将Kv通道重构至脂质膜中用于结构与功能研究

摘要

本文描述了将一种原型电压门控钾通道完全重建到脂质膜中的操作步骤。重建后的通道适用于生化分析、电生理记录、配体筛选以及电子晶体学研究。这些方法可能普遍适用于其他膜蛋白的结构与功能研究。

摘要

为了以简化的方式研究脂质-蛋白质相互作用，必须将膜蛋白整合到具有明确脂质组成的膜中。我们正在研究一种原型电压门控钾离子（Kv）通道中的脂质依赖性门控行为，并已建立了一套详细的方案，用于将这些通道重构至不同的膜系统中。我们的重构方案综合考虑了去垢剂诱导的囊泡融合、蛋白质/去垢剂胶束与脂质/去垢剂混合胶束的融合，以及脂质在蛋白质/去垢剂/脂质胶束和脂质/去垢剂混合胶束之间达到平衡分布的重要性。实验数据表明，通道蛋白在脂质囊泡中的插入方向相对随机，且重构效率极高，在分级分离实验中未观察到可检测的蛋白质聚集体。我们已利用重构的通道确定了其在不同脂质环境中的构象状态，记录了平面脂双层中少量通道的电生理活性，从噬菌体展示肽库中筛选出构象特异性的配体，并支持通道在膜中形成二维晶体。本文所述的重构方法可适用于在脂双层中研究其他膜蛋白，尤其适用于探究脂质对真核生物电压门控离子通道的影响。

引言

细胞通过特定膜蛋白的功能与其环境进行物质和信息交换¹。细胞膜中的膜蛋白在膜上发挥泵、通道、受体、膜内酶、连接蛋白以及结构支撑等多种功能。影响膜蛋白的突变与多种人类疾病相关。事实上，许多膜蛋白因其在细胞膜中的重要性和易接近性，已成为主要的药物靶点。因此，理解各种膜蛋白在膜中的结构与功能至关重要，这有助于开发新方法以减轻突变蛋白在人类疾病中造成的有害影响。

脂质包围着整合在双分子层中的所有膜蛋白^{2, 3}。在真核生物膜中，多种不同类型的脂质已知会组织成微区结构^{4, 5}。许多膜蛋白被发现不仅分布于这些微区中，也存在于膜的主体流动相中^{3, 6}。然而，这些微区形成的机制、膜蛋白向微区的靶向运输过程，以及此类分布的生理意义仍不清楚，尽管其重要性显而易见。研究脂质对膜蛋白影响的一个主要技术难题在于，如何将生物化学纯化的膜蛋白可靠地重构到脂质组成精确可控的人工膜系统中，从而使几乎所有重构后的蛋白都具有功能活性⁷。在过去几年中，我们建立了一系列方法，用于将来自A. pernix的原型电压门控钾离子通道（KvAP）重构到多种膜系统中，以开展结构与功能研究^8-10。来自我们团队及其他研究者的数据显示，脂质可能是电压门控离子通道电压感应结构域构象变化的决定因素，并可能影响部分此类通道的结构形态¹¹。接下来，我们将详细描述这些方法，并....

方案

1. KvAP 通道的表达与纯化（图 1）

1. 准备工作——第0天
   1. 用去离子水（diH₂O）冲洗用于细菌培养的玻璃烧瓶₂O）和 MilliQ H₂O (MQH₂以去除普通洗碗过程中残留的洗涤剂。
   2. 在2.8 L锥形瓶中分装1,000 ml LB培养基（此处以总共两升培养液为例），高压灭菌。低硬度水对转化细菌的成功培养至关重要。
   3. 在500 ml锥形瓶中高压灭菌100 ml LB培养基
   4. 将200 ng含有KvAP基因（带凝血酶切割位点）和His标签的pQE60质粒转化至60 μl XL1-Blue感受态细胞中₆ 在其C末端添加标签，将细菌接种于两个含有100 μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，于37 °C培养箱中培养14–16小时。
2. KvAP表达——第1天
   1. 过夜培养后观察平板上细菌菌落的形态。菌落直径通常仅为0.2–0.5 mm，数量较多。应避免选择那些具有较大菌落且周围环绕大量卫星菌落的平板。
   2. 向每块过夜培养的LB-琼脂平板中加入5.0 ml LB培养基，刮下菌落。将菌液转移至装有100 ml已灭菌LB培养基的500 ml三角瓶中。加入氨苄青霉素至终浓度为100 μg/ml，于37 °C培养约1小时，或直至OD....

结果

纯化KvAP通道至生化均一性的实验总体流程如图1A所示。图1B中的SDS-PAGE凝胶展示了蛋白表达与纯化过程中各阶段的典型样品。经IMAC纯化后的蛋白纯度已相对较高。KvAP通道的得率约为1.0 mg/升培养液。

脂质囊泡的去垢剂溶解需要针对每一种脂质与去垢剂的组合进行优化。POPE/POPG小单层囊泡被DM溶解的过程如图2A所示，囊泡漂浮实验的结果通常较为明确。梯度组分经SDS-PAGE分析的典型结果如图2B所示。在蔗糖密度梯度中，含有通道蛋白的POPE/POPG囊泡通常富集于10%层与35%层之间的界面处。含有KvAP的DOTAP或DOGS囊泡密度较轻，通常位于5%与10%层之间的界面（轻微渗入10%层）。如果存在较大量的多层囊泡，则通常呈现乳白色，并富集于10%-35%界面下方。我们发现，这种情况通常发生在蛋白-去垢剂-脂质混合物孵育时间不足、未能实现脂质良好分布时。

在平面脂双层中嵌.......

讨论

将KvAP通道重构到不同膜中的方法已在多项研究中被采用^8-10。基于确保脂质在去垢剂/脂质混合胶束与蛋白/去垢剂/脂质混合胶束之间充分分布的思路，我们能够实现KvAP几乎完全地重构到由差异显著的脂质组成的膜中。每个四聚体KvAP通道需要约100个脂质分子以完全覆盖其跨膜结构域。关键要求是在去除去垢剂之前，允许足够数量的脂质分子融合进入蛋白/脂质/去垢剂胶束。我们的标准条件（0.5 mg蛋白和5.0 mg脂质）可确保平均每分子蛋白对应约1,000个脂质分子。浮力实验和生物化学实验结果证实，该重构过程几乎完全。将通道插入黑脂膜后进行的电生理记录、利用噬菌体展示肽库对重构通道进行筛选，以及在膜中生长通道的二维晶体，均展示了膜重构技术在多种应用中的成功实现。

KvAP通道的脂质依赖性构象变化以及针对噬菌体展示肽库的筛选，展示了一条通过生化方法筛选通道阻滞剂或通道激活剂的新途径，而无需依赖电生理学手段来维持通道的特定构象⁸。我们成功筛选出构象特异性结合分子的结果表明，相同策略可用于寻找激活态构象的特异性结合分子。可以预见，将重构于囊泡中的通道用于单.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胰蛋白胨	RPI Corp.	T60060
酵母提取物	RPI Corp.	Y20020
NaCl	Fisher	S271-3
Tris 碱	RPI Corp.	T60040
氯化钾	Fisher	BP366-500
n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷	Affymetrix	D322S	溶剂级
n-辛基-β-D-葡萄糖苷	Affymetrix	O311	分析级
抑肽酶	RPI Corp.	A20550-0.05
亮抑蛋白酶肽	RPI Corp.	L22035-0.025
胃蛋白酶抑制剂 A	RPI Corp.	P30100-0.025
PMSF	SIGMA	P7626
DNase I	Roche	13407000
Bio-Bead SM-2	Bio-Rad	152-3920
HEPES	RPI Corp.	H75030
POPE	Avanti Polar Lipids	850757C
POPG	Avanti Polar Lipids	840457C
DOGS	Avanti Polar Lipids	870314C
DMPC	Avanti Polar Lipids	850345C
生物素-DOPE	Avanti Polar Lipids	870282C
DOTAP	Avanti Polar Lipids	890890C
NeutrAvidin 琼脂糖微珠	Piercenet	29200
透析袋	Spectrum Laboratories, Inc	132-570
戊烷	Fisher	R399-1
癸烷	TCI America	D0011
MTS-PEG5000	Toronto Research Cemicals	M266501