würde ein sehr mächtiges Werkzeug, um es zu verstehen.

Die grundlegende chirurgische Protokoll für die Laparotomie von schwangeren Mäusen, die wir verwenden hier ist ähnlich wie in anderen Protokollen 11,13,14,24 verwendet. Wir werden sie hier kurz beschreiben auf Vollständigkeit. Der Schlüssel zu unserem Verfahren, auf der anderen Seite, sind die Art der Anästhesie, der Ort der Injektion, die Art der Elektroden und das Einsetzen und Position der positiven Elektrode in bezug auf die Embryos Kopf. Wir bevorzugen zu induzieren und Aufrechterhaltung einer Narkose durch Einatmen Gas über einfache intraperitoneale Anästhesie, seit der ehemalige ermöglicht dieetwas längere Narkose für eine schwierige Operation erforderlich. Isofluran Einatmen führt zu einer schnelleren Erholung von der Narkose, da in der Regel die Mutter zeigt ein normales Verhalten bereits Minuten nach der Operation. Die einfachste Punkt der Injektion der DNA-Lösung mit dem Glas-Mikropipette ist die laterale Ventrikel, was jedoch völlig ungeeignet Hypothalamus Elektroporation. Injektion direkt in den dritten Ventrikel ist in der Tat wichtig, tief Zwischenhirn Strukturen zielen. Es ist möglich, den Hypothalamus von E12.0 oder E12.5 mit Standard-, off-the-shelf Elektroden transfektieren. Wir haben einige der Elektroden durch Nepa Gene (Chiba, Japan) besonders zu diesem Zweck geeignet hergestellt gefunden.

Mit unserem Verfahren erhalten wir Transfektion des gesamten Hypothalamus Neuroepithel oder teilweise, je nach regionalen Transfektion Elektrode Orientierung. Hier zeigen wir die Technik, durch Transfektion der mammillary Körper, wohldie tiefste und Einbau aller Hypothalamus Kerne. Darüber hinaus zeigen wir detaillierte histologische Analyse der transfizierten Zellen auf der zellulären Ebene der Auflösung.

Ein Vergleich der in utero Elektroporation mit anderen Ansätzen zur Transfektion der Maus entwickelnde Gehirn in utero kann in der Diskussion Abschnitt gefunden werden.

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Protocol

1. Herstellung von DNA und Glasmikropipetten zur Injektion

  1. Gute Qualität Glasmikropipetten sind unerlässlich, um anfängliche hohe Rate der Fehlgeburten durch den Verlust von Fruchtwasser zu reduzieren. Das Verfahren zur Glasmikropipetten ziehen ist gut 13,18,25 dokumentiert. Mit 1,2 mm Durchmesser gezogen Kapillaren in einem herkömmlichen Sutter P-97-Gerät mit den Einstellungen P = 500; Wärme = 300; Ziehen = 40; Velocity = 50; Zeit = 50. Den Abzieher mit 3 mm "Trog" Filamente (Sutter Instrument FT330B). Die 2 mm Größe Filamente für uns weniger zufriedenstellende Ergebnisse lieferte. Auf der anderen Seite, hat Abschrägung des Mikropipettenspitzen nicht scheinen, um für uns zu verbessern.
  2. Auflösen gereinigt endotoxinfreiem Plasmid-DNA in PBS (Zellkultur), die 0,1% Fast Green bis zu einer Endkonzentration von 1 bis 2 pg / pl. Die Fast Green machen den injizierten Lösung sichtbar im embryonalen Hirn Ventrikel.
  3. Legen Sie 10 ul der DNA-Lösung in die Glasmikropipette. Schließen Sie das Glasmikropipette dem Einspritzsystem (Pico Pump) oder Mund Pipette.

2. Anästhesie

Vorbereiten des Operationstisches mit einem Heizkissen und der chirurgischen Instrumente. Schalten Sie die kalte Lichtquellen, um die Visualisierung der Embryonen zu erleichtern. Desinfizieren Sie die chirurgischen Instrumente mit zum Beispiel eine Glasperle Sterilisator.

Drei verschiedene Anästhesieverfahren sind für dieses Protokoll möglich (siehe Diskussion). Hier beschreiben wir die, die wir für die besten halte, mit Isofluran Inhalation für Narkose (Durchfluss 0,5 l / min) sowie die Wartung (Durchfluss 1 L / min).

  1. Führen Sie die Maus schwanger in einem kleinen transparenten (so die Maus bleibt sichtbar) Behälter mit dem Komesaroff Mark 5 Narkosegerät durch eine kurze Rohrlänge.
  2. Füllen Sie den Verdampfer mit Isofluran, öffnen Sie dann die Sauerstoff-Flasche an das Gerät angeschlossen. Brennen Sie eine oder zwei Impulse isoflUrane / Sauerstoff (0,5 L / min) in den Behälter mit der Maus und Uhr für Narkose um in.
  3. Nehmen Sie die Maus aus, bedecken ihre Augen mit Salbe zu verhindern, dass sie vor dem Austrocknen und passen die Flow-Anästhesie-Maske auf den Kopf sofort.

3. Laparotomie

  1. Platzieren Sie die Maus auf dem Bauch nach oben Heizkissen (sonst seine Körpertemperatur sinken wird sehr schnell abnimmt Heilungschancen) und sichern ihren Körper in Ort durch die Festsetzung seiner vier Beine an den Seiten mit Klebeband. Beurteilen Sie die Tiefe der Narkose, indem für den Verlust der Reaktion auf Reflexstimulation (zB Zeh oder Schwanz Prise mit festem Druck).
  2. Rasur der Bauchdecke und desinfizieren sie mit dem iodophorpovidone-Iod (Braunoderm).
  3. Einen Längsschnitt (1 bis 1,5 cm lang) auf der Bauchhaut. Dann schneiden Sie das Bauchfell. Zeigen Baumwolle Gaze um den Einschnitt. Machen Sie einen Uterushorns sichtbar und ziehen Sie es vorsichtig mit einer stumpfen Pinzette auf die PBS gespült gauze. Spülen Sie die Gebärmutter mit PBS sehr oft, damit es immer angefeuchtet (2A und 2B). Während des gesamten Verfahrens zu vermeiden Ziehen des Mesometrium oder die Gebärmutter eng, da hohe Druck in der Gebärmutter für den Embryo Erhöhung der Chancen der Verlust von Flüssigkeit beim Einspritzen was Abtreibung übertragen wird.

4. DNA-Injektion in das Gehirn Ventrikel

  1. Halten des Uterus in einer Weise, dass die Hirnkammern visualisiert werden kann. Nicht umfassend neu ein Embryo, der sich in einer ungünstigen Position liegt - das erhöht nur die Chancen der Abtreibung.
  2. Ein Blick auf die Embryo Kopf von oben, die Lücke visuell lokalisieren oder Riss zwischen den linken und rechten kortikalen Hemisphären. Die Halbkugeln sind leicht zu unterscheiden und die lateralen Ventrikel in ihnen (nicht ins Visier genommen werden) können in der Regel als etwas dunkler Formen wahrgenommen werden. Wenn ein Embryo sich als optimaler Ausrichtung zur DNA-Injektion (Figures 2C und 2D), ist es möglich, die Gebärmutterwand durchstoßen und in die dritte Kammer auf einmal. Halten der Glas-Mikropipette auf 45 ° an der Gebärmutterwand und durchstechen am rostralen Ende des Spalts zwischen kortikalen Halbkugeln, dringt etwa 1 mm. Auf diese Weise wird die Spitze des Glas-Mikropipette wird in die dritte Ventrikel des Gehirns (nicht die lateralen Ventrikel) (2C und 2D). In Embryonen ungünstiger orientiert ist es sinnvoll, zunächst durchbohren der Gebärmutterwand (immer bei 45 °) in der Nähe des embryonalen Kopf, legen Sie die Mikropipettenspitze in die richtige Position zwischen den kortikalen Hemisphären und erst dann zu perforieren das Gehirn. Spritzen etwa 1 ul DNA-Lösung in den dritten Ventrikel (eine gute Injektion füllt die Ventrikel mit grünen Flüssigkeit). Wiederholen Sie diesen Vorgang mit allen Embryonen von einem Uterus Horn. Dies ermöglicht einige Zeit für die DNA-Lösung gleichmäßig zu mischen mit dem ventrikulären Flüssigkeit und erreichen die Zellstofe Neuroepithel.

5. Targeting der Hypothalamus für die Elektroporation

  1. Schalten Sie das Elektroporator auf und passen Sie die Einstellungen entsprechend der embryonalen Alter (für E12.5 verwenden wir 5 Rechteck-Pulse, 50 V, 50 ms ON/950 ms OFF). Verwendung Pluspol der Edelstahl Nadelelektrode (CUY550-10) und als negativer Pol einer runden flachen Elektrode (CUY700P4L). (Es ist wichtig, dass die Elektroden kleiner als die Embryos sind, da sonst der Strom nur fließt, um den Embryo, aber nicht durch sie.)
  2. Wählen Sie für die Elektroporation jene Embryonen, deren dorsalen Seite nach oben (dh wandte sich dem Experimentator) (wie die meisten von ihnen sind), und entsorgen Sie diejenigen, deren Ausrichtung ist nicht günstig. Jetzt ist es sicher, um die Gebärmutter mit Ethanol desinfiziert Finger oder mit Handschuhen berühren. Halten des Uterus mit einer Pinzette, würde jedoch der Stromfluss bei der Elektroporation stören.
  3. Pierce die Gebärmutterwand durch das Embryonenschutzgesetz den Kopf zwischen dem amniotic sac und der Plazenta in Abstützung nach unten durch sie mit der Spitze der Nadelelektrode. Verwenden Sie den Zeigefinger der anderen Hand als Widerlager. Über 5 mm von der Elektrodenspitze muss nun zwischen der Fruchtblase und der Gebärmutterwand, etwa auf dem Niveau des Mittelhirns (2E und 2F). Denken Sie daran, dass dies das "Targeting Elektrode" ist, so wird seine Position zu bestimmen, welcher Teil des Hypothalamus Neuroepithel höchstwahrscheinlich transfiziert bekommen ist. Der Embryo muss sehr vorsichtig "gequetscht" zwischen den Elektroden.
  4. Mit der anderen Hand, positionieren Sie den runden flachen Elektrode außerhalb der Gebärmutter Wand auf der gegenüberliegenden Seite des Embryos Kopf (2E und 2G).
  5. Verwenden Sie den Fußschalter, um Spannung anzulegen (50 V, 50 ms ON, 950 ms AUS, 5 Rechteckpulse).
  6. Langsam ziehen die Nadel-Elektrode aus der Gebärmutter, während die Gebärmutter wieder mit dem Zeigefinger der anderen Hand - wenn amniotic Flüssigkeit durch den durchlöcherten Wand verloren geht, in der Regel der Embryo unterziehen Abtreibung. Wiederholen Sie den Vorgang mit allen Embryonen.
  7. Bringen Sie den Uterushorns in den Bauch und wiederholen Sie die Injektion und Elektroporation in den Überrest Horn.

6. Finishing der Chirurgie

  1. Nach der Injektion und Elektroporation von allen Embryonen, legen die Gebärmutter wieder in den Bauch sehr sorgfältig, exakt positioniert, wie sie vor und feucht die Bauchhöhle mit Kochsalzlösung vor dem Schließen waren.
  2. Naht das Bauchfell mit Catgut (Vicryl Polyglactin 910, 5-0, Ethicon V4914). Für die Schließung der Haut Verwendung "unterbrochen Stich" methodwith ein beständiger Naht (Supramid Nylon, 6-0, Serag Wiessner TO 07171L).
  3. Desinfizieren Sie die Bauch Oberfläche mit PVP-Jod (Braunoderm) und injizieren eine nicht-steroidalen entzündungshemmenden subkutan (z. B. 100 ul einer Lösung von 1.10 Rimadyl in 0,9% NaCl) oder, noch besser, ein Opioid wie buprenorphine (Temgesic, 0,05 bis 0,1 mg / kg Körpergewicht in 0,9% NaCl), um Schmerzen zu lindern.
  4. Entfernen Sie die Mutter aus der Narkose Maschine und legen Sie sie in einem Käfig, die von einem Heizkissen erwärmt wird. Überwachen Sie die Maus ständig, bis sie vollständig aus der Narkose erholt. Später, überprüfen Sie die Tiere täglich um sicherzustellen, dass sie von dem Verfahren ohne Anzeichen einer Infektion oder Schmerzen erholt.

7. Analyse der Ergebnisse

  1. Ernten der Embryos (oder postnatals) entsprechend der gewünschten Tag der Analyse. Postnatale Mäuse (1 bis 2 Tage alten) werden durch Enthauptung getötet.
  2. Trennen jedes Embryo nach dem vorhergehenden Elektroporation Annotation. Präparieren Sie das Gehirn unter einem Stereomikroskop und überprüfen unter dem Mikroskop grün fluoreszierende Signal (von der GFP-Reporter) in die entsprechende Region.
  3. Der ausgewählte Gehirn kann "frisch" analysiert werden: fix das Gewebe für eine kurze Zeit in 4% Paraformaldehyd und einbetten in Agarose 4% oder in Gelatine-albumin, dann auf einem Abschnitt Vibratom-Typ (Abbildung 3). Nähere immunhistochemische Analyse (Abbildung 4), Kryo-schützen das Gehirn in 30% Saccharose-Lösung, in OCT Eindeckmediums (Tissue Tek) einzubetten dann schneiden 20 um Abschnitte in einem Kryostaten.

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Representative Results

Die meisten Hypothalamus Neuronen zwischen E11.5 bis E15.2 geboren, nach der Geburt-dating-Analyse bei der Ratte 26 in die etwas kürzer Mausentwicklung 27,28 übersetzt. Der Gipfel des Hypothalamus Neurogenese bei E12.5 29-31 erreicht. Demgemäß wird zum Transfektion Alter für die vorliegende Studie (E12.5) gewählt wird, kann ein großer Teil der hypothalamischen Neuronen zu einem bestimmten rostro-kaudalen Niveau bezeichnet werden.

Analyse bei E18.5 auf dicken Vibratom-type Abschnitte (3A und 3B) zeigt, dass die gesamte rostro-kaudale Ausdehnung des Hypothalamus Neuroepithel zugänglich Elektroporation (3A) ist. Zu einem bestimmten Alter können Neuronen auf allen Ebenen medio-lateral (3B) markiert werden, im Einvernehmen mit Linie 32 Studien. Die mammillary Körper (MBO) ist ein neuronaler Kern der Entwicklung von der Neuroepithel Futter eine Aussparung in der die meisten Ventral und kaudalen Teil des Vorderhirns. Dies macht die MBO grundsätzlich sehr schwierig, vorbei. Funktionell ist die MBO eine wichtige Struktur für Speicher-Konsolidierung und seiner pathologischen Degeneration Ergebnisse in anterograde Amnesie 33. Wir konnten Reporterplasmide sehr spezifisch Transfektion in diesem Kern (3C und 3D). MBO Neuronen verlängern Axone bilden zwei sehr charakteristisch und funktionell wichtigen Verträge, die auch nach der Transfektion (Pfeilspitzen in 3C) sind markiert. Querschnitte zeigen, dass die Neuronen an E12.5 (Alter Transfektion) geboren eine gekrümmte "Schicht" um einen nicht-markierten Masse von Neuronen früher erzeugt bilden (dh vor der Transfektion Experiment fand) (3D).

Neben den allgemeinen Migration Mustern durch Prüfung auf dicke Schnitte mit Hilfe von fluoreszierenden Reporter-Proteine, eine genauere Analyse der Ergebnisse gezeigt ist möglible mit spezifischen Antikörpern auf Gefrierschnitten (Abbildung 4). Um den hier gewählten Beispiel analysieren, die MBO, haben wir horizontalen Abschnitten parallel zu der Ebene der radialen Gliazellen Prozesse, die aus der mammillary Ausnehmung (4A). Wir haben dann identifiziert die MBO Neuronen aus Neuroepithel auf E12.5 mittels Antikörper gegen GFP (4B) markiert geboren. Wie erwartet, markierte der Antikörper eine eingeschränkte Gruppe von MBO-Zellen (Pfeilspitze in 4B, 4C und 4D). Diese Gruppe, die zwischen zwei unmarkierte lateralen und medialen MBO Bereichen, die jeweils MBO Neuronen vor (lateral) und nach (medial) E12.5 geboren. Als ein Beispiel, hier sind wir mit einem Antikörper gegen Nestin (rot in 4C und 4D) co-gefärbt, um die Migration Modus von individuell markierten Neuronen auf radialen Gliazellen Prozesse des Neuroepithel zeigen.


Abbildung 1. Relative Positionen der Hypothalamus und Cortex bei midgestation. Sagittal (A) und Querrichtung (B) Diagramme des Gehirns eines midgestation Maus-Embryo, welche die meisten Rücken-und die meisten oberflächlichen Vorderhirn-Struktur, die Rinde (CTX, blau) sowie die am tiefsten platziert Vorderhirn-Struktur, der Hypothalamus (HY, rot).

Abbildung 2
Abbildung 2. Schematische Darstellung der Vorgehensweise. (A) Die schwangere Mutter ist betäubt und die Gebärmutter ausgesetzt. (B) In jedem Gebärmutter Schwellung identifizieren die Plazenta Insertion (schwarze Pfeilspitze),Plazenta (PL) und Embryo. ME, Mesometrium. (C) Identifizieren der Einspritzpunkt in der Mitte der linken und rechten kortikalen Halbkugeln (rot X). (D) Injizieren DNA-Lösung in den dritten Ventrikel. (E) Die Nadelelektrode (positive) durchstößt die Gebärmutterwand zwischen Embryo und Plazenta Einsetzen. Die flache Elektrode (negative) beruht auf der freien Seite der Gebärmutter. (F) Hypothetische Blick von der Seite zeigt Plazenta Position der positiven Elektrode entlang der Hypothalamus. (G) von der freien Seite der Gebärmutter, die die Position der Ansicht negative Elektrode.

Abbildung 3
Abbildung 3. Transfizieren der gesamten Hypothalamus oder ein Teil davon. Thick Vibratorschenkel Mikrotomschnitte von vier verschiedenenWildtyp E18.5 Mäusegehirnen zeigt den Hypothalamus nach in utero Transfektion von Plasmid-DNA, die fluoreszierenden Reporter-Gene GFP (A, C) oder GFP (B, D) bei E12.5. (A) Sagittalschnitt (rostral nach links) zeigt eine Hypothalamus transfiziert von rostral nach kaudal. Maßstab 500 um. (B) Transversalschnitt. Auf der transfizierten Seite können markierten Zellen an allen medio-lateralen Ebenen gefunden werden. (C) Sagittalschnitt eine spezifisch transfizierten mammillary Körper (gestrichelte Linie, Sternchen) zeigt und Etikettierung seiner charakteristischen axonalen Baum (Pfeilspitzen). (D) Transversalschnitt durch die mammillary Körper (gestrichelte Linie). Auf der Seite elektroporiert (Sternchen), ein markiertes entsprechende Bande Neuronen E12.5 geboren gesehen werden kann. Hy, Hypothalamus, Th, Thalamus

Fig. 4 Abbildung 4. Analyse konkrete Schritte in Hypothalamus Entwicklung. (A) Schematische Darstellung eines horizontalen Schnitt durch das sich entwickelnde Gehirn, die die mammillary Körpers (rot). Die Region in dargestellt (B) und (C) umrahmt wird. (B) Antikörper Kennzeichnung von GFP auf einem horizontalen Schnitt durch den Körper nach E18.5 mammillary GFP Transfektion bei E12. Zellen an E12.5 geboren bilden eine deutliche Bande im Kern (Pfeilspitze in B, C und D). Maßstab 100 um. (C) Antikörper Kennzeichnung neuroepithelial Nestin (rot) auf dem Abschnitt in (B) gezeigt. Maßstab 100 um. (D) Einzelne Zellen der spezifischen E12.5 Band in der mammillary Körper unter hoher Vergrößerung identifiziert werden können. Maßstab 20 um.

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Discussion

Über der Narkose: Da in utero Elektroporation in den Hypothalamus kann technisch schwierig und erfordern längere Narkose Zeiten bevorzugen wir zu induzieren und Aufrechterhaltung einer Narkose durch Verabreichung einer Mischung aus Sauerstoff und Isofluran. In unserer Erfahrung können Tiere bleiben entsprechend betäubt auf diese Weise für einen Zeitraum von bis zu einer Stunde mindestens, ist die Erholung der Mutter sehr schnell, und Embryo Überleben verbessert. Andere Ansätze zur Anästhesie zur Verfügung. Das einfachste Verfahren besteht aus der Einleitung und Aufrechterhaltung einer Narkose durch intraperitoneale Injektion von 2,5 ml / kg Körpergewicht einer Mischung aus Ketamin (25 mg / ml), Xylazin (1,2 mg / ml) und Acepromazin (0,35 mg / ml) in 0,9 % sterile NaCl ("Triple-Combo"). Mit dieser Mischung allein an den empfohlenen Dosen hier wird eine Narkose von etwa 30 min (bis 45 min in einigen Fällen) induziert. Dieser ist in der Regel genug für in utero Elektroporation in der Rinde an E12.5 (durch injection in den lateralen Ventrikel). Der Vorteil dieser Methode ist, dass es völlig vermeidet die Notwendigkeit einer Narkose-Gerät und anderen Geräten. Allerdings ist diese Art der intraperitonealen Anästhesie nicht empfehlenswert, wenn längere Zeit nach der Operation notwendig wird, da weitere Injektionen in narkotisierten Tier, um die Anästhesie zu verlängern oft von Tod. Es ist auch möglich, intraperitoneal und Inhalationsnarkose, indem zunächst eine Injektion der "Triple Combo" (siehe oben), um Narkose induzieren kombinieren, dann halten sie durch Inhalation von Isofluran / Sauerstoff. Obwohl mit diesem Verfahren die Narkose so lange aufrecht erhalten werden kann, wie es erforderlich ist, ist die Erholung der schwangeren Maus nach der Operation nicht so gut wie mit der Inhalation allein. Außerdem, wenn wir die "Triple-Combo" intraperitoneale Injektion verwenden, nimmt Embryo Überleben.

Die Positionierung der Elektroden auf der Embryos, wie er in dargestellt

Die Laparotomie ist einfach genug. Jedoch erreicht der Experimentator das Niveau der Fähigkeiten, die eine hohe Überlebensrate von Embryonen (nach intraventrikuläre Injektion kann durch die Verabreichung von elektrischen Impulsen gefolgt) nach einem flachen Einarbeitung ermöglicht. Individuelle Fähigkeiten ist ein wichtiger Faktor, so dass in utero Elektroporation im Allgemeinen und ihre Anwendung auf den Hypothalamus insbesondere nachweisen kann, nicht ganz praktisch für einige Schüler . Um den Lernprozess zu verkürzen sowie die Reproduzierbarkeit und statistische Analysen zu erhöhen haben wir es für sinnvoll, ein ausführliches Protokoll, einschließlich Informationen über die Anzahl und Position der Embryonen, und das Aussehen, die Qualität der Einspritzung und ungefähre Position der Elektroden für füllen die einzelnen Embryonen. Vergleicht man diese Daten über das Experiment mit den endgültigen Ergebnissen, auf einem Embryo-by-Embryo Basis hat sich bewährt, zu verstehen und zu verbessern Sie den Vorgang.

Andere Berichte 20,21 haben den Hypothalamus mit Nepagene Pinzette-Elektroden gezielt. Wir setzen konsequent bessere Ergebnisse erzielen mit der Anwendung eine Nadel-Elektrode und einem flachen Deckel-Elektrode des gleichen Herstellers. Nach unserer Erfahrung macht die Anwendung dieser Methode rostro-caudal Targeting einfacher. Pinzette Elektroden scheinen entweder mehr Erfahrung / Skill oder eine viel größere Anzahl von Experimenten erforderlich, um brauchbare Ergebnisse zu erzielen.

jove_content "> Mindestens zwei andere Ansätze zur DNA-Konstrukte in der Maus entwickelt Hypothalamus transfizieren kann in utero Elektroporation verglichen werden. Die erste ist auch auf Laparotomie Injektion in den embryonalen Gehirn Ventrikels, mit dem Unterschied, dass die DNA von Interesse basierend die von einem Viruspartikel Das Virus infiziert die Neuroepithelzellen und auf diese Weise transfiziert unseren experimentellen Konstrukt - keine Elektroporation benötigt wird. Vorteile:. Das Verfahren vermeidet die elektrischen Impulse, die für die Elektroporation, also Überleben von Embryonen wahrscheinlich verbessert Die Hauptnachteile dieses Verfahrens. sind: 1) Arbeit mit Viren erfordert besondere Vorkehrungen und Einrichtungen S2, 2) Targeting ist nicht in Frage, da virale Partikel über die gesamte Ventrikel verbreiten macht es im Prinzip genauso wahrscheinlich keine neuroepithelial Region transfektieren (natürlich ein gewisses Maß an Transfektion in der Region von Interesse ist wahrscheinlich). Natürlich in utero in utero Elektroporation, dh die relativ schwierig Chirurgie Verfahren, mit einer langen Lernkurve je stark von den individuellen Fähigkeiten des Experimentators.

Die andere Gruppe von Ansätzen vermieden Operation vollständig, da es bei der Injektion der Konstrukte in das Blut der schwangeren Maus transfizieren basiert. Schwanzvene (Schwanzvene) Injektion von 34,35 shRNA Plasmide oder 36 hat das Potenzial, genetisch zu manipulieren sehr frühen Embryonen, obwohl regional spezifische Targeting ist mit diesem Verfahren nicht möglich. Dieser vielversprechende Ansatz scheint noch nicht bereit für die allgemeine Anwendung. Virale Partikel (Adeno-assoziierte Viren) im Gesichtsbereich Vene neugeborenen Mäusen (nicht älter Mäuse) eingespritzt wird, in der Lage, zu transfizieren Gehirn Neuronen 37. Schließlich können Nanopartikel, die schließlich als DNA Träger verwendet werden könnte, das Gehirn nach Schwanz v erreichenEin Injektion in erwachsenen Mäusen 38. Diese beiden Methoden, die die Möglichkeit der Transfektion von sehr frühen Embryonen zu öffnen, müssen unseres Wissens noch nicht schwangeren Mäusen verwendet.

Age of Transfektion und Sammlung: Für das Erlernen der Verfahren ist es wahrscheinlich am besten, um zu versuchen, E14.5 Embryonen transfektieren und dann einen Abschluss zu früher, desto schwieriger embryonalen Alters. Nach unserer Erfahrung ist die GFP-Expression unter UV-Licht sichtbar bereits 24 Stunden nach der Transfektion. Nach E12.5 Transfektion ist die GFP-Expression auf E18.5 sehr stark. Wir haben bei E12.5, E13.5, E14.5, E15.5 und Elektroporation und analysiert E17.5, E18.5, P0 und P1 in der Lage, starke Reporter Ausdruck in allen Fällen zu finden. Bei Embryonen, deren Gehirn in utero transfiziert worden dürfen Begriff erreichen (für postnatale Datensammlung), manchmal werden sie selektiv von der Mutter gefressen. Dies legt nahe, subtile Veränderungen in Aussehen oder Verhalten Welpe durch Manipulation Gehirn induziert (ihre Temperatur niedriger sein könnte, oder vielleicht sie strahlen nicht die richtigen Ton-Signale). In jenen Tieren, die postnatale mütterlichen Keulung überleben, haben wir Reporter Expression beobachtet bis P1 mindestens. Berichte in der Literatur zeigen die Expression von transfizierten Konstrukte sogar vier Monate nach der Geburt 10.

Vektoren für die Elektroporation: Wir verwenden bicistronischen Reporter-Plasmide durch das CAG-Promotor 39, das durch die cDNA des Gens von Interesse, durch eine interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) 40 abgetrennt, aus der cDNA von einem fluoreszierenden Reporter zum Beispiel gefolgt angetrieben die verbesserte green fluorescent protein 41. Die CAG-Promotor ist so stark in Neuronen, dass es Ebenen der DNA zu hoch für den transfizierten Zellen zu produzieren, sie zu töten. Obwohl wir nicht massiven Apoptose nach der Transfektion eine mögliche Lösung beobachtet wurden, sollte das Problem auftreten, würde die Verwendung einer weniger effizienten Promotor sein, wie der EF1 alpha 42.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) gefördert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  REAGENTS
Acepromazine Sanofi GmbH anesthetic
Isoflurane Baxter HDG9623 anesthetic
Ketamin Pharma GmbH anesthetic
Fast Green Fluka 44715  
Rimadyl Pfizer non-steroidal anti-inflammatory
Braunoderm Braun 3887138 povidone-iodine
Phosphate Buffer Saline PBS Gibco 14190  
Temgesic (buprenorphine) Essex Pharma opioid analgesic
Eye Ointment Pan-Ophtal 7136926  
Xylazine Bayer  
  EQUIPMENT
Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5 Medical Developments Australia ACN 004 903 682  
Capillary puller P-97 Sutter Instrument Co. P-97  
Compresstome Precisionary Instr. VF-300 Vibratome-type device
Confocal Microscope Zeiss LSM700  
Cryostat Leica CM3050S  
Electroporator Nepa Gene Co. Ltd. CUY21EDIT  
Electrode 1 Nepa Gene Co. Ltd. CUY550-10 Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam.
Electrode 2 Nepa Gene Co. Ltd. CUY700P4L Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter
Fiberoptic cold light source Leica KL2500 LCD  
Glass capillaries Harvard Apparatus GC120T-15 1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D.
Glass bead sterilizer Fine Science Tools FST250  
Heating pad Harvard Apparatus py872-5272  
Injection device World Precision Instruments Pneumatic Pico Pump PV820  
Suture Thread Coated Vicryl Ethicon V4914 Peritoneal Suture
Suture Thr. Supramid Serag Wiessner TO07171L Skin Suture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).
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  5. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
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Haddad-Tóvolli, R., Szabó, … More

Haddad-Tóvolli, R., Szabó, N. E., Zhou, X., Alvarez-Bolado, G. Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (77), e50412, doi:10.3791/50412 (2013).

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