Drosophila 已成为解析酒精行为反应的细胞与分子机制的重要模式系统。本文介绍了一种在昼夜节律背景下收集酒精敏感性数据的实验方案，该方法可轻松应用于其他实验，且非常适合本科生科研。
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本文内容
摘要
摘要
果蝇（Drosophila melanogaster）是酒精研究和昼夜节律生物学中公认的研究模型。最近，我们发现昼夜节律钟调控酒精敏感性，但不影响耐受性的形成。本文中，我们将详细描述我们的实验方案。使用 FlyBar 向果蝇施加酒精。在此装置中，饱和酒精蒸气与加湿空气按设定比例混合，并同时输送至四个试管中的果蝇。果蝇在标准化条件下培养，以最大限度减少重复实验之间的变异。实验通常采用不同基因型或经不同处理的3日龄果蝇，最好匹配两个不同时间点（例如，CT 5 和 CT 17）的果蝇，以便进行直接比较。实验期间，果蝇暴露于预设浓度的酒精蒸气中1小时 ，每5分钟记录一次失去翻正反射（LoRR）或进入镇静状态的果蝇数量。数据可通过三种不同的统计方法进行分析。第一种方法是确定50%果蝇失去翻正反射所需的时间，并通过方差分析（ANOVA）判断不同时间点之间是否存在显著差异。第二种方法是计算在指定分钟数后显示LoRR的果蝇百分比，随后进行方差分析。最后一种方法是使用多元统计方法对整个时间序列数据进行分析。该方案也可用于非昼夜节律相关的实验或不同基因型之间的比较。
引言
黑腹果蝇 展示对酒精的双相行为反应1 与人类对该药物的反应相似2,3初次接触低浓度酒精时，果蝇表现出运动活动增加；随着酒精暴露的持续，这种状态逐渐转变为运动协调能力丧失、姿势控制能力下降以及翻正反射消失（翻正反射消失：LoRR），最终进入镇静状态（即在机械刺激下完全丧失运动反应）。4-9内源性生物钟是酒精敏感性和毒性的强效调节因子，这一点已在小鼠中得到证实。10,11大鼠12和人类13. 近期在 果蝇 研究表明，昼夜节律钟调节急性酒精敏感性，但不调节酒精耐受性1. 可用于的强有力遗传学方法 果蝇 通过突变体研究以及对基因表达时空模式的转基因操控，提供了一个能够快速推进复杂行为背后细胞与分子机制研究的系统。该方法的利用 果蝇 作为一种研究工具，已促进了对酒精神经生物学的深入理解，并可迅速将研究成果转化为哺乳动物的相关应用14-16为了促进对昼夜节律钟调控酒精敏感性分子机制的理解，并在不同昼夜时间点统一测量行为反应，需要建立一种适用于暗红光条件下进行酒精给药的实验方案。 果蝇，酒精可通过食物补充的方式进行长期暴露，或通过酒精蒸气形式给药以实现可靠的急性暴露。本文介绍了一种适用于评估昼夜节律对翻正反射丧失（Loss-of-Righting Reflex, LoRR）调节作用的....
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方案
1. 果蝇饲养装置（FlyBar）的组装
原理与概述：该系统旨在向果蝇输送可控浓度的酒精蒸气。注：图1展示了FlyBar装置的示意图，其组装过程如下所述分为三个阶段（气流系统的组装、酒精瓶和水瓶的设置、观察管的组装）。简而言之，稳定的气流被分为两部分，分别通过酒精和水进行鼓泡，随后混合，并输送至4个观察管中。
- 气流系统的组装
- 将一段短的柔性硅胶管连接到建筑物供气系统或水族箱曝气器上，以产生稳定的气流，并通过Y型连接器分流。将第一分支连接至气流调节器，该调节器用于控制通过系统的总气流量（通常情况下，4个观察瓶为1,000 ml/min）。
- 在第二根管路上安装一个快速接头，以便在实验开始时可中断气流，而不影响已校准的气流。添加一个Y型连接器，并将每条分支管路连接至各自的气流调节器。
- 将管路连接至气流调节器，然后连接两个气流计。
- 酒精瓶与水瓶的设置
- 在气流计出口处连接柔性管路，并在每段管路末端插入一根带90°弯头的细玻璃管（可使用1 ml玻璃移液管的截段），作为通入酒精瓶和水瓶的进气管。
- 将带有两个孔的橡胶塞插入盛有酒精和水的瓶子中。使用水浴将两个瓶子维持在比环境空气温度高2°C的恒定温度。在我们的实验中，环境室温保持在25°C，而水浴温度为27°C....
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结果
利用50%丧失翻正反射作为标志物研究酒精敏感性的昼夜节律调节。
一个展示昼夜节律对酒精敏感性调节的代表性示例如下所示 图2. 在6个时间点测量LoRRnd DD天在Canton-S中的时间点以及每个时间点的50% LoRR被确定。分析显示时间点具有显著效应（ANOVA：F5,45=7.39, p<0.001，每个时间点 n=6-10）。Fisher LSD 检验显示 CT1 与 CT5、CT5 与 CT13、CT5 与 CT17、CT5 与 CT21、CT9 与 CT13、CT9 与 CT17，以及 CT9 与 CT21 之间差异具有显著性。该结果与我们先前发表的结果一致1.
野生型与突变型果蝇之间的差异。
第二个示例使用时间序列来展示野生型 Canton-S 果蝇与携带功能缺失突变的果蝇在 LoRR 和镇静反应上的差异 白色 突变.......
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讨论
酒精滥用和酒精依赖给社会带来的代价巨大，无论是在人类29还是经济方面30,31。Drosophila 作为一种模型，提供了一个快速且多功能的系统，可用于快速检测大量个体的行为反应，因此已被广泛应用于酒精相关研究5,7,32-34和昼夜节律研究35-37。
本文介绍了一种在昼夜节律条件下对成年果蝇进行可控酒精蒸气暴露的简便实验方案。
在标准化条件下培养的果蝇暴露于酒精蒸气中1 hr 内每 5 分钟记录一次失去翻正反射的果蝇数量 最小。本文所述方案针对昼夜节律实验进行了优化，因其额外需要在恒定条件下进行同步化和饲养。对于常规研究，可通过去除昼夜节律实验所必需的步骤（例如在黑暗中存放至少一天，或在微弱红光条件下进行实验）来简化多个步骤。本方案也可用于以受控方式使大量果蝇暴露于不同浓度的酒精，以便后续进行生物化学或分子分析。为与其他研究保持一致 果蝇 行为学实验，例如学习与记忆观察，即使在非昼.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究的资金由佛罗里达州立大学医学院神经科学项目奖以及佛罗里达州立大学生物科学系的支持提供。 额外资金由酒精饮料制造商研究基金的援助金提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 190度酒精 | 多种品牌 | ||
| 曝气器 | 当地宠物商店 | 我们使用Whisper 60 | |
| 1/8”硅胶管 | VWR | 408060-0030 | |
| 120° Y型连接器 | VWR | 82017-256 | |
| 快速接头 | VWR | 46600-048 | |
| 塑料管夹 | Bell-art产品 | 132250000 | 以下两者任选其一 |
| 微型空气调节阀 | McMaster-Carr | 8727K11 | 以上两者任选其一 |
| 微型空气调节阀安装支架 | McMaster-Carr | 9891K66 | |
| Gilmont 12号流量计 | VWR | 29895-242 | |
| 工具夹 | McMaster-Carr | 1722A43 | 用于固定流量计 |
| 小瓶 | VWR | 89092-722 | |
| 带两个孔的橡胶塞 | VWR | 59585-186 | 适用于小瓶 |
| 5 mm Pyrex玻璃管 | Trikinetics | PGT5x65 | 最适配上述橡胶塞 |
| 聚四氟乙烯胶带 | 五金店 | 必要时用于在橡胶塞中实现紧密贴合 | |
| 带两个孔的橡胶塞 | VWR | 59582-122 | 适用于我们的瓶子 |
| 一次性玻璃移液管 | VWR | 53283-768 | 按需截断并加热弯曲 |
| 极细尼龙网 | VWR | 多种品牌 | |
| 15瓦灯泡 | 五金店 | 顶部红光照明 | |
| 摄影用红色安全灯滤光片 | 顶部红光照明 | ||
| 带红色滤光片的迷你手电筒 | Mag-light |
参考文献
- Linde, K., Lyons, L. C. Circadian modulation of acute alcohol sensitivity but not acute tolerance in Drosophila. Chronobiol. Int. 28, 397-406 (2011).
- Kaun, K. R., Azanchi, R., Maung, Z., Hirsh, J., Heberlein, U. A Drosophila model for alcohol reward. Nat Neurosci. 14
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