Summary
Trypsin fordøjelse er en af de mest almindeligt anvendte metoder til at analysere retinal vaskulatur. Dette håndskrift beskrives metoden i detaljer, herunder centrale ændringer for at optimere teknikken og fjerne ikke-vaskulære væv og samtidig bevare den overordnede arkitektur af skibene.
Abstract
Trypsin digest er guld standard metode til at analysere den retinale kar 1-5. Den tillader visualisering af hele netværket af komplekse tredimensionale retinale blodkar og kapillærer ved at skabe en todimensional flade-mount sammenkoblede vaskulære kanaler efter fordøjelse af ikke-vaskulære komponenter af nethinden. Dette gør det muligt at undersøge forskellige patologiske vaskulære ændringer, såsom mikroaneurismer, kapillær degeneration og abnorm endotel til pericyt forhold. Men den metode er teknisk udfordrende, især i mus, som er blevet den mest udbredte dyremodel til at studere nethinden på grund af den lette genetiske manipulationer 6,7. Hos mus øje, er det særligt vanskeligt helt at fjerne ikke-vaskulære komponenter, samtidig med at den samlede opbygning af retinale blodkar. Til dato er der en mangel på litteratur, der beskriver trypsin digest teknikken i detaljer in musen. Dette håndskrift giver en detaljeret trin-for-trin metode af trypsin digest i muse nethinden, og samtidig give tips om fejlfinding vanskelige skridt.
Introduction
Visualisere vaskulaturen af nethinden er en ekstremt vigtig at dissekere de mekanismer af forskellige øjensygdomme, såsom diabetisk retinopati. Det tillader en at vurdere de tidligste vaskulære abnormiteter, herunder mikroaneurismer, kapillær degeneration og pericyt tab 8,9. Til dato har der været flere teknikker udviklet til at analysere den retinale vaskulatur. Perfusion af forskellige farvestoffer er blevet brugt til at fremhæve de skibe, men alle har delt lignende begrænsninger. Injektion sjældent fremhæver hele retinal vaskulatur medmindre gives på et højt pres, hvilket risikerer brud og beskadige fartøjer 1.. Immunofarvning af vaskulær endotel med fluoroforen-mærket G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 konjugeret, I21413, Invitrogen, 1:100 fortynding) og nethinde flade mounts kan fremhæve den overordnede arkitektur af skibene, men uden nærmere visualisering af kapillærer, kælderen membraner og pericytter . Det blev bemærket afFriedenwald at fartøjer kan fremhæves ved farvning flat-mounts af nethinden med periodisk syre-Schiff (PAS), eller hematoxylin og eosin (H & E) farvning 10.. Men farvning var ikke-specifik for skibene og fremhævede den ikke-vaskulære væv samt, hvilket gør det vanskeligt at skelne skibene. I 1960'erne udviklede Cogan og Kuwabara trypsin fordøje teknik, der gjorde det nemmere at visualisere den retinale kar ved at fordøje nonvascular komponenter af nethinden 1.. Siden dengang er trypsin fordøje blevet den gyldne standard metode til at analysere kar i nethinden 2-5. Men det er vigtigt at bemærke, at andre alternative teknikker til at isolere vaskulaturen er blevet beskrevet. Anvendelsen af osmotiske lysis er blevet anvendt til at isolere vaskulaturen og tillade biokemiske undersøgelser af væv 11,12, men proceduren er ikke blevet anvendt som en primær metode til anatomisk undersøgelse. Vævet print-metoden har væretanvendt til at isolere store segmenter af mikrovaskulaturen og giver mulighed for at studere electrotonic arkitektur karrene 13.. I teorien kunne denne teknik også anvendes til at studere anatomiske ændringer, da kvaliteten af de fartøjer, er høj. Men det er kun i stand til at isolere segmenter af hele vaskulatur netværket. Selv om disse metoder ikke kan erstatte trypsin fordøjelse, er det vigtigt at bemærke, at de har forskellige fordele og ulemper og er komplementære i denne henseende.
Trypsin Digest metode er teknisk udfordrende og er vanskelig at udføre konsekvent 6,7. Desuden er det blevet bemærket, at trypsin fordøjelse er særlig svært på en musemodel, især hvis man ønsker at bevare den samlede vaskulære arkitektur af nethinden 6,7. Udfordringer omfatter (1) over-fordøjelse af nethinden, der forårsager tab af både kar såvel som ikke-vaskulært væv, (2) under-fordøjelse, kræveromfattende mekanisk dissektion, som kunne føre til en beskadigelse af fartøjet seng, (3) dårlig adskillelse af den ikke-vaskulære væv fra vaskulaturen fører til ikke-specifik farvning. Adskillige håndskrifter har fremhævet disse udfordringer, men ingen har givet et detaljeret og konsekvent protokol at overvinde dem 14,15. Dette håndskrift vil indføre en trin-for-trin metode beskriver teknikken til at udføre trypsin fordøje på mus og rotter nethinder med specifikke tips om håndtering af de særligt vanskelige skridt. En skematisk oversigt er vist i figur 1..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Retinal Forberedelse
- Enucleate musen øjet. Brug den ene hånd, åbne øjenlåg, så øjet er synligt. Med den anden hånd, ved hjælp af en buet pincet (buede opad) lægge pres på overlegne og ringere aspekter af kredsløb, før globussen stikker. Luk forsigtigt pincet på den bageste del af øjet og løfte i en kontinuerlig bevægelse for at enucleate øjet.
- Lave øje med 10% neutral bufret formalin i mindst 24 timer.
- Sted øje i PBS-opløsning i en lille petriskål.
- Dissekere ud nethinden forsigtigt under et mikroskop, der tager sig at undgå at fremkalde store tårer. Foretag en indledende snit i hornhinden med dissektion saks. Så mens du holder snittet område med lige pincet, bruge en saks til at klippe langs grænsen af hornhinden og sclera fjerne hornhinden. Brug fine buede og lige pincet, forsigtigt skræl sclera og choroidea væk fra nethinden mod synsnerven. Dette trin kræver tålmodighed somhurtigt frigøre nethinden kan føre til tårer. Tag linsen og eventuel overskydende iris og snavs fra nethinden 16..
2.. Vand Vasker
- Sted nethinden i en 24-brønds skål og dæk med vand (ca. 500 pi, filtreret med mindst en 45 um filter).
- Skift vand hver 30 min-1 time, mindst 4-5 gange.
- Lad natten i vand under forsigtig omrystning ved stuetemperatur.
Bemærk: vask trin er meget vigtigt, da de hjælper adskille neurale retinalag fra blodkarrene.
3.. Trypsin Digest
- Fjerne vand og inkuber nethinden i en opløsning af 3% trypsin (Difco 1:250) i 0,1 M Tris-puffer (pH 7,8) ved 37 ° C med blid til ingen omrystning. Trypsin digest er fuldført, når vævet begynder at vise tegn på opløsning (ca. 1,5 time).
Bemærk: Undgå hurtige rystningda dette kan beskadige kar. - Forsigtigt, pipette ud trypsin i en separat godt bruge et mikroskop for at undgå at berøre nethinden. Denne overskydende trypsin kan bruges senere, når manipulere fartøjer under mikroskopet, i takt 4.3.
4.. Adskillelse vaskulaturen
- Læg filtreret vand til nethinden. Derefter forsøge at skrælle den indre begrænsende membran med pincet og med saks evt. Ryst med mild agitation for 5 min. Forsigtigt, pipette vandet ud under mikroskop for at undgå at beskadige nethinden.
- Gentag vand vasker (i 5 min hver) til at hjælpe med at befri det netværk af fartøjer fra vedhængende retinavæv. Skylninger med vand er afsluttet, når der er lidt at ingen rester tilbage i vandet efter vask.
- Omhyggelige manipulationer under en dissektion mikroskop er nu brug for yderligere fri af netværket af skibe. Nedenfor er en række nyttige teknikker, der kan anvendes i rækkefølge eller INDividually at opnå det ønskede resultat på grundlag af teknisk præference:
- Ved hjælp af en 200 gl pipette forsigtigt pipette vand op og ned ved siden fartøjer, blæser vand ved skibe, der forårsager blid omrøring.
- Anvendelse af 200 pi pipette trypsin pipetteres op og ned for at hjælpe coat vægge pipetten. Derefter forsigtigt pipette hele skibet netværket op og ned én gang for at hjælpe med at nedbryde ikke-vaskulære væv.
Bemærk: Centrering pipettespidsen på synsnerven snarere end kanterne af det vaskulære netværk kan også forhindre karret i at klæbe til spidsen. - Løft forsigtigt kar med fine pincet ud af vand til at løsne uden vaskulære komponenter.
- Hvis ovenstående trin ikke fungerer, tilføjer trypsin på nethinden til at hjælpe med at nedbryde vævet, og der inkuberes ved 37 ° C i flere minutter. Fjern derefter trypsin og gentage trin 4,1-4,3.
<strong> Bemærk: Sørg for at påføre alle instrumenter, der kommer i kontakt med skibene i trypsin (f.eks pipettespids, tang). Dette vil bidrage til at undgå vedhæftning af vaskulatur til udstyret.
5.. Visualisere vaskulaturen
- Placer en dråbe vand på et rent objektglas. Ved hjælp af en 200 gl pipette eller pincet, overføre de spaltede fartøjer i vandet. Sørg for, at vaskulære flat-mount er foldet ud. Den overfladespænding vand hjælper til at udfolde nu diaphanous vaskulære netværk. Hvis vævet ikke udfolde, tilføje ekstra vand og forsigtigt ryste slide for at lette udfoldning.
- Fjern overskydende vand meget langsomt ved pipettering eller ved hjælp af et stykke køkkenrulle.
- Lad objektglassene tørre helt.
- Stain slides via passende protokol med enten PAS / haematoxylin eller H & E pletten.
Bemærk: PAS / hæmatoxylin er nyttige til at identificere karvæggen og cellulære kerner, H & E er nyttigt for dåvisningen RBC så godt. - Dehydrer og monter (Permount montering medium).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det endelige produkt af en vellykket procedure er en flad-mount af hele nettet af muse nethinden vaskulatur med arkitekturen bevares, farvet med enten PAS / hematoxylin eller H & E, som vist i figurerne 2-4. Klar differentiering af endotelceller og pericytter kan ses som vist i figur 3. I nethinden, er kernerne af endotelceller ovale eller aflange og ligge helt inden for karvæggen. Pericyt kerner er små, sfæriske, bejdse tæt og har generelt en udstående position langs kapillærvæggen.
Trypsin digest er en fælles procedure for at analysere vaskulær patologi i diabetiske dyremodeller. Patologiske vaskulære læsioner såsom mikroaneurismer, pericyt spøgelser (bevis for pericyt tab), acellulær kapillærer og kapillær degeneration er blevet beskrevet. Figur 4 viser et eksempel på kapillær degeneration ses i en db / db mus, en model for type II diabetes. Selvom proceduren blev optimeret til mus nethinder, har lignende resultater også blevet opnået i rotters nethinder, som vist i figur 5. Det er vigtigt at bemærke, at rotte nethinder er meget større, og en 12-brønds plade blev anvendt i stedet for en 24-brønds plade. Vaskulaturen netværk af rotte nethinden er også mindre skrøbelige end musen modstykke.
Det er yderst vigtigt at fjerne så meget af den ikke-vaskulære væv som muligt. Eventuelle rester vil føre til ikke-specifik farvning og føre til dårlig visualisering af kar. Figur 6 viser et eksempel på mislykket fjernelse af hele det ikke-vaskulære væv i trin 4. Ligeledes er det også vigtigt at have nethinden blive udfoldet ved montering for at forbedre visualisering af kar. Figur 7 repræsenterer mislykket udfoldning af vaskulære faste mount i trin 5.1.
Ure 1 "fo: content-width =" 5.75in "fo: src =" / files/ftp_upload/50489/50489fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50489/50489fig1.jpg "/>
Figur 1. . Skematisk trypsin Digest protokollen (1) Retinal Forberedelse: isolere nethinden fra øjet, (2) Vand vasker: Vask i filtreret vand natten, (3) Trypsin Digest: Inkubér i 3% trypsin ved 37 ° C i 1-1,5 time; (4) Adskillelse af karrene: isolere vasculature via serie af vand vasker og dissektion under mikroskop, (5) Flyt karsystem til at glide og lad tørre, (6) Visualisering karrene:. pletten slide med PAS eller H & E, dehydrere og monter Klik her for at se større figur .
Figur 2. Kontrol db / m muse trypsin digest (H & E, 20x).Dette tal er en oversigt over den retinale vaskulære netværk viser normal vaskulær arkitektur.
Figur 3. Kontrol db / m muse trypsin digest (H & E, 600x). Dette er et forstørret billede af nethinden i figur 2 viser den normale vaskulære arkitektur. Endotelcelle (hvid pil) og pericyt (sort pil) er fremhævet.
Figur 4.. Diabetisk db / db mus trypsin digest (H & E, 500x). Af 52 uger begynder db / db-mus til at udvikle vaskulær patologi såsom kapillær degeneration (hvid pil).
Figur 5. Normal rottenethinden trypsin fordøje, (PAS, 20x [a], 100x [b]). En oversigt og forstørret billede af en normal rotte vaskulære netværk.
Figur 6.. Kontrol C57/Bl6 mus trypsin fordøje, ikke-karvæv intakt (H & E, 20x [a], 100x [b]). Med dårlige fjernelse af ikke-vaskulære væv, der er non-specifik farvning forringe visualisering af skibe.
Figur 7. Kontrol db / m mus trypsin fordøjelse, dårlig montering (H & E, 20x). Hvis nethinden ikke er tilstrækkeligt udfoldet, er utilstrækkelig visualisering af det vaskulære netværk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trypsin fordøjelse er en standardmetode til vurdering vaskulaturen af nethinden. Desværre er det teknisk udfordrende og kan resultere i høj prøve tab, hvis ikke udført korrekt. Desuden procedure er særlig vanskelig i mus, hvilket kan begrænse anvendelsen af denne teknik i de almindeligt anvendte genetiske dyremodeller for øjensygdomme. Dette papir giver vejledning om, hvordan du udfører proceduren effektivt og konsekvent i mus øjne.
Der er flere kritiske trin i protokollen. Første er det afgørende, at nethinden dissekeres ud omhyggeligt for at undgå eventuelle store tårer, for at sikre, at den vaskulære netværk forbliver intakt. For det andet, vask nethinden i filtreret vand natten er vigtigt, da det hjælper adskille neuroretinal lag fra blodkarrene, hvilket letter en lettere adskillelse efter trypsin fordøje. Én ændring, der vil kunne fremskynde processen ville være at placere nethinden i 1% triton X-100 blandes i filtreret vand i 1-2 timer. Derefter kan trypsin fordøjelse udføres samme dag efter en række vandet skyller at fjerne Triton X.
Det er vigtigt, at de retinale væv overvåges konstant under trypsin digest for at undgå utilsigtet opløsning af vaskulaturen væv. Baseret på vores erfaringer, er omkring 1-1,5 hr tilstrækkelig til at udrette fordøjelse af nervevæv, samtidig med at karrene intakt. Mindre tid er nødvendig for yngre mus. Forsigtig omrystning kan udføres under trypsin fordøje at hjælpe med at fremme adskillelsen af blodkar fra det resterende væv, men er ikke nødvendig. Det er vigtigt at undgå en stærk agitation, da dette kan føre til rivning af skibene.
De kritiske trin, der kræver mest opmærksomhed involverer adskillelse vaskulaturen efter trypsinfordøjelse. Ved udførelse af vaskevand, er det vigtigt at undgå pipettering vaskulaturen. Afpipettering afvaskulaturen bør kun anvendes som en metode til at separere vaskulaturen efter væggene er blevet overtrukket med trypsin. Alle manipulationer skal gøres omhyggeligt under dissektion mikroskop som netværket af skibe kan nemt blive beskadiget. De forskellige teknikker beskrevet i trin 4 med held kan anvendes i en række forskellige kombinationer. I sidste ende vil det være op til den enkelte eksperimentator at finde den tilgang, der virker bedst for dem. Det er vigtigt, at alle værktøjer, der kommer i kontakt med blodkarrene overtrækkes med trypsin. Dyppe værktøjer intermitterende og ofte i trypsin under proceduren kan forhindre vedhæftning af vaskulaturen og potentielle forstyrrelser.
Virkningen af denne procedure er også afhængig af baggrunden musemodel. Nogle mus baggrunde er ikke så befordrende at bevare hele vaskulatur nettet. For eksempel er den FVB baggrunden homozygot for en phosphodiesterase-6 mutation gør dem tilbøjelige til retinal degeneration 17.. Fra vores erfaring, har vi fundet, at deres retinal vaskulatur er i sagens natur mere skrøbelig, og vi var ude af stand til at bevare hele kar-netværket. Derfor er det vigtigt, at baggrunden skal tages i betragtning før forsøger denne teknik.
I sidste ende, det vigtigste begrænsning til denne procedure er en persons dissektion færdigheder. Det er vigtigt at bemærke, at selv hvis en person kender de teknikker godt, kan det tage flere forsøg, før de begynder at opnå ensartede resultater. Således vil vi anbefale, at de berørte lab personale udføre flere praksis dissektioner at få tillid og ankommer til den bedste og mest konsekvent tilgang før udførelse af proceduren på deres eksperimentelle væv. Det er vigtigt at bemærke, at når mestrer, trypsin fordøjelse er en værdifuld teknik, der kan anvendes til at vurdere vaskulær patologi (figur 4). Trypsin fordøje kan også udføres succes på bevarede nethinder, der har været i fiksativ i flere år 1.
Afslutningsvis fortsætter trypsin fordøje at være en yderst nyttig metode til at analysere den retinale kar siden dens beskrivelse af Cogan og Kuwabara i 1960'erne. Det tillader detaljeret visualisering af hele vaskulære netværk, sammenlignet med immunofluorescens / H & E / PAS farvede sektioner, flad-mounts og farvestof-injektioner. Selv om det er teknisk vanskeligt, dette manuskript beskriver proceduren i detaljer, så det kan udføres med succes. Som et resultat, håber vi undersøgere nybegyndere til fremgangsmåden vil have tilstrækkelig vejledning til at tillade vellykket og sammenhængende analyse af retinale vaskulatur i deres eksperimentelle modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af NIH RO1-EY019951 (AAF), Illinois Society for forebyggelse af blindhed (JCC, AAF), frie midler til Department of Ophthalmology fra forskning til at forebygge blindhed (RPB), NY og RPB Medical Student Fellowship Grant (JCC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| 10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | |
| Trypsin (1:250) | Amresco | 0458-50G | Make 3% trypsin in 0.1 M Tris |
| TRIZMA base | Sigma | T1503-1KG | Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C) |
| TRIZMA | Sigma | T3253-500G | |
| Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
| EQUIPMENT | |||
| Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm) | ||
| Straight scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm |
| Straight Forceps (Inox) | Dumont #5 | 11252-20 | Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm |
| Curved Forcepts (Dumostar) | Dumont #7 | 11297-10 | Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm |
| Dubnoff Metabolic Shaker Incubator | Precision Scientific | BDG59442 | Shaker optional |
| 24-well dish | Falcon | 353047 | |
| Microscope Slides | VWR | 82027-132 | |
References
- Kuwabara, T., Cogan, D. G. Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture. Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).
- Kuwabara, T., Cogan, D. G. Retinal vascular patterns. VII. Acellular change. Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).
- Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti. Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).
- Danis, R. P., Wallow, I. H. HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).
- Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat. Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).
- Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).
- Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).
- Midena, E., et al. Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio. Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).
- Chapter 30. Diabetic Retinopathy. , Lippincott Williams and Wilkins. (2005).
- Rosenblatt, B., Benson, W. E. Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy. Ophthalmology. Yannoff, M., Duker, J. , 3rd edition, Mosby, Inc. (2008).
- Friedenwald, J. S. A new approach to some problems of retinal vascular disease. Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).
- Podesta, F., et al. Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro. Am. J. Pathol. 156 (10), 1025-1032 (2000).
- Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).
- Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).
- Li, Q., et al. Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).
- The Jackson Laboratory [Internet]. , Available from: http://jaxmice.jax.org/strain/001800.html (2012).
