Prezentujemy prosty protokół do uzyskiwania filmów z mikroskopii fluorescencyjnej rosnących komórek drożdży, oraz pakiet oprogramowania oparty na graficznym interfejsie użytkownika do ekstrakcji danych szeregów czasowych pojedynczych komórek. Analiza obejmuje automatyczne przypisywanie czasu pochodzenia i podziału zintegrowane z inspekcją wizualną i ręczną selekcją śledzonych danych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pozyskiwanie fluorescencyjnych filmów poklatkowych pączkujących drożdży i analiza dynamiki pojedynczych komórek za pomocą GRAFTS
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Fluorescencyjna mikroskopia poklatkowa stała się potężnym narzędziem w badaniu wielu procesów biologicznych na poziomie pojedynczej komórki. W szczególności filmy przedstawiające czasową zależność ekspresji genów dostarczają wglądu w dynamikę jej regulacji; Istnieje jednak wiele wyzwań technicznych związanych z uzyskiwaniem i analizą filmów fluorescencyjnych pojedynczych komórek. Opisujemy tutaj prosty protokół wykorzystujący dostępne na rynku urządzenie do hodowli mikroprzepływowej do generowania takich danych oraz oparty na MATLAB, graficzny interfejs użytkownika (GUI) pakiet oprogramowania do ilościowego określania obrazów fluorescencyjnych. Oprogramowanie segmentuje i śledzi komórki, umożliwia użytkownikowi wizualne selekcjonowanie błędów w danych oraz automatycznie przypisuje pochodzenie i czasy podziału. Graficzny interfejs użytkownika dalej analizuje szeregi czasowe w celu wytworzenia całych śladów komórek, a także ich pochodnych za pierwszym i drugim razem. Chociaż oprogramowanie zostało zaprojektowane dla S. cerevisiae, jego modułowość i wszechstronność powinny pozwolić mu służyć jako platforma do badania innych typów komórek z niewielkimi modyfikacjami.
Wprowadzenie
Analiza ekspresji genów w pojedynczych komórkach pogłębiła nasze zrozumienie wielu aspektów regulacji genów. Statyczne migawki fluorescencyjnej ekspresji reporterowej przy użyciu cytometrii przepływowej lub mikroskopii dostarczają użytecznych informacji na temat rozkładu ekspresji pojedynczej komórki, ale brakuje historii i ewolucji danych szeregów czasowych wymaganych do bezpośredniego informowania o dynamice ekspresji genów. Fluorescencyjna mikroskopia poklatkowa stanowi sposób na uzyskanie zarówno pomiarów pojedynczych komórek, jak i ich historii. Opracowano różne techniki eksperymentalne i analityczne w celu uzyskania i ilościowego określenia filmów ekspresji fluo....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Uzyskanie filmów z mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek drożdży rosnących w komorze mikroprzepływowej
- Zaszczepić 1 ml pożywki SC (syntetyczne zdefiniowane pożywki z 2% glukozą i pełnym dopełnieniem aminokwasów) komórkami ze świeżo rosnącej płytki i inkubować kulturę przez noc ~16 godzin na bębnie rolkowym w temperaturze 30 °C. Przygotować kulturę tak, aby końcowa pożywka o długości600 nm wynosiła ~0,1 dla wczesnego wzrostu w fazie logarytmicznej.
- Rozcieńczyć kulturę starterową w razie potrzeby i odrosnąć 1 ml w świeżej probówce przez dodatkowe 6-8 godzin do OD600nm = 0,1. Dzięki temu komórki rosną w stanie us....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Prawidłowo przeprowadzony i przeanalizowany eksperyment pozwoli na uzyskanie głównie ciągłych szeregów czasowych dla pojedynczych, całych komórek z realistycznie przypisanymi czasami pojawienia się pączka oraz podziału. Przykładowo, wykonaliśmy powyższy protokół z użyciem haploidalnego szczepu drożdży wykazującego ekspresję zintegrowanej kopii białka fluorescencyjnego Cerulean (CFP) pod kontrolą konstytutywnego promotora ADH1, aby zaobserwować, jak wzrost i globalna ekspresja mogą zmieniać się w czasie .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Powyższy protokół opisuje prostą metodę uzyskiwania i analizowania danych szeregów czasowych fluorescencji z ograniczonym doświadczeniem w mikrofluidyce lub w tworzeniu oprogramowania. Pozwala na uzyskanie poklatkowych filmów fluorescencyjnych pojedynczych komórek drożdży; wyodrębnić odpowiednie pomiary wielkości i ekspresji komórek; nadzorowanie śledzenia i przypisywania pochodzenia; i analizuj zachowanie całych komórek w czasie za pomocą dostępnego na rynku urządzenia do hodowli mikroprzepływowej i wszechstronnego graf.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Dziękujemy Emily Jackson, Joshua Zeidman i Nicholas Wren za komentarze na temat oprogramowania. Praca ta została sfinansowana przez GM95733 (do N.M.), BBBE 103316 i fundusze startowe MIT (do N.M.).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Y04C Płytka perfuzyjna drożdży | CellAsic | Y04C-02 | |
| ONIX Platforma perfuzji mikroprzepływowej | CellAsic | EV-262 | |
| Axio Observer.Z1 | Mikroskop Zeiss | ||
| Plan-Apochromat 63x/1.40 Olej DIC | Obiektyw Zeiss | 440762-9904-000 | |
| Cascade II EMCCD | Kamera Fotometria | ||
| Metalohalogenkowa lampa łukowa Lumen 200 | PRIOR Scientific | ||
| Kostka filtra dichroicznego z potrójnym pasmem przepustowym oraz zestaw filtrów wzbudzenia i emisji | Zestaw Chroma Technology Corp | #89006 | Używany do kontrolera YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato) |
| MAC 5000 i kół filtrowych | Ludl Electronic Products | ||
| MATLAB R2011a | Mathworks | Wersja 64-bitowa radzi sobie z dużymi plikami danych lepiej niż wersja 32-bitowa |
Bibliografia
- Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews. Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene Regulation at the Single-Cell Level. Science. 307 (571....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
