Summary
我们容许浓度的三脂肪酸（油酸，亚油酸和亚麻酸）和霍乱毒素没有显着不利影响细胞生存脂肪酸和毒素溶解，并利用他们在细胞存活实验来确定。
Abstract
脂肪酸在预防和减轻人类和非人类疾病的积极作用已经并将继续被广泛记载。这些角色包括感染性和非感染性疾病，包括预防炎症和传染病的粘膜免疫的影响。霍乱是由霍乱弧菌引起的急性肠道疾病。它发生在发展中国家，如果不及时治疗，可导致死亡。虽然霍乱疫苗存在时，它们并不总是有效的，需要其他的预防方法。我们容许浓度的三脂肪酸（油酸，亚油酸和亚麻酸）和霍乱毒素，分别使用小鼠BALB / C小鼠巨噬细胞和人类肠道上皮细胞，以确定。溶解上述脂肪酸和使用细胞增殖实验，以确定的浓度范围和特定浓度的脂肪酸，没有吨有损于人类肠道上皮细胞的存活率。增溶的霍乱毒素B亚单位，在一个试验中，并用它来确定的浓度范围和霍乱毒素，在统计学上不降低细胞存活率在BALB / C小鼠的巨噬细胞中的特定浓度的。
我们发现最佳的脂肪酸浓度介于1-5纳克/微升，和霍乱毒素<30纳克每处理的。这些数据可能有助于未来的研究，旨在找到脂肪酸在预防或减轻感染霍乱的保护黏膜的作用。
Introduction
脂肪酸，如油酸，亚油酸和亚麻酸对健康的好处已经并继续记录。例如，油酸有助于渗透的亲脂性药物在体内1,2冠状动脉心脏病，降低了24％时，饱和脂肪酸3取代的，并且是用于治疗代谢性疾病如肾上腺脑白质营养不良4是X-连锁的脂肪酸代谢的遗传性疾病。一个必要的前体在哺乳动物中花生四烯酸，亚油酸（不像油酸）时由体内合成，必须通过外部信息源，例如由亚麻籽消耗。5研究表明一些有益的健康效应如亚油酸：对皮肤的抗老化性能;抗发炎的特性;降低大肠癌和前列腺癌细胞增殖;和能力对抗肥胖和推广Øf心血管健康。9 亚麻酸发挥了作用，减少牙周发炎，10和调节血栓素和前列环素的生物合成。
12阿尔皮塔（Arpita）研究胆汁脂肪酸和胆固醇的影响的五霍乱弧菌的毒力因子的表达和活力。山崎13日表示，红辣椒，以及其他自然提取的化合物，甲醇提取物有可能降低生产霍乱毒素。可以想象的是考虑使用在上面的脂肪酸（如亚麻种子）通过粘膜免疫的传染病，如霍乱的预防和减轻丰富的食品。我们进行了调查，以溶解脂肪酸和确定，使用细胞增殖实验，最高浓度与人肠上皮细胞中的脂肪酸，可以承受的，没有不利影响策LL可行性。我们假设，油酸，亚油酸和亚麻酸，在较低浓度对细胞活力提供了有益的效果，但是，在较高浓度时，它们将是对细胞有毒。而且，我们溶解的霍乱毒素和霍乱毒素B亚单位的确定的最大浓度，BALB / C小鼠巨噬细胞的细胞存活率没有显着下降，可以容忍。我们推测对细胞活性的霍乱毒素的毒性作用，即使在非常低的水平。增溶霍乱毒素的方法，用它来确定的毒素，细胞没有显着下降的生存能力可以容忍的最大金额为今后的研究提供了一个优点。例如，可以使用上述的方法的组合，以确定是否脂肪酸提供抗霍乱感染的粘膜免疫的细胞。据我们所知，这种理性和方法尚未探索。
我们二scuss我们的初步数据如何可以用在以后的调查，以确定是否油酸，亚油酸和亚麻酸提供细胞粘膜抗感染霍乱。
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Protocol
1。组织文化
- 使用小家鼠巨噬细胞（BALB / c小鼠）对霍乱毒素的测定。最初文化M.肌细胞按照厂商的说明。
- 传播的BALB / c小鼠细胞的Dulbecco改性鹰的中等与L-谷氨酰胺10％胎牛血清完成，并用10％胎牛血清，5％大号-谷氨酰胺和1完成1％抗生素/抗真菌剂或RPMI 1640基地媒体％抗生素/抗真菌试剂。
- 培养细胞在75 厘米康宁烧瓶，在37℃，95％空气和5％CO 2通气帽。
- 人类肠道上皮细胞在24小时内交货测定脂肪酸测定按照生产商的说明。
- 在75 厘米康宁烧瓶通风上限在HybriCare媒体在37℃下，用10％FBS和30 ng / ml的人EGF完成人类的肠上皮细胞传播不要使用抗生素/抗真菌试剂生产商的指示。
- 斯普利特所有细胞（1:3）约70％汇合。
- 冻结，并把整个研究过程中使用标准的冻结协议的所有细胞。
- 注：对于较大规模的脂肪酸浓度测定，使用更快的成长，更容易维护，最初小鼠巨噬细胞。对于判罚尺度的脂肪酸浓度测定，使用人体上皮细胞。使用小鼠巨噬细胞的所有霍乱毒素治疗（见讨论）。
2。脂肪酸和霍乱毒素治疗
- 油酸，亚油酸和亚麻酸的转移，从公司提供的玻璃安瓿消毒的玻璃小瓶。
- 每个脂肪酸转移到一个单独灭菌的Eppendorf管中，先溶解在100％乙醇为1:6的稀释，然后在终浓度为10微克/微升的RPMI 1640不完全介质。
- 涡每个解决方案和互感器呃，用于存储在冷冻机（-20℃）的玻璃小瓶中。
- 板细胞以2500细胞/孔在96孔组织培养板中。
- 添加适当的完整的媒体带来的总孔体积为200μl准备MTT法检测细胞脂肪酸治疗。
- 经过24小时的增殖期，取出纸张，更换新鲜的培养基。
- 添加合适浓度的井进行测试，以每个脂肪酸（见结果）。将完整的媒体带来的以及总体积为200μl。
- 孵育前24小时开始MTT法处理板。
- 溶解于PBS中的浓度为1毫克/毫升和等分试样的溶液，在离心管中的霍乱毒素和存储的离心管中，在2-8℃。
- 对于细胞治疗，在任一灭菌的PBS（pH 7.4）中，或者不完整，DMEM培养液1:100稀释的毒素作最后的工作浓度为1 ng /μl的。
- 霍乱毒素处理细胞MTT法，如上述的板的细胞制备。
- 经过24小时的增殖期，加井脂肪酸的应用（上）使用的程序进行测试，以适当的浓度霍乱毒素（浓度，看到的结果）。
- 孵育前24小时开始MTT法处理板。
- 整个文件作为一个正（正C）和阴性对照（阴性），为脂肪酸和霍乱毒素处理，与完全培养基和70％的乙醇，分别孵育。
- 对于所有的样品和治疗，至少使用3次重复组（n = 3），阳性对照组（n = 6在这项研究中）复制。
3。 MTT法
- 做一个的MTT原液的浓度为2.5毫克/毫升。
- 将上述溶液在96孔板的每个孔中进行测试，用200μl新鲜的完全培养基溶液取代。
- 广告≤10微升MTT溶液，以每孔。
- 孵育板在37℃3-4小时。
- 丢弃媒体解决方案，向每孔添加100μl的1M HCl的异丙醇0.04。
- 将培养板在室温下五分钟。
- 从各孔将该溶液转移到一个新的离心管中。
- ，在室温下，以20,000×g离心1分钟，或直至颗粒形成。
- 将20-40微升每个样品之间酶标仪。
- 用分光光度计在570 nm处的吸光度。
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Representative Results
脂肪酸的最佳浓度测定
脂肪酸的最适浓度被定义为细胞生长的最大浓度可媲美或超过对照组细胞，在结果中的相对低的变异。 ，以确定最佳浓度的油酸，亚油酸和亚麻酸的细胞最初以较大的增量，并与不同浓度的各脂肪酸购买较小的增量处理， 图1示出的生存的细胞作为阳性对照的治疗使用的函数描绘脂肪酸浓度的增加。显而易见的是，细胞不耐受超过100毫微克/微升的任何脂肪酸的浓度。一单向方差分析表明，各处理的装置中的一个或多个其他不同（P <0.001）。后hoc检验（杜克）表明，油酸以外的所有治疗在1纳克/微升不同的阳性对照。有趣的是，由于高变异性，这种治疗轻微阴性对照组没有显着不同。对于亚油酸和亚麻酸，单因素方差分析表明，至少有一个的意思是比其他的不同（P <0.001）。甲Tukey的事后测试显示为10 ng /μl的二者之一脂肪酸治疗的平均值是阳性对照没有显着不同的，但是从阴性对照组（P <0.05）。
重复这个实验中的浓度均低于100毫微克/微升，在10毫微克/μl递增（至70纳克/微升，使用人上皮细胞）。细胞的存活提供了图2中的各浓度。对于油酸的（ 图2a），单因素方差分析表明，装置中的一个或多个差异（p <0.001）。然而，这仅仅是在高浓度的治疗（40和50的纳克/微升），所提供的数据不同的阳性对照。有趣的是，观察到的差异是由于增加细胞存活率（有更多的变化， 图2a）。单因素方差分析，得到了类似的结果亚油酸和亚麻酸。具体而言，没有治疗手段是不同的阳性对照的平均。再次，的变异似乎增加一些的浓度较高（ 图2b和2c）。
霍乱毒素的最佳浓度测定
霍乱毒素的最佳浓度被定义为不影响细胞生存力时的浓度或刚刚开始，以减少未经处理的细胞相比。要评估的最低浓度霍乱毒素，最低限度地降低细胞活力，细胞最初被视为不同浓度霍乱毒素大increments和购买与较小的增量。 图3a示出一个下降的可行性细胞的存活趋势作为霍乱毒素毒素水平的处理相对较大的增量（100-1,000纳克之间，R 2 = 0.5436）的结果。正如预期的那样，细胞存活率差异很大，每个处理（ 图3a）。存活率的观察到的变异性大，导致在与任何处理（单因素方差分析）为阳性对照的均值之间没有显着性差异。基于这些结果，我们确定的毒素含量<100毫微克应该进一步测试。 图3b所示为较小的毒素水平治疗的细胞活力。细胞存活率是高度可变的，几乎所有的毒素浓度，虽然略有增加，观察在作为处理的结果的可行性。这些增加（ 图3b）没有统计学显着的任何处理相比，阳性对照的均值（单因素方差分析，杜克）。
图1。可用的脂肪酸浓度的测定：不同的脂肪酸浓度的影响比较大的增量（100-1000毫微克/微升），油酸，亚油酸和亚麻酸。 点击这里查看大图 。
图2。细鳞脂肪酸浓度测定：不同的脂肪酸浓度的影响较小的增量（10纳克/微升），对人体肠道上皮细胞的存活。肠上皮细胞分别用varying的浓度（a）中的油酸亚油酸（b）和亚麻酸（三）。阳性对照是只完整的媒体，和阴性对照用70％乙醇处理的细胞。每次试验中，n = 3时为阳性对照组（n = 6）以外的所有的治疗。 点击这里查看大图 。
图3。 （一）治疗测定可用的霍乱毒素浓度评估不同浓度霍乱毒素对小鼠巨噬细胞存活小鼠巨噬细胞应用的基础上，用不同浓度霍乱毒素较大的增量较小的（b）所示。阳性对照细胞用只完整的媒体，负C用70％乙醇ONTROL。每次试验中，n = 3时为阳性对照组（n = 6）以外的所有的治疗。 点击这里查看大图 。
图4。实验设计用于在将来的研究：细胞裂解物的合适的脂肪酸和毒素的浓度测定可用于治疗巨噬细胞和细胞因子的动态可通过免疫印迹法和ELISA使用抗感染的标记物的特异性细胞因子的定性和定量测定。
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Discussion
建议浓度脂肪酸和霍乱毒素
虽然脂肪酸如何增强粘膜免疫的确切机制不明，一些研究试图探讨其有益的影响。本研究的目的是提供方法来确定细胞的脂肪酸，可以容忍，以及霍乱毒素的最大浓度没有显着影响细胞的存活细胞可以容忍的最大浓度。
为了测定浓度的三脂肪酸（油酸，亚油酸和亚麻酸），以及霍乱毒素用于治疗的细胞没有显着的不利影响，对细胞活力的不同溶解的脂肪酸和霍乱毒素处理过的组织培养细胞浓度其次MTT法评估可行性。基于我们的方法和结果，我们提供范围脂肪酸和霍乱毒素有用为今后的调查，旨在使用这些脂肪酸或霍乱毒素（见下文）。我们建议使用浓度为1，5-10，5-10（毫微克/微升），油酸，亚油酸和亚麻酸，分别使用人肠上皮细胞。我们也建议使用霍乱毒素<30毫微克（每200微升，见方法）使用BALB / C小鼠巨噬细胞。我们认识到，至少霍乱毒素，无显着性差异观察治疗相比，阳性对照细胞活力之间。然而，我们的建议是基于观察的结果，毒素含量较高风险相对较高的变异细胞活力。
未来的研究
在这项研究中的脂肪酸和霍乱毒素水平提供的数据可用于在以后的研究中。我们提供了一个这样的调查，这里的一个例子。
霍乱是一种与开发相关的疾病私奔国家没有适当的污水处理和污水处理厂和安全的饮用水。在2009年，死亡人数超过3000五月份期间，由于仅在津巴布韦霍乱相关症状的报告，截至2011年14，霍乱仍然是一个包括海地爆发（2010年疾病预防控制中心，在世界不同地区的疫情） 。在2010年的分子遗传学研究的证据表明，这种细菌在此爆发的尼泊尔裔15病是由摄入的粪便污染的食物或饮用水和定植肠道经五霍乱弧菌 ，由肠毒素的释放。虽然霍乱疫苗接种确实存在，他们并不总是有效的防止感染暴发期间。有效和廉价的干预是需要的人群发生霍乱暴发。一种方法是，以研究是否有丰富的衍生工具，如油酸，亚油酸和亚麻酸的食物来源提供或加强粘膜抗感染霍乱。通过使用蛋白受体的细胞，如Toll样受体（Toll样受体）和核苷酸结合结构域（最接近现代种）的表面上发现的粘膜免疫的功能。通过在膜组合物和释放进行交互与TLRs的和最接近现代种的配位体的变化，添加的脂肪酸的肠上皮细胞，可提高识别有害微生物和招募适当的免疫反应的受体功能的。若要确定脂肪酸的影响霍乱感染，细胞因子的动态，如细 胞的释放的TNF-α，IL-6，IL-10和IL-12，必须研究更使人类的肠上皮细胞中比在小鼠巨噬细胞（ 图4）。这样的知识从未来的研究将有助于我们更好地理解脂肪酸可能工作的机制，以防止感染，才能最终提供有效的干预措施，以抑制胆汁一个爆发。这是可能的治疗之前，霍乱毒素感染细胞与脂肪酸的诱导和/或增强粘膜免疫应答在肠上皮细胞中，从而最终提高细胞活力过程中微生物的感染霍乱。
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Disclosures
从这项研究结果，这项研究的作者没有任何金融利益。肯恩大学为这项研究提供资金FT，FT在国王郡社区学院是目前雇员。
Acknowledgments
我们感谢保科沃斯和埃夫罗斯瓦西利乌博士实验室的协助，并提供小鼠巨噬细胞，分别。我们也感谢我们的实验室经理Richard Criasia与材料的指导和帮助。最后，作者感谢Ramanpreet，考尔的帮助视频制作。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells/Reagent | |||
| Mus musculus macrophages | ATCC | ATCC RAW 264.7 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | ATCC | 30-2002 | |
| L-glutamine | ATCC | 30-2115 | |
| Fetal bovine serum | Bio-west | S0250 | |
| Antibiotic/antimycotic | Hyclone | SV3007901 | |
| Human intestinal epithelial cells | ATCC | ATTC CCL-241 | |
| HybriCare media | ATCC | 46-X | |
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L-1376 | |
| Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L-2376 | |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Equipment | |||
| BD Falcon 96-Well Cell Culture Plates | BD Biosciences | 351172 | |
| Spectrophotometer with Dynex Revelations 4.22 software | Dynex | 91000101 | |
References
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