Summary
ड्रोसोफिला शराब के व्यवहार प्रतिक्रियाओं के सेलुलर और आणविक आधार विदारक के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली के रूप में उभरा है. यहाँ हम आसानी से अन्य प्रयोगों के लिए लागू किया जा सकता है और स्नातक अनुसंधान के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है कि एक circadian संदर्भ में शराब संवेदनशीलता डेटा के संग्रह के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं.
Abstract
फल मक्खियों (ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर) शराब अनुसंधान और circadian जीव विज्ञान दोनों के लिए एक स्थापित मॉडल हैं. हाल ही में, हम circadian घड़ी शराब संवेदनशीलता, लेकिन नहीं सहिष्णुता के गठन modulates दिखाया. यहाँ, हम विस्तार में हमारे प्रोटोकॉल का वर्णन. शराब FlyBar का उपयोग मक्खियों को दिलाई है. इस सेटअप में, संतृप्त शराब वाष्प सेट अनुपात में humidified हवा के साथ मिलाया जाता है, और एक साथ चार ट्यूबों में मक्खियों को दिलाई. मक्खियों प्रतिकृति के बीच भिन्नता को कम करने के क्रम में मानकीकृत शर्तों के तहत किया जाता है. अलग जीनोटाइप या उपचार की तीन दिन पुरानी मक्खियों अधिमानतः प्रत्यक्ष तुलना संभव बनाने के लिए दो अलग अलग समय अंक (जैसे, सीटी 5 और सीटी 17) की मक्खियों मिलान करके, प्रयोगों के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. प्रयोग के दौरान, मक्खियों पलटा (lorr) को ठीक करने की हानि है कि प्रदर्शन के शराब वाष्प के पूर्व निर्धारित प्रतिशत और मक्खियों की संख्या को 1 घंटे के लिए उजागर या sed रहे हैंसमझना हर 5 मिनट में गिने जाते हैं. डेटा तीन अलग सांख्यिकीय दृष्टिकोण का उपयोग का विश्लेषण किया जा सकता है. पहले मक्खियों के 50% उनके ठीक पलटा खो दिया है, जिस पर समय का निर्धारण और महत्वपूर्ण अंतर समय अंक के बीच मौजूद है कि क्या यह निर्धारित करने के विचरण का एक विश्लेषण (एनोवा) का उपयोग करने के लिए है. दूसरा एक एनोवा विश्लेषण के बाद मिनट की एक निर्धारित संख्या के बाद lorr कि शो प्रतिशत मक्खियों निर्धारित करने के लिए है. पिछले विधि बहुभिन्नरूपी आँकड़ों का उपयोग पूरे टाइम्स श्रृंखला का विश्लेषण करने के लिए है. प्रोटोकॉल भी जीनोटाइप के बीच गैर circadian प्रयोगों या तुलना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर इस दवा 2,3 करने के लिए मानव प्रतिक्रियाओं के अनुरूप हैं कि शराब 1 को biphasic व्यवहार प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन. , और बेहोश करने की क्रिया (जवाब में मोटर गतिविधि का पूर्ण अभाव: शराब की कम मात्रा के लिए प्रारंभिक निवेश पर, मोटर समन्वय की कमी, postural नियंत्रण के नुकसान और ठीक सजगता (lorr ठीक पलटा की हानि) द्वारा बदल दिया, प्रदर्शन वृद्धि हुई हरकत गतिविधि मक्खियों यांत्रिक उत्तेजना को) शराब के लिए जोखिम 4-9 प्रगति के रूप में. अंतर्जात circadian घड़ी चूहों 10,11, चूहों 12 में मनाया के रूप में शराब संवेदनशीलता और विषाक्तता के एक मजबूत न्यूनाधिक है, और 13 मनुष्य. ड्रोसोफिला अनुसंधान के क्षेत्र में हाल के अग्रिमों circadian घड़ी तीव्र शराब संवेदनशीलता नहीं बल्कि शराब सहिष्णुता 1 modulates पता चला है. उत्परिवर्ती पढ़ाई और स्थानिक की ट्रांसजेनिक जोड़तोड़ के माध्यम से ड्रोसोफिला में उपलब्ध शक्तिशाली आनुवंशिक दृष्टिकोणऔर लौकिक जीन अभिव्यक्ति जटिल व्यवहार के लिए अंतर्निहित सेलुलर और आणविक तंत्र की पहचान करने में तेजी से प्रगति की अनुमति देता है कि एक प्रणाली प्रदान करते हैं. एक खोजी उपकरण के रूप में ड्रोसोफिला का उपयोग तेजी से स्तनधारियों 14-16 के लिए अनुवाद किया जा सकता है कि शराब तंत्रिका जीव विज्ञान को समझने में मूल अग्रिम अनुमति दी है. Circadian घड़ी शराब संवेदनशीलता modulates के माध्यम से जो आणविक तंत्र की समझ की सुविधा के लिए और समान रूप से circadian समय अंक भर में व्यवहार प्रतिक्रियाओं, मंद लाल बत्ती स्थितियों में इस्तेमाल के लिए उपयुक्त एक शराब प्रशासन प्रोटोकॉल को मापने के लिए जरूरी है. ड्रोसोफिला के लिए, शराब पुरानी जोखिम के लिए या मज़बूती से तीव्र जोखिम के लिए वाष्प के रूप में शराब administrating के माध्यम से खाद्य पूरकता के माध्यम से चलाया जा सकता है. यहाँ, हम नुकसान के ठीक पलटा (lorr) 1 के circadian मॉडुलन के आकलन के साथ ही के लिए उपयुक्त एक शराब प्रशासन प्रोटोकॉल का वर्णनबेहोश करने की क्रिया.
लगातार तापमान में 12 घंटे एलडी चक्र और फिर प्रयोगात्मक प्रश्न के आधार पर 2-5 दिनों के लिए एक नियंत्रित प्रकाश शासन को हस्तांतरित: मक्खियों 12 घंटा के साथ entrained रहे हैं. मक्खियों FlyBar के रूप में जाना एक डिवाइस में इथेनॉल वाष्प के संपर्क में हैं. इस उपकरण में, हवा की नियंत्रित मात्रा में पानी और शराब के माध्यम से bubbled कर रहे हैं; वाष्पकणों तो एक शीशी आवास मक्खियों में मिलाया और निर्देशित कर रहे हैं. मक्खियों मिनट हर 5 सजगता को ठीक या बेहोश हो गए प्रदर्शित करने में विफल रहता है कि संख्या के लिए रन बनाए हैं. हर समय बिंदु के लिए lorr प्रतिशत circadian समय अंक के बीच या मक्खियों के तनाव के बीच की गणना और तुलना कर रहे हैं. व्यवहार विश्लेषण विकल्प के साथ संयुक्त FlyBar शराब वितरण का उपयोग शराब वितरण की सादगी और विश्वसनीयता अंधेरे शर्तों के तहत आयोजित circadian प्रयोगों के लिए एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है.
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Protocol
FlyBar की 1. विधानसभा
तर्क और अवलोकन: सिस्टम मक्खियों को शराब वाष्प की नियंत्रित प्रतिशत व्यवस्थापन करने के लिए बनाया गया है. नोट: संख्या 1 के एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन प्रदान करता है FlyBar सेट अप तीन चरणों (हवा का प्रवाह के विधानसभा, शराब और पानी की बोतलों के सेट अप, और प्रेक्षण शीशियों के विधानसभा) में नीचे वर्णित के रूप में. संक्षेप में, एक स्थिर airflow, क्रमशः, शराब और पानी के माध्यम से bubbled मिलाया, और 4 अवलोकन शीशियों को प्रशासित रहे हैं कि दो भागों में विभाजित है.
- वायु प्रवाह की सभा
- लचीला सिलिकॉन टयूबिंग इमारत हवा या एक वाई कनेक्टर का उपयोग कर एक लगातार हवा का प्रवाह और विभाजन उत्पन्न करने के लिए एक मछलीघर जलवाहक या तो के एक छोटे टुकड़े से कनेक्ट करें. प्रणाली (4 अवलोकन शीशियों के लिए आम तौर पर 1,000 मिलीग्राम / मिनट) के माध्यम से हवा की कुल मात्रा को नियंत्रित करता है कि हवा का प्रवाह नियामक को पहली शाखा कनेक्ट करें.
- दूसरी ट्यूब में एक त्वरित संबंधक डालेंहवा धारा calibrated airflow को प्रभावित किए बिना प्रयोग की शुरुआत में बाधित हो सकता है. एक वाई कनेक्टर जोड़ें और airflow नियामक को प्रत्येक शाखाओं में ट्यूब कनेक्ट.
- Airflow के नियामकों के लिए ट्यूबिंग कनेक्ट और उसके बाद दो airflow मीटर कनेक्ट.
- शराब और पानी की बोतलों के सेट अप
- Airflow मीटर के बाहर निकलने के लिए लचीला टयूबिंग जोड़ें और ट्यूबिंग का प्रत्येक लंबाई के अंत में एक 90 डिग्री मोड़ के साथ एक पतली कांच की नली (1 मिलीलीटर कांच pipettes के वर्गों) डालें. यह पानी और शराब की बोतलों में प्रवेश वायु प्रवाह के रूप में काम करेगा.
- शराब और पानी से भरी बोतलों में उन के माध्यम से 2 छेद के साथ रबड़ stoppers रखें. एक पानी के स्नान का उपयोग परिवेशी वायु तापमान की तुलना में अधिक एक निरंतर तापमान 2 डिग्री सेल्सियस पर दोनों बोतलों रखें. नहाने के पानी में 27 डिग्री सेल्सियस पर है, जबकि हमारे प्रयोगों में, पर्यावरण कक्ष, 25 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा है
- एक के लिए सीधे गिलास विंदुक डालेंआईआर रबर डाट के माध्यम से प्रवेश और बोतल के तल से लगभग 1 सेमी तक तरल पदार्थ में विस्तार.
- कांच के अंत बोतल के अंदर डाट के नीचे से भरा है जब तक रबर डाट में शेष छेद में कांच विंदुक के एक कोहनी खंड डालें. ट्यूबिंग का एक और लंबाई में यह हवा आउटलेट डालें.
- एक वाई कनेक्टर का उपयोग कर हवा धाराओं पुनर्मिलन के लिए और एक दो छिपे रबर डाट के माध्यम से डाला तुला ग्लास विंदुक वर्गों के साथ एक खाली मिश्रण कुप्पी या बोतल के माध्यम से हवा का प्रवाह सीधा करने के लिए सिलिकॉन टयूबिंग की एक और लंबाई का उपयोग करें. आउटलेट मिश्रित Airstream के लिए सिलिकॉन टयूबिंग की एक और लंबाई का उपयोग करें.
- अवलोकन शीशी के विधानसभा
- कई अवलोकन शीशियों प्रत्येक प्रयोग में इस्तेमाल किया जा सकता है, ताकि हवा के 4 या 8 छोटे धाराओं प्राप्त करने के लिए मिश्रण कुप्पी 2-3X से उभरते आउटलेट Airstream भाजित. अवलोकन शीशियों को लचीला सिलिकॉन टयूबिंग कनेक्ट करें.
- Observati सेट करेंग्लास ट्यूब शराब वाष्प के लिए एक प्रवेश और एक दुकान प्रदान के माध्यम से जो दो छेद युक्त एक रबर डाट के साथ बंद खाली शीशियों का उपयोग शीशियों पर.
- जाल के साथ पहली ग्लास ट्यूब के अंत कवर और लचीला प्लास्टिक टयूबिंग के एक छोटे से टुकड़े का उपयोग कर जगह में जाल रखना. यह शीशी की लगभग आधी लंबाई में फैली है जब तक पहली छेद के माध्यम से इस ट्यूब डालें. यदि आवश्यक हो, एक सुखद फिट प्राप्त करने के लिए Teflon टेप का उपयोग करें.
- यह रबर डाट के अंदर बढ़त के साथ भरा है जब तक जाल द्वारा कवर अंत के साथ भी दूसरा ग्लास ट्यूब डालें.
- मंद लाल बत्ती परिस्थितियों में मक्खियों के साथ विपरीत अधिकतम क्षैतिज कागज का एक टुकड़ा सफेद पर शीशियों रखें.
- Airstream के मिश्रण उपयुक्त भिन्न शराब के माध्यम से bubbled और Airstream पानी के माध्यम से bubbled. लगातार हवा का दबाव की निगरानी और हवा धाराओं के वांछित मिश्रण बनाए रखने की जरूरत के रूप में समायोजन करें.
नोट: निरंतर चल रहा हैएक छोटे से कमरे में समानांतर या एक भी परख में कई फ्लाई बार assays के शराब वाष्प की नजर संचय के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. संभवतः एक बंद कमरे में अनुसंधानकर्ता को प्रभावित कर सकते हैं कि शराब वाष्प के लगातार रिलीज से बचने के लिए एक उचित प्रणाली पर्याप्त रूप से प्रयोग के दौरान उत्पन्न शराब वाष्प को हटा उस जगह में रखा जाना चाहिए. , शराब वाष्पकणों को दूर प्रत्येक शीशी से फैलने वाला दूसरा ग्लास ट्यूब पर टयूबिंग की एक 6-12 इंच टुकड़ा कनेक्ट, उन्हें बंडल और एक कीप वैक्यूम सिस्टम को निर्देशित करने के लिए. शोधकर्ताओं ने यह भी प्रयोगात्मक परीक्षण के कमरे पर्याप्त रूप से हवादार है कि यह सुनिश्चित करना चाहिए.
प्रायोगिक पशुओं के 2. तैयारी
तर्क और अवलोकन: उचित संस्कृति और मक्खियों के आवास डेटा में परिवर्तनशीलता कम हो जाएगा. इस मक्खियों द्वारा अनुभवी तनाव का मानकीकरण और न्यूनतम के माध्यम से हासिल की है. कारण है कि, कोई संज्ञाहरण (सीओ 2 या विकल्प) duri प्रयोग किया जाता हैएनजी प्रोटोकॉल का निम्न चरणों में से किसी भी. इसके अलावा, मक्खियों सीखने और स्मृति प्रयोगों 17 सहित अन्य व्यवहार विश्लेषण के लिए मानक के रूप में परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए प्रयोगों और समय अंक भर में मेल नहीं खाते उम्र होना चाहिए.
अलग तरह के प्रकाश: अंधेरे की स्थिति इथेनॉल के लिए व्यवहार प्रतिक्रिया में circadian घड़ी का समारोह की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक दीन का लय मौजूद है, तो यह निर्धारित करने के लिए, प्रयोगों विशिष्ट Zeitgeber टाइम्स (ZT) पर प्रदर्शन को मापने के लिए एक परिभाषित एलडी चक्र के तहत किया जा सकता है. ZT 12 समय रोशनी एक 0:12 घंटा एलडी चक्र के साथ बंद कर दिया जाता है, जबकि ZT 0, भोर का प्रतिनिधित्व करता है और एलडी चक्र के नीचे पर रोशनी के समय के रूप में परिभाषित किया गया है. लगातार शर्तों के तहत, circadian समय (सीटी) पर्यावरण के संकेत, यानी मुक्त चल समय के अभाव में पशुओं के लिए समय के उपाय, और पिछले एलडी entrainment चक्र से संबंधित है. जंगली प्रकार ड्रोसोफिला में, सीटी पहले कई दिन के लिए पिछले ZT दर्शातानिरंतर मुक्त चल circadian अवधि के रूप में स्थिति और लय में है ~ 24 घंटा हैं. अंधेरे चक्र और फिर पूर्व प्रयोगों के लिए लगातार अंधेरे की स्थिति (डीडी) को हस्तांतरित: circadian मॉडुलन उपाय और व्यवहार पर तीव्र प्रकाश प्रभाव को खत्म करने के लिए, मक्खियों प्रकाश में entrained रहे हैं. Circadian प्रयोगों विशिष्ट Circadian टाइम्स (सीटी) में प्रदर्शन को मापने के लिए डीडी के दूसरे दिन प्रदर्शन कर रहे हैं.
ड्रोसोफिला में, निरंतर प्रकाश (करूँगा) की स्थिति कोर circadian जीन और arrhythmic हरकत गतिविधि 18-21 और arrhythmic अल्पकालिक स्मृति 17 से सबूत के रूप में व्यवहार circadian लय के विघटन की घटा या समाप्त कर दिया आणविक दोलनों साथ circadian शिथिलता में परिणाम. प्रोटोकॉल circadian पढ़ाई के लिए अनुकूलित है और अन्य प्रयोगों के लिए सरल किया जा सकता है. ट्यूब से 12 इंच पर इस्तेमाल छोटे लाल बत्ती, सभी circadian प्रयोगों मंद लाल बत्ती (परिवेश भूमि के ऊपर लाल बत्ती <बेंच शीर्ष पर 1 लक्स का उपयोग किया जाता~ 1 लक्स प्रकाश).
- 12:12 घंटे रोशनी के नीचे 25 डिग्री सेल्सियस पर रियर मक्खियों: अंधेरे entrainment शर्तों (एलडी).
- 1 दिन पर दिन की रोशनी की अवधि के अंत में हौसले eclosed मक्खियों लीजिए और खाद्य चिपचिपाहट कम करने के लिए उच्च अगर एकाग्रता भोजन की एक छोटी राशि युक्त शीशियों पकड़ में एलडी परिस्थितियों में 24 घंटे के लिए उन्हें दुकान. नोट: स्वस्थ, सामान्य रूप से विकसित मक्खियों एकत्र कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए, eclosion एक संस्कृति बोतल में शुरू होता है के बाद ही पहले दिन के भीतर एकत्र मक्खियों का उपयोग करें.
- लगभग 30 (25-35) के बैच लीजिए एक प्रकाश की अवधि के अंत में दिन 2 पर वातशोषक, और ताजा होल्डिंग शीशियों को हस्तांतरण का उपयोग कर उड़ जाता है.
- शीशी के अंत तक के लिए मक्खियों निर्देशित करने के लिए एक मजबूत प्रकाश स्रोत का उपयोग करें. व्यवहार टिप्पणियों प्रत्येक प्रयोग के अंत में गिना मक्खियों की कुल संख्या के प्रतिशत में रिपोर्ट कर रहे हैं के रूप में इस सीमा के भीतर, प्रत्येक शीशी में मक्खियों की सही संख्या महत्वपूर्ण नहीं है.
- 25 डिग्री सेल्सियस के लिए पर डीडी परिस्थितियों में मक्खियों बनाए रखेंदो दिन आर.
- प्रयोग के दिन, विभिन्न स्थितियों या प्रयोग करने से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए कमरे में प्रयोगात्मक व्यवहार कक्ष के अलावा अन्य इन्क्यूबेटरों में रखे सभी मक्खियों जगह है. दशानुकूलन के कारण तापमान या नमी में बदलाव के लिए परिवर्तनशीलता कम कर देता है.
- व्यवहार के circadian मॉडुलन के लिए परीक्षण करने के क्रम में छह बार के अंक एक दिन (सीटी 1, 5, 9, 13, 17 और 21) पर टिप्पणियों.
- प्रयोगात्मक डिजाइन की मजबूती बढ़ाने के लिए और एक ही प्रयोग करने की परिवर्तनशीलता विशिष्ट कम करने के लिए व्यवहार प्रयोगों का एक सेट के भीतर कई समय अंक की तुलना करें. विपरीत प्रकाश अंधेरे कार्यक्रम के साथ दो इन्क्यूबेटरों entrainment के लिए उपयोग किया जाता है, तो उदाहरण के लिए, सीटी 1 और सीटी 13 की टिप्पणियों को एक साथ प्राप्त किया जा सकता है.
नोट: उपरोक्त प्रक्रिया लगातार अंधेरे की circadian हालत में प्रदर्शन assays के लिए प्रायोगिक पशुओं की तैयारी का वर्णन है. अलग तरह के प्रकाश: अंधेरे की स्थिति घड़ी के समारोह की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैशराब के व्यवहार प्रतिक्रियाओं में. एक दीन का ताल प्रयोगों विशिष्ट Zeitgeber टाइम्स (ZT) पर प्रदर्शन को मापने के लिए एक एलडी चक्र के तहत किया जा सकता है मौजूद है यह निर्धारित करने के लिए. इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल प्रयोगों परीक्षण circadian में शिथिलता के लिए लगातार प्रकाश परिस्थितियों में उठाया मक्खियों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रकाश की स्थिति में रखे मक्खियों परीक्षण है कि वैकल्पिक प्रोटोकॉल के लिए, व्यवहार assays अभी भी अंधेरे शर्तों के तहत किया जाना चाहिए. मक्खियों के कारण व्यवहार पर प्रकाश की तीव्र प्रभाव को व्यवहार परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए प्रयोग करने से पहले 1 घंटे के लिए अंधेरे में स्थानांतरित किया जाना चाहिए.
3. व्यवहार टिप्पणियों
तर्क और अवलोकन: निम्न शराब प्रशासन प्रोटोकॉल मंद लाल बत्ती शर्त के तहत टिप्पणियों के लिए अनुकूलित है. दो व्यवहार उपायों lorr और बेहोश करने की क्रिया मक्खी मद्यपान की दो अलग अंक का प्रतिनिधित्व करते हैं. Lorr नुकसान ओ को शामिल मद्यपान की देर बिंदु का प्रतिनिधित्व करता हैएफ मोटर और postural नियंत्रण, नशे की बेहोश करने के उपाय, जबकि एक बहुत देर से अंत बिंदु. जीनोटाइप या circadian मॉडुलन अलग ढंग से इन दो उपायों को प्रभावित कर सकता है; इसलिए दोनों की जांच करना चाह सकते हैं. संक्षेप में, मक्खियों शीशियों में लोड कर रहे हैं, lorr या बेहोश करने की क्रिया प्रदर्शित मक्खियों की संख्या शराब वाष्प प्रदर्शन के दौरान हर 5 मिनट, और प्रयोग के अंत में गिना मक्खियों की कुल संख्या रन बनाए हैं.
- प्रयोग शुरू करने से पहले कम से कम 10 मिनट के लिए प्रणाली (हवा पानी और शराब की बोतलों के माध्यम से bubbled) के माध्यम से हवा चलाने और airflows जांच करने के लिए उस समय का उपयोग करें.
- Airflow रोकने के लिए जल्दी रिलीज डिस्कनेक्ट. शीशियों में मक्खियों लोड, और airflow जोड़ने और टाइमर शुरू करते हैं. नोट: अनुत्तरदायी मक्खियों या मृत मक्खियों होल्डिंग शीशियों में छोड़ दिया जाता है, इस तनाव की स्थिति का संकेत हो सकता है. सामान्य में, इन शर्तों पकड़े शीशियों में कम मक्खियों आवास या एक मामूली उपयोग कर भोजन चिपचिपाहट कम से कम किया जा सकता हैभोजन तैयार करने के दौरान ly उच्च अगर एकाग्रता. इष्टतम व्यवहार विश्लेषण और प्रयोगों के बीच कम से कम परिवर्तनशीलता के लिए, मक्खियों पूर्व प्रयोगों के लिए स्वस्थ होना चाहिए.
- सही समय रखने के लिए, शराब जोखिम के कुल समय का ट्रैक रखने के लिए एक टाइमर का उपयोग करें और 5 मिनट के अंतराल चिह्नित करने के लिए एक दूसरे की गिनती वापस टाइमर का उपयोग करें.
- इसके विपरीत बढ़ाने के लिए और दृश्यता के लिए उड़ान भरने, विशेष रूप से मंद लाल बत्ती परिस्थितियों में शीशियों के नीचे सफेद कागज का एक टुकड़ा रखें.
- निरंतर स्तर को बनाए रखने के लिए एक प्रयोग के दौरान नियमित रूप से airflow की जाँच करें. Airflows स्थिर है एक बार आम तौर पर, वे प्रयोग की लंबाई के दौरान स्थिर रहेगा.
- एक 1 घंटे की अवधि के लिए हर 5 मिनट में एक बार उनके ठीक पलटा खो दिया है कि मक्खियों की संख्या की गणना. शराब संवेदनशीलता जीनोटाइप और आनुवंशिक पृष्ठभूमि के बीच होती है, यह अधिक लगातार आकलन करने के लिए या समय की एक लंबी अवधि के लिए प्रयोग आचरण करने के लिए वांछनीय हो सकता है.
- शीशी slightl लिफ्टसतह से वाई, और शीशी के पीछे कागज की ओर एक लाल बत्ती टॉर्च से प्रकाश प्रत्यक्ष. मंद लाल बत्ती की शर्तों के तहत सभी प्रयोगों के लिए 1 लक्स से कोई बड़ा प्रकाश का स्तर बनाए रखने के लिए प्रयोगात्मक शीशी को कम से कम 12 इंच की दूरी पर हाथ से आयोजित लाल flashlights रखें.
- सभी प्रयोगों के लिए मानकों को स्थापित करने के लिए एक प्रकाश मीटर का उपयोग कर प्रकाश के स्तर को मापने.
- शीशी के लिए एक फर्म नल लगाने से उनके ठीक पलटा खो दिया है और लगभग 4 सेकंड के भीतर खुद को सही करने में विफल कितने मक्खियों गिनती है कि मक्खियों की संख्या निर्धारित करते हैं. Lorr प्रदर्शित मक्खियों कि अभी भी उनके पैर और पंख स्थानांतरित कर सकते हैं, लेकिन ईमानदार खुद को नहीं बदल सकते हैं.
- सत्र के अंत में, प्रत्येक शीशी में मक्खियों की कुल संख्या गिनती.
नोट: कभी कभी, एक मक्खी लोड हो रहा है प्रयोगात्मक शीशियों में मक्खियों जब डाट और पक्ष के बीच पकड़ा जा सकता है. इस अंधेरे में किया जाता है, यह आसानी से तो यह कुल सुन्न गिनती करने के लिए जरूरी है कि ध्यान नहीं दिया जा सकता हैसही ढंग प्रतिशत की गणना करने के लिए प्रयोग के अंत में मक्खियों की एर.
इसके अतिरिक्त, इस प्रक्रिया का भी एक अलग व्यवहार समापन बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है जो मक्खियों के बेहोश करने की क्रिया, को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बेहोश मक्खियों उनके सही पलटा खो दिया है, बेहोश करने की अधिक से अधिक शराब जोखिम की आवश्यकता है. Behaviorally, बेहोश करने की क्रिया मक्खियों शीशी ए.ए. फर्म नल निम्नलिखित शीशी में स्थिर शेष के साथ स्पष्ट मोटर गतिविधि का पूर्ण अभाव द्वारा विशेषता हो सकती है. बेहोश करने की क्रिया के लिए, अविचल कोई पैर शीशी की एक फर्म नल के निम्नलिखित वितरण लहराते के साथ रहते हैं कि मक्खियों की संख्या गिनती. इसके अतिरिक्त, शीशी व्यक्ति मक्खियों अभी भी उनके हथियाने पलटा बनाए रखने के लिए तय है कि पक्ष की ओर लुढ़का हुआ जा सकता है.
4. डेटा विश्लेषण
- प्रत्येक शीशी में मक्खियों की कुल संख्या के आधार पर आकलन किया हर समय प्रतिशत lorr निर्धारित करते हैं.
- Calculati द्वारा circadian समय अंक या तनाव के बीच का अनुमान लगाएँ मतभेदअवग्रह वक्र के रैखिक हिस्से के भीतर गिर जाता है जो प्रत्येक नमूने के लिए 50% lorr, (नीचे देखें चित्र 2) एनजी.
- वैकल्पिक आंकड़े:
- जीनोटाइप के बीच तुलना की योजना बनाई है, तो यह मतभेद (चित्रा 3) के बाद अस्थायी परीक्षण के साथ महत्वपूर्ण हैं कि समय अंक की सीमा निर्धारित करने के लिए दोहराया उपायों ANOVAand का उपयोग पूरे समय पाठ्यक्रम का विश्लेषण करने के लिए वांछनीय है. इन परीक्षणों के लिए, हम 0,001 के एक एक मान का उपयोग करना पसंद करते हैं. इस व्यक्ति ने कई बार प्रदर्शन पर मतभेद वक्र की ढलान में जीनोटाइप के बीच मतभेद के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आकलन किया जा सकता है.
- के लिए संवेदनशीलता में मतभेद ऐसे ग्राफ के रैखिक भाग (चित्रा 4) से बेहोश करने की क्रिया के रूप में एक विशेष प्रतिक्रिया के लिए शराब जोखिम के विशिष्ट समय के लिए निर्धारित किया जा सकता है.
- उपभेदों या circadian समय अंक के बीच मतभेद मानक एफ आंकड़े और बाद अस्थायी परीक्षण का उपयोग कर अनुमान लगाया जा सकता है.
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Representative Results
एक मार्कर के रूप में 50% lorr का उपयोग शराब संवेदनशीलता के circadian मॉड्यूलेशन.
दिन के दौरान शराब संवेदनशीलता में circadian मॉडुलन दिखा एक प्रतिनिधि उदाहरण चित्रा 2 में प्रस्तुत किया है. Lorr कैंटन-S में डीडी के 2 एन डी दिन के दौरान छह बार बिंदुओं पर मापा गया था और 50% lorr हर समय बिंदु के लिए निर्धारित किया गया था. (: एफ 5,45 = 7.39, 0.001 <पी, एन = 6-10 समय प्रति बिंदु एनोवा) विश्लेषण दिन के समय का एक महत्वपूर्ण प्रभाव दिखाया. फिशर एलएसडी परीक्षण सीटी 21 बनाम CT13, CT17 बनाम CT9, और CT9 बनाम सीटी 21, CT9 बनाम CT17, CT5 बनाम CT13, CT5 बनाम CT5, CT5 बनाम CT1 के बीच महत्वपूर्ण अंतर दिखाया. इस परिणाम अनुरूप है हमारे पहले प्रकाशित परिणामों के साथ 1.
जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती मक्खियों के बीच मतभेद.
दूसरा उदाहरण lorr में मतभेद और जंगली प्रकार कैंटन-S मक्खियों और FLI के बीच बेहोश करने की क्रिया को दिखाने के लिए समय श्रृंखला का उपयोग करता हैएक ही आनुवंशिक पृष्ठभूमि में (1118 डब्ल्यू) एक नुकसान के समारोह सफेद उत्परिवर्तन (चित्रा 3) ले जाने तों. ट्रांसजेनिक लाइनों अक्सर भी डब्ल्यू 1118 उत्परिवर्तन है कि इन मक्खियों और circadian घड़ी जीन के लिए कई उत्परिवर्ती लाइनों का उपयोग कर बनाई गई हैं, w के रूप में 1118 उत्परिवर्तन ड्रोसोफिला शोधकर्ताओं के लिए विशेष रुचि का है. परिणाम पूरे जोखिम अवधि के दौरान हर 5 मिनट के लिए दिखाया गया डेटा के साथ एक समय श्रृंखला (चित्रा 3) के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. टिप्पणियों तेजी सहिष्णुता buildup को 22-24 के प्रभाव से बचने के लिए 60 मिनट तक ही सीमित हैं. डब्ल्यू 1118 म्यूटेंट काफी कम lorr (विषयों एफ 1,10 के बीच एनोवा = 57.12, 0.001 <पी, एन = 6) गुआंगज़ौ एस की तुलना में इथेनॉल वाष्प के जवाब में संवेदनशीलता प्रदर्शित करते हैं. महत्व मतभेद (एक = 0.001) मिनट 60 (चित्रा 3 ए के माध्यम से 20 मिनट से इस प्रयोग में पाया गया 1118 और गुआंगज़ौ एस डब्ल्यू के बीच भी मतभेद (विषयों एफ 1,10 = 137.301, पी <0.001 के बीच एनोवा एन = 6) बेहोश करने की क्रिया की दर में पाए गए. बेहोश करने की क्रिया परख में महत्वपूर्ण मतभेद (एक = 0.001) मिनट में 50, 55 में पाए गए, और 60 (3B चित्रा). उनकी आँखों में स्क्रीनिंग पिगमेंट की कमी के अलावा, डब्ल्यू 1118 म्यूटेंट भी सेरोटोनिन, डोपामाइन और हिस्टामाइन 25,26 के स्तर को कम कर दिया है. Biogenic amine के स्तर में यह परिवर्तन डब्ल्यू 1118 म्यूटेंट 27,28 में इथेनॉल के लिए बदल संवेदनशीलता के लिए खाते सकता है. इसलिए, assayed जीनोटाइप में सफेद अभिव्यक्ति के स्तर को नियंत्रित करने में इथेनॉल संवेदनशीलता का सटीक आकलन के लिए आवश्यक हो सकता है.
बेहोश करने की क्रिया के circadian मॉड्यूलेशन.
तीसरा उदाहरण में, हम गुआंगज़ौ एस का प्रतिशत शांत मक्खियों मापाबेहोश करने की क्रिया पर शराब की एक circadian प्रभाव (चित्रा 4) वहाँ है कि क्या निर्धारित करने के लिए समय का एक निर्धारित राशि के बाद डी. हम सीटी 5 और 17 पर 40 मिनट (30% शराब वाष्प) पर बेहोश मक्खियों का प्रतिशत की तुलना में और परिणाम काफी कम बेहोश मक्खियों रात के दौरान शराब जोखिम की तुलना में दिन के दौरान कर रहे हैं (एनोवा बताते हैं कि: एफ 1,20 = 6.21, पी = 0.022, एन = 10 (CT5) एवं 12 (CT17)). टिप्पणियों एक प्रत्यक्ष तुलना संभव बनाने के क्रम में हमारे मानक lorr शर्तों के तहत किया गया यह मक्खियों घंटे के भीतर 50% बेहोश करने की क्रिया निशान तक पहुँच नहीं था. घंटे परे टिप्पणियों की वजह से तेजी से सहिष्णुता 22-24 के buildup के लिए समस्याग्रस्त हैं. इस प्रयोग में, circadian समय बिंदु पर या तो मक्खियों की कम से कम 25% इन समूहों के बीच अग्रणी धार बेहोश करने की संवेदनशीलता में एक फर्क है यह दर्शाता है कि 40 मिनट पर बेहोश थे. बेहोश करने की क्रिया में इस प्रारंभिक बिंदु पर डेटा एकत्रित एक उपयोगी indicat हैमतभेद मौजूद है कि आयन, लेकिन बेहोश करने की क्रिया प्रतिक्रिया में वितरण के आकार पर उपचार के प्रभाव को निर्धारित करने की क्षमता सीमित है. पूरे बेहोश करने की क्रिया वितरण में अंतर नहीं है, यह निर्धारित करने के लिए, एक उच्च इथेनॉल एकाग्रता बेहोश करने की क्रिया की एक तेज दर सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
चित्रा 1. फल मक्खियों में शराब संवेदनशीलता और बेहोश करने की क्रिया को मापने के लिए FlyBar.
.. चित्रा 2 दिन के दौरान शराब संवेदनशीलता में महत्वपूर्ण circadian मॉडुलन दिखा प्रतिनिधि उदाहरण (एनोवा: एफ 5,45 = 7.39, पी <0.001, एन = 6-10 समय बिंदु प्रति; CT1 बनाम CT5, CT13, CT17, और CT21 और CT9 CT13 बनाम, CT17, और CT21) के बीच महत्वपूर्ण अंतर.
व्यवहार प्रतिक्रियाओं पर शराब की चित्रा 3. प्रभाव जंगली प्रकार कैंटन-S मक्खियों और की तुलना में lorr द्वारा मापा के रूप में नुकसान के समारोह व्हाइट 1118 उत्परिवर्ती मक्खियों. ए) गुआंगज़ौ एस मक्खियों शराब के लिए काफी वृद्धि हुई संवेदनशीलता दिखाने के बीच काफी अलग हैं सफेद उत्परिवर्तन ले ही आनुवंशिक पृष्ठभूमि (एफ 1,10 = 57.12 विषयों के बीच एनोवा, पी <0.001, एन = 6). बी) गुआंगज़ौ एस मक्खियों विषयों के बीच 1118 म्यूटेंट (एनोवा डब्ल्यू से शराब बेहोश करने की क्रिया करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं के साथ मक्खियों एफ 1,10 = 137.301, 0.001 <पी, एन = 6). *पी <0.05, ** पी <0.01, *** 0.001 <पी.
. चित्रा 4 गुआंगज़ौ एस के प्रतिशत की तुलना प्रतिनिधि डेटा सीटी 5 और सीटी 17 के बीच 40 मिनट पर बेहोश मक्खियों जंगली प्रकार मक्खियों सीटी 5 (एनोवा की तुलना में सीटी 17 में प्रारंभिक बेहोश करने की क्रिया में काफी अधिक बढ़ जाती है का प्रदर्शन:. एफ 1,20 = 6.21, पी = 0.022, एन = 10 (CT5) एवं 12 (CT17)).
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Discussion
शराब सेवन और समाज के लिए शराब की लागत दोनों 29 मानव और आर्थिक लागत के मामले में जबरदस्त है, 30,31. ड्रोसोफिला एक मॉडल के रूप में जल्दी से व्यक्तियों की एक बड़ी संख्या के व्यवहार प्रतिक्रियाओं की जांच के लिए एक तेजी से और बहुमुखी प्रणाली प्रदान करता है और इस तरह के रूप में बड़े पैमाने पर शराब 5,7,32-34 और circadian अनुसंधान 35-37 दोनों के लिए इस्तेमाल किया गया है.
यहाँ, हम circadian परिस्थितियों में वयस्क मक्खियों को शराब वाष्प की नियंत्रित प्रशासन के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन किया.
मानकीकृत परिस्थितियों में खेती की मक्खियों उनके ठीक पलटा खो दिया है कि मक्खियों की संख्या हर 5 मिनट रन बनाए हैं, जिसके दौरान 1 घंटे के लिए शराब वाष्प के संपर्क में हैं. यहाँ बताया प्रोटोकॉल क्योंकि लगातार परिस्थितियों में entrainment और आवास के लिए अतिरिक्त आवश्यकताओं के circadian प्रयोगों के लिए अनुकूलित है. विभिन्न चरणों simplifi हो सकता हैऐसे में कम से कम एक दिन या मंद लाल बत्ती परिस्थितियों में प्रयोगों करने के लिए अंधेरे में भंडारण के रूप में circadian प्रयोगों के लिए आवश्यक हैं कि उन कदमों को हटाने के द्वारा सामान्य अध्ययन के लिए एड. इस प्रोटोकॉल भी बाद में जैव रासायनिक या आणविक विश्लेषण के लिए अलग शराब सांद्रता के लिए एक नियंत्रित तरीके से मक्खियों की बड़ी संख्या को बेनकाब करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस तरह के सीखने और स्मृति टिप्पणियों, मंद लाल बत्ती की स्थिति में व्यवहार प्रतिक्रियाओं की माप के रूप में अन्य ड्रोसोफिला व्यवहार प्रयोगों के साथ स्थिरता के लिए भी गैर circadian प्रयोगों के लिए वांछित हो सकता है.
प्रयोग की स्वतंत्र प्रतिकृति के बीच भिन्नता म्यूटेंट या ट्रांसजेनिक तनाव के बीच या circadian समय अंक के बीच छोटे मतभेदों अस्पष्ट कर सकते हैं. 'प्रतिकृति' को खत्म करने के क्रम में एक यादृच्छिक चर के रूप में जोड़ा जा सकता है, ताकि यह इसलिए एक साथ कई उपभेदों या circadian समय अंक के परीक्षण के नमूने (हमारे उदाहरण देखें) की सिफारिश की हैप्रतिकृतियां के बीच भिन्नता का प्रभाव.
शराब के लिए संवेदनशीलता उपभेदों के बीच होती है. शराब प्रतिशत (शराब के माध्यम से बुदबुदाती airflow का प्रतिशत) के अनुसार समायोजित करने की आवश्यकता है. चित्रा 3 में देखा, जंगली प्रकार कैंटन-S मक्खियों से शराब जोखिम के प्रभावों को कम संभावना है सफेद उत्परिवर्तन ले उड़ता है. सफेद उत्परिवर्तन ले लाइनों के विश्लेषण के लिए, यह तेजी से सहिष्णुता में परिणाम कर सकते हैं शराब के लिए लंबे समय तक निवेश के रूप में अन्य प्रयोगों की ही समय सीमा में व्यवहार परख प्रदर्शन करने के लिए इतनी के रूप में मक्खियों सामने आ रहे हैं जो करने के लिए शराब का प्रतिशत बढ़ाने के लिए वांछनीय हो सकता है विकास. अत्यंत संवेदनशील म्यूटेंट के लिए है और यह इस तरह के पीले जीन में उत्परिवर्तन युक्त मक्खियों के लिए मनाया के रूप में इस्तेमाल शराब का प्रतिशत कम करने के लिए आवश्यक है जो में प्रयोगों के लिए, airflow सही शराब संतृप्त airflow जांचना तक बढ़ाया जाना पड़ सकता है. छोटे बढ़ या दिसम्बरकुल airflow में reases (± 10%) (व्यावहारिक airflow सीमा 900-1,100 से 4 अवलोकन शीशियों के लिए मिलीग्राम / मिनट) नकारात्मक मक्खियों को प्रभावित करने के लिए नहीं लगती.
जब संभव 1 घंटा परे टिप्पणियों क्योंकि शराब संवेदनशीलता को प्रभावित करता है जो मक्खियों 22-24 में तेजी सहिष्णुता buildup की क्षमता का बचा जाना चाहिए. इसके बजाय, 30-40 मिनट से एक लगभग 50% lorr में यह परिणाम है कि प्रत्येक तनाव के लिए शराब प्रतिशत निर्धारित. कई स्वतंत्र उपभेदों की तुलना की आवश्यकता है, तो सभी उपभेदों के लिए काम करता है कि शराब की एक भी प्रतिशत का चयन करें.
इस प्रोटोकॉल व्यवहार टिप्पणियों पर काफी निर्भर करता है, तो एक मानकीकृत प्रोटोकॉल का कड़ाई से पालन समय के साथ व्यवहार टिप्पणियों में बहाव से बचने के लिए आवश्यक है. यदि संभव हो तो पर्यवेक्षक जीनोटाइप या समय बिंदु परीक्षण किया जा रहा करने के लिए अंधा है, इसलिए है कि व्यवहार टिप्पणियों प्रदर्शन किया जाना चाहिए. इन और अज्ञात अन्य कारकों के आधार पर संभावित पूर्वाग्रह का पता लगाने के लिए आदेश में,यह एक समय के पाठ्यक्रम पर डेटा की जांच करने के लिए और टिप्पणियों प्रयोगात्मक श्रृंखला भर में एक ही सीमा के भीतर रहना है, इसकी पुष्टि करने के लिए सलाह दी जाती है.
FlyBar सेट अप विशेष रूप से स्नातक शोधकर्ताओं या इथेनॉल के नकारात्मक प्रभाव पर circadian अध्ययन के लिए, मक्खियों के लिए शराब प्रशासन के अन्य तरीकों पर कुछ लाभ प्रदान करता है. मक्खियों में मोटर नियंत्रण पर शराब के प्रभाव को मापने के लिए एक वैकल्पिक डिवाइस inebriometer है, इथेनॉल वाष्प बढ़ती चकरा और postural नियंत्रण या मक्खी की संवेदनशीलता के नुकसान के माध्यम से वितरित किया जाता है, जिसमें एक ऊर्ध्वाधर कॉलम इसे लेता समय निर्धारित करने से मापा जा सकता है स्तंभ 38,39 के नीचे तक गिर जाते हैं. inebriometer नुकसान के आसनीय नियंत्रण के लिए एक स्वचालित readout प्रदान करता है और ड्रोसोफिला 9,22,39,40 में शराब अनुसंधान के लिए मूल्यवान साबित हो गया है, लेकिन इस व्यवहार प्रतिमान अपेक्षाकृत महंगे उपकरण, उपकरण के लिए अंतरिक्ष, और जांच करने के लिए समय की आवश्यकताऔर स्थिति अनुकूलन. इस प्रकार, inebriometer सीमित बजट या स्थान के साथ कई स्नातक शिक्षण प्रयोगशालाओं के लिए, या circadian assays के प्रदर्शन शोधकर्ताओं के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं हो सकता है. मक्खियों को शराब पहुंचाने और बेहोश करने की क्रिया को मापने का एक अन्य तरीका शीर्ष पर या एक शीशी के तल पर या तो एक शोषक सामग्री पर तरल शराब की एक छोटी राशि रखने और फिर शराब समय 41,42 साथ भाप बनकर करने के लिए अनुमति शामिल है. समय के साथ शराब वाष्प वृद्धि की एकाग्रता के रूप में, व्यवहार प्रतिक्रियाओं का आकलन किया जा सकता है. इस वितरण पद्धति स्थापित करने के लिए आसान है, मक्खियों सामने आ रहे हैं जो करने के लिए शराब वाष्प की राशि समय और परिस्थितियों के साथ बदलता रहता है. मतभेद ऐसे circadian मॉडुलन के रूप में संवेदनशीलता या बेहोश करने की क्रिया के प्रारंभिक दरों में मूल्यांकन कर रहे हैं जिसमें प्रयोगात्मक प्रश्नों के लिए, यह मक्खियों के लिए दिया शराब वाष्प की एक निरंतर स्तर है वांछनीय है. इसके अतिरिक्त, शराब exposur की एक स्थिर राशि को मक्खियों की एक बड़ी संख्या का जोखिमई, FlyBar के साथ प्रदर्शन के रूप में, नीचे की ओर सेलुलर या जैव रासायनिक assays के सटीक प्रदर्शन के लिए वांछनीय है. जल्दी ड्रोसोफिला शराब अनुसंधान में आम मक्खियों को शराब पहुंचाने का एक अन्य तरीका यह तैयार किया गया था के रूप में भोजन में शराब मिश्रण शामिल किया गया. इस विधि आसान है और छोटे से सेट अप की आवश्यकता है, यह समय के साथ शराब परिवर्तन की एकाग्रता के रूप में दिनों से अधिक पुरानी शराब जोखिम के लिए सबसे अनुकूल है.
अधिक परिष्कृत, स्वचालित तरीके भी वीडियो गतिविधि रिकॉर्डिंग और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर 7,43 सहित शराब जोखिम को मक्खियों की हरकत प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए उपलब्ध हैं. ये इथेनॉल की सकारात्मक, अति सक्रिय करने के प्रभाव का आकलन करने के लिए विशेष रूप से शक्तिशाली हैं. हालांकि, इन स्वचालित तरीके स्नातक अनुसंधान परियोजनाओं या शिक्षण प्रयोगशालाओं के लिए बेहद महंगा हो सकता है और बेहतर circadian Condi के तहत मक्खियों की एक बड़ी संख्या के विश्लेषण के लिए डिजाइन नहीं किया जा सकता हैमाहौल (जैसे, अंधेरे परिस्थितियों में वीडियो पर कब्जा संतुलित आवश्यकता है और अवरक्त प्रकाश और अवरक्त संवेदनशील कैमरों फैलाना). हम FlyBar शराब वितरण प्रणाली और शर्तों और प्रयोगशाला डिजाइन की एक किस्म के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है कि शराब के व्यवहार प्रतिक्रियाओं के मूल्यांकन के लिए करने के लिए सेट अप, लागत प्रभावी विधि एक आसान प्रदान करता है.
प्रोटोकोल संशोधन:
ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल नुकसान के ठीक पलटा एक circadian संदर्भ में पर शराब जोखिम के प्रभाव की जांच के उद्देश्य से है. हालांकि, प्रोटोकॉल आसानी से शराब प्रयोगों के अन्य प्रकार समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.
12 घंटा, 12 घंटा प्रकाश अंधेरे के तहत शराब के जवाब की जांच (एलडी; Zeitgeber टाइम) शर्तें: 12 घंटे के तहत मक्खियों बनाए रखें: 12 घंटा एलडी चक्र प्रयोग तक. प्रकाश चरण (ZT 1, 5 के दौरान किए गए प्रयोग से पहले अंधेरे लगभग 1 घंटे के लिए मक्खियों स्थानांतरण, और 9) दिन का. यह प्रकाश की तीव्र प्रभाव परिणाम confounding नहीं है कि यह सुनिश्चित करेंगे.
उनके circadian घड़ी 18-21 और शराब जोखिम 1 को arrhythmic प्रतिक्रियाओं के विघटन में निरंतर प्रकाश की स्थिति के परिणाम के तहत संवर्धन मक्खियों: लगातार प्रकाश परिस्थितियों में शराब के जवाब की जांच करना. मक्खियों एलडी या डीडी स्थिति में बनाए मक्खियों के रूप में एक ही परिस्थितियों में परीक्षण कर रहे हैं कि इतने मक्खियों प्रयोग से पहले अंधेरे लगभग 1 घंटे के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है.
बेहोश करने की क्रिया: मक्खियों lorr मक्खियों जबकि अभी भी उनके पंखों, सिर और पैर कदम होगा, शीशी के तल पर स्थिर बने हुए हैं क्योंकि बेहोश कर रहे हैं कि मक्खियों lorr से अलग किया जा सकता है मक्खियों. शीशी परेशान है जब निशंक lorr अभी भी सूक्ष्म आंदोलनों के साथ जवाब है कि मक्खियों. मक्खियों के बेहोश करने की क्रिया एक फर्म के बाद मक्खियों शेष स्तब्ध की संख्या की गणना टीए द्वारा निर्धारित किया जाता हैशीशी पी. इसके अतिरिक्त, शीशी के रोलिंग व्यक्ति मक्खियों अभी भी उनके हथियाने पलटा बनाए रखने के लिए तय है कि इस्तेमाल किया जा सकता है.
वसूली: व्यवहार परख शराब प्रतिक्रिया का एक अतिरिक्त पैरामीटर के रूप में वसूली को मापने के द्वारा बढ़ाया जा सकता है. शराब प्रदर्शन बंद करने और lorr हर 5 मिनट के बारे में अवलोकन करने के लिए जारी है. वसूली की अवधि के दौरान शीशियों के माध्यम से humidified हवा का प्रवाह जारी.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
इस शोध के लिए अनुदान फ्लोरिडा स्टेट यूनिवर्सिटी चिकित्सा कॉलेज और FSU में जीव विज्ञान विभाग से समर्थन से तंत्रिका विज्ञान पुरस्कार में एक कार्यक्रम के द्वारा प्रदान किया गया. अतिरिक्त धन एक अनुदान सहायता शराब पेय निर्माता रिसर्च फंड से प्रदान किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol 190 proof | Various | ||
| Aerator | Local pet store | We use Whisper 60 | |
| Silicone tubing 1/8” | VWR | 408060-0030 | |
| 120° Y-connector | VWR | 82017-256 | |
| Quick disconnects | VWR | 46600-048 | |
| Plastic tube clamps | Bell-art products | 132250000 | Either this or next |
| Miniature air regulator | McMaster-Carr | 8727K11 | Either this or previous |
| Miniature air regulator mounting bracket | McMaster-Carr | 9891K66 | |
| Gilmont size 12 flow meter | VWR | 29895-242 | |
| Tool clips | McMaster-Carr | 1722A43 | To hold flow meters |
| Vial | VWR | 89092-722 | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59585-186 | Fits in vials |
| 5 mm Pyrex glass tubes | Trikinetics | PGT5x65 | Fits best in previous stopper |
| Teflon tape | Hardware store | To achieve snug fit in stoppers if necessary | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59582-122 | Fits our bottles |
| Disposable glass pipets | VWR | 53283-768 | Cut to length and bend by heating |
| Very fine nylon netting | VWR | Various | |
| 15 watt bulbs | Hardware store | Overhead red light | |
| Photographic red safe light filters | Overhead red light | ||
| Mini flashlights with red filters | Mag-light |
References
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