Summary
Неонатальной мышиной сетчатки обеспечивает хорошо характеризуется физиологической модели ангиогенеза, который позволяет исследования роли различных генов или наркотиков, которые модулируют ангиогенеза в
Abstract
Ангиогенез представляет собой сложный процесс образование новых кровеносных сосудов определяется прорастание новых кровеносных сосудов из ранее существовавших сосуд сети. Ангиогенез играет ключевую роль не только в нормальном развитии органов и тканей, но и во многих заболеваний, при которых образование кровеносных сосудов является нарушение регуляции, таких как рак, слепоту и ишемических заболеваний. Во взрослой жизни, кровеносные сосуды, как правило, так покоя ангиогенеза является важной мишенью для разработки лекарств романа, чтобы попытаться регулировать образование новых кровеносных частности, в болезни. Для того, чтобы лучше понять, ангиогенез и разработать соответствующие стратегии для регулирования его, требуются модели, которые точно отражают различные биологические шаги, которые участвуют. Сетчатки новорожденных мышей обеспечивает отличную модель ангиогенеза, поскольку артерии, вены и капилляры развиваются, чтобы сформировать сосудистого сплетения в течение первой недели после рождения. Эта модель также имеет то преимущество, что два-димерные (2D) структуры делает анализ простым по сравнению со сложными 3D анатомии других сосудистых сетей. Путем анализа сосудов сетчатки сплетения в различные моменты времени после рождения, можно наблюдать различные этапы ангиогенеза под микроскопом. В данной статье рассматривается простой процедуры анализа сосудистой сетчатки мыши с помощью флуоресцентного окрашивания isolectin и сосудистых специфических антител.
Introduction
Ангиогенез представляет собой сложный процесс развития определяется образование новых кровеносных сосудов из ранее существовавших сосуд сети и регулируется несколькими путями передачи сигналов. Наиболее известным из них является VEGF пути. VEGF высвобождается ишемических клеток и приводит к инициированию ангиогенеза в соседних кровеносных сосудов. Ведущим эндотелиальных клеток из нового сосудистого прорастают является клетка 'чаевые', которое производит филоподии, что протянуть руку по направлению к источнику VEGF, и сопровождается пролиферирующих эндотелиальных клеток стебля. Таким образом, активированные эндотелиальные клетки мигрируют и пролиферируют в направлении лишенной сосудов области, где они образуют новый сосудистых трубок. Для того чтобы стабилизировать эти трубы, чтобы поддерживать кровоток, эндотелиальные клетки взаимодействуют с перицитов и гладкомышечных клетках, которые окружают новых кровеносных сосудов 1. Ангиогенез является существенным для васкуляризации эмбриона и рост тканей. Однако, это также способствует развитию многих патологическихкал заболеваний, таких как рак, тогда как дефекты в ангиогенез, связанный с ишемической болезнью. Разработка эффективных лекарств для регулирования ангиогенеза в качестве средства лечения болезни поэтому представляет большой интерес. Например, эффективные анти-ангиогенных факторов приведет к снижению роста опухоли, в то время проангиогенные стратегии могут быть использованы для лечения ишемических заболеваний. Таким образом, модели ангиогенеза необходимы, чтобы лучше понять регулирование образование новых кровеносных и для разработки новых терапевтических стратегий для повышения или уменьшения роста сосудов.
Основополагающим элементом ангиогенеза исследования является выбор подходящего сосудистой модели. Многие в пробирке модели были разработаны для воспроизведения основные этапы ангиогенеза, таких как миграция эндотелиальных клеток, пролиферацию и выживание 2,3. Часто используемым в анализе пробирке является формирование разветвленной сети эндотелиальных клеток на матрицу Матригель, хотя тего не является специфичным для эндотелиальных клеток, а также не обычно включают поддержку перицитов и гладкомышечных клеток. Оценка исключая виво прорастание кровеносных сосудов использованием культуры мышь органов, таких как эмбриональные анализ тела, аортальный анализа кольцо и плода плюсневой анализ позволяет проводить анализ ангиогенеза эндотелиальные клетки в контексте дополнительных вспомогательных клеток. Однако основным ограничения этих анализов включают отсутствие кровотока и регрессии сосудов с течением времени, что дает ограниченное окно для анализа. Поэтому, чтобы понять регуляции ангиогенеза, точнее, в естественных условиях модели требуются например, разработанных в мыши с помощью подкожно имплантировали губки или Матригель зажигания, а также задние модели ишемии нижних конечностей. Тем не менее, эти модели являются сложными для анализа из-за сложных 3D архитектуру новых сосудов. В противоположность этому, данио эмбриона оказалось отличной моделью для визуализации ангиогенеза в целоморганизма 4. Тем не менее, мышь эволюционно гораздо более тесно связаны с человеческим, чем данио рерио, что делает мышь предпочтительной моделью во многих случаях. Следовательно ангиогенеза послеродовой сетчатки мыши представляет собой хорошо охарактеризованы методом выбора для исследования ангиогенеза. Это не только обеспечивает физиологический установки, но и 2D-сосудистом сплетении, которые можно легко визуализируют с использованием соответствующих флуоресцентных красителей. Архитектура сети судна, пролиферацию эндотелиальных, прорастание, периваскулярные набора клеток и сосудов реконструкции могут быть исследованы с помощью этой техники.
В неонатальный сетчатки мыши, развитие кровеносных сосудов сетчатки происходит в первые недели постнатальной жизни. Мыши, в отличие от людей, рождаются слепыми и сетчатка стала васкуляризированной только после рождения. Сосудов сетчатки возникают в центре сетчатки близко к зрительному нерву в постнатальный день 0 (Р0), а также разработать ангиогенезом с образованием сильно организоватьD сосудистого сплетения, которое достигает периферии сетчатки примерно на 5 P8. Кровеносные сосуды развивать характерным образом с капиллярной сплетение постепенно возрастает в направлении от диска зрительного нерва к периферии, чтобы генерировать регулярное чередование артерий и вен с промежуточным капиллярной сети. Сосудистой сети сетчатки обеспечивает идеальную модель для изучения ангиогенеза как сосуды могут быть легко идентифицированы, как они растут в том, что по существу является 2D плоскости, что делает его относительно легко изучить сосудистой сети сетчатки в плоской горы препаратов 5. Способ выделения мышью сетчатки новорожденных для анализа эндотелиальные клеточные ответы опрокинуться естественных условиях несколько часов бывший сообщалось 6. Кроме того, более детальное исследование всей сосудистой сети сетчатки и связанные с ними сосудистые маркеры требует иммуноокрашивания фиксированных экземпляров сетчатки на разных стадиях развития.
Здесь мы предлагаемПодробное описание надежный и технически прямой метод, который мы используем для целом окрашивания горе мышиных сетчатки сосудистого сплетения, от начального энуклеации послеродовой глаза (см. также 7) через протоколы окрашивания до конечного изображения под микроскопом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все стадии проводили при комнатной температуре, если не указано иное.
1. Энуклеация и фиксации Послеродовая Глаза
- Наведите мышь умерщвлены гуманным щенка на бок, снимите кожу, покрывающую глаз с помощью ножниц.
- Используйте ножницы и щипцы, чтобы выяснять глаз.
- Место ножницами ниже энуклеированными глаза, вырезать зрительном нерве и окружающих тканей и вынуть глаз. Переход на 24-луночный планшет, содержащий 4% параформальдегида (PFA) состоит в 2х PBS при комнатной температуре.
- Позвольте каждому глазу, чтобы исправить в течение 10 - 15 мин, а затем перенести в холодное 2x PBS на льду в течение 5 - 10 мин. Лучше всего, чтобы поразить enucleations и последующей фиксации для обеспечения степень фиксации равна для каждого глаза.
2. Рассечение Послеродовая мышиной сетчатки
- Передача глаза в чашку Петри, содержащую 2x PBS с помощью пластиковой пипетки Пастера, который был сокращен, чтобы расширить отверстие и место под Dissecting микроскопом.
- Удалите жир вокруг глаз с помощью пинцета и ножниц.
- Пирс края роговицы с острыми ножницами и вырезать вокруг роговицы и радужной оболочки глаза и выбросить.
- Вставьте пинцет между сетчаткой и склерой и удалить склеры стараясь не оторвать сетчатки. Слой сосудистой оболочки глаза также могут быть удалены, но если есть риск повреждения сетчатки, происходящих во время этого этапа, сосудистой оболочки слой может быть оставлен, поскольку это не должно значительно влиять на качество иммунной окраски.
- Снимите объектив и стекловидного тела с помощью щипцов.
- Снимите hyaloids сосудов, собирая их вместе в центре глаза с тонким пинцетом Затем быстро подними от центра сетчатки (альтернативно СНиП у основания гиалоидная сосуды с тонкими ножницами).
- Промойте чашеобразных сетчатки с PBS в чистую чашку Петри.
- Сделать 4 до 5 радиальных надрезов достижении примерно 2/3 радиуса сетчатки с помощью пружинных scissoRS создать «лепесток» формы.
- Слить PBS помощью пипетки Пастера, чтобы сгладить сетчатки, а затем удалите остатки PBS с небольшой кусочек впитывающей бумаги.
- Медленно пипетки холодную (-20 ° С) метанола по капле на поверхности сетчатки, пока полностью не покрыты, а затем наводнения с дополнительным количеством метанола. Это поможет исправить сетчатки и будет способствовать проницаемости. Сетчатки станет белым.
- Трансфер в 2 мл трубки с помощью пластиковой пипетки Пастера, который был сокращен, чтобы расширить отверстие.
- Оставьте сетчатки холодным метанолом в течение по крайней мере 20 минут, прежде чем приступить иммунной окраски. Из антитела, используемые здесь, только VE-кадгерина не может быть успешно использован в метаноле фиксированной сетчатки. В этом случае нужно сетчатки перейти прямо к иммунным после шага 9.
- При необходимости сетчатки могут быть сохранены в метаноле при -20 ° C в течение нескольких месяцев до окрашивания.
3. Иммуно / isolectin окрашивания сетчатки Vasculature
- Осторожно снимите / слить метанола и осторожно промыть сетчатки кратко в PBS (на данном этапе сетчатка все еще находится в той же 2 мл трубку из п. 11 выше).
- Снимите крышку и PBS сетчатки со 100 мкл Пермь / Блок раствор (PBS + 0,3% Тритон + 0,2% BSA) + 5% от соответствующей сыворотки (см. таблицу 1) и слегка встряхнуть в течение 1 часа.
- Удалить Пермский край / Блок и инкубировать сетчатки при осторожном встряхивании в течение ночи при 4 ° С с 100 мкл выбранного основного антитела (см. таблицу 1) и / или IsolectinB4, приготовленные путем разведения в Перми / Block.
- Удалить антитело / isolectin и мыть сетчатки 4 х 10 мин в PBS + 0,3% Тритон (PBSTX).
- В некоторых случаях, например, следующим окрашиванием IsolectinB4-Alexa488 или непосредственно конъюгированное первичного антитела, вторичное антитело не требуется, и сетчатки может быть установлен непосредственно (стадия 7). Когда неконъюгированный первичных антител был использован на шаге 3, затем 100 мкл соответствующего фторescent вторичным антителом (разведенного 1/200 в PBSTX) добавляли и оставляли для инкубации в течение ночи при 4 ° С и в течение 4 ч при комнатной температуре.
- Удалить вторичными антителами и мыть сетчатки 4 х 15 мин в 2 мл PBSTX.
- Передача сетчатки на слайды, используя широкие пластиковые отверстие пастеровской пипетки и удалить избыток PBSTX с абсорбентом ткани. Горы сетчатки путем добавления 50 мкл Продли mountant на покровное и осторожно позицию по сетчатке.
- Передача слайды холодильнике в течение ночи при 4 ° С, гарантируя, что они плоские и защищенном от света месте, с тем чтобы продлить mountant установить.
- Изображение сетчатки помощью конфокальной микроскопии или эпифлуоресцентной микроскопом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После вскрытия сетчатки должна выглядеть плоской цветок (рис. 1). При использовании протоколов, описанных выше, эндотелиальные клетки можно увидеть, используя isolectin B4-Alexa488 окрашивания и поддержки сосудистых клеток мышц визуализировали с использованием анти-альфа-актин гладких мышц (рис. 2). Низкий вид энергии с использованием 5-кратным цель на рисунке 2 позволяет обзор сосудистых организации сетчатки. Кроме того, используя различные комбинации антител, приведенных в протоколе выше, эндотелиальные клетки можно увидеть, используя анти-CD31 иммунным и поддерживающих перицитов видны с использованием антител против NG2 (фиг. 3) или десмин (рис. 4). Анти-десмин окрашивания очень полезен для визуального палец как процессы перицитов и определения, являются ли они тесно связаны с эндотелиальными клетками. В противоположность этому, анти-NG2 окрашивания ядер описываются каждого перицитов, что полезно, когдаколичественной оценки количества перицитов клеток на сосудистой сети. Это будет сделано путем подсчета количества клеток в поле зрения использования большой мощности (например 60X) цели. Если необходимо, альтернативные комбинации антител также может быть использован (см. таблицу 1), например, против коллагена IV полезен для визуализации сосудистой базальной мембраны. Сетчатки, которые окрашивали на эндотелиальные клетки могут быть проанализированы для ключевых особенностей ангиогенеза, таких как прогрессирование сосудистой направлении от центра к краю сетчатки, сосудистой плотности и судно разветвление частоты.
Рисунок 1. Появление сетчатки новорожденных сразу после вскрытия и добавлением метанола. Этот кадр взят использованием Zeiss Stemi SV6 и AxioCam HR С камерой.
Рисунок 2. Иммуноокрашивание целые горы сетчатки (возраст Р7) с Isolectin B4-Alexa488 (зеленый) (A), анти-альфа-актин гладких мышц-Cy3 (красный) (B) или объединить (C). Эти изображения взяты с Zeiss и AxioImager AxioCam HRM камеры с помощью 5X цели. Обратите внимание на чередование артерий и вен. Артерии признаны капиллярной зоне, свободной, что непосредственно окружает их, и покрыты гладкомышечных клеток, которые окрашены положительный (красный) для альфа-актин гладких мышц. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
load/50546/50546fig3highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50546/50546fig3.jpg "/>
Рисунок 3 Дважды иммуноокрашивание целые горы сетчатки (возраст P6) с анти-CD31 первичного антитела (обнаружены анти-IgG крысы конъюгированных с Alexa488, зеленый, A);. И анти-NG2 первичных антител, обнаружен с анти-IgG кролика конъюгированные с Alexa 594 (красный, B). Эти конфокальной изображения, сделанные с использованием 60X цель объединения лазерного сканирования изображений из 13 г ломтиков, каждый из 0,47 мкм толщины. Наложение изображения в C показывает CD31-положительных эндотелиальных клеток (зеленый) и NG2-положительных перицитах (красный). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 4 Дважды иммуноокрашивание целые горы сетчатки (возраст P6) с анти-CD31 первичного антитела (обнаружены анти-IgG крысы конъюгированных с Alexa488, зеленый, A);. И анти-десмин первичных антител, обнаружен с анти-IgG кролика конъюгированные с Alexa 594 (красный, B). Эти конфокальной изображения, сделанные с использованием 60X цель объединения лазерного сканирования изображений из 21 г ломтиков, каждый из 0,24 мкм толщины. Наложение изображения в C показывает CD31-положительных эндотелиальных клеток (зеленый) и десмин-положительных перицитах (красный). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
| Первичное антитело | Рабочее разведение | Блокирующий раствор (сыворотка + Пермь / квадратики) | Вторичное антитело |
| Anti-NG2 (хондроитин сульфат Протеогликан) 1:250 | 5% сыворотки козьего | Козы против кролика Alexa 594 | |
| Anti-GFAP | 1:500 | 5% сыворотки козьего | Козы против мыши Alexa 488 |
| Anti-Десмин | 1:500 | 5% сыворотки козьего | Козы против кролика Alexa 594 |
| Против коллагена IV | 1:200 | 5% сыворотки козьего | Козы против кролика Alexa 594 |
| Anti-Endoglin | 1:100 | 5% сыворотки козьего | Козы против крыс Alexa 594 |
| Анти-CD31 | 1:500 | 5% сыворотки козьего | Козы против крыс Alexa 488 |
| Anti-VE-Cadherin | 1:10 | 5% сыворотки козьего | Козы против крыс Alexa 594 |
| Anti-Alk1 | 1:25 | 5% сыворотки осла | Donkey козьего анти Alexa 594 |
| Anti-ОУРА-Cy5 | 1:100 | <TD> Пермь БлокированныеN / A |
Таблица 1. Примеры первичных антител для иммунофлуоресцентного окрашивания целом сетчатки горе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изложенный здесь метод предлагает простой и эффективный способ получения изображения из цветного целом препараты горе сетчатки новорожденных мышей, что делает его легко поддаются количественной оценке и физиологически соответствующие модели ангиогенеза. Первоначально, мышь глаз может быть довольно трудно анализировать из-за его небольшого размера и формы мира, так что некоторые практики и хорошие инструменты вскрытия необходимы для надежных результатов. Препарирование глаза подготовлены в 2x концентрации PBS важно, потому что это вызывает небольшое количество воды, потери от глаз и уменьшает внутри орбитальной давление, что облегчает вскрытие. Хорошая подготовка сетчатки важно по нескольким причинам. Сначала он поддерживает целостность сосудов. Во-вторых, если сосудистой гиалоидная не очень хорошо удалена это снижает эффективность окрашивания антителами, что приводит к высокому уровню фона и снижение разрешающей способности. Эта проблема может возникнуть, если время PFA фиксации сетчатки слишком длинный. ОднакоПеред окрашиванием длительного хранения до нескольких месяцев в метаноле в морозильной камере -20 ° C подходит до isolectin окрашивания и для большинства из антител в таблице 1. Хотя isolectin окрашивание редко проблематична, она делает пятно макрофагов в дополнение к эндотелиальным клеткам. Для хорошего иммуноокрашивание тотальных сетчатки, выбор антител является критическим и окрашивание протокола должна быть адаптирована в соответствии с специфичность антител и концентрации, которые могут варьироваться от партии к партии, когда поликлональные антитела используют. Высокий фон обычно можно уменьшить за счет снижения концентрации антител, увеличивая время стирки или добавив больше моющего средства промывания. Антитела по прибытии аликвоты и хранили, как указано производителем. Для тех, которые хранили при -20 ° С, рабочий аликвоты хранится в холодильнике, чтобы избежать повторных циклов замораживания оттаивания. Если яркие флуоресцентные пятна появляются на окрашенных образцов, особенно если это также присутствуетв регионе вокруг ткани, это говорит о том осажденный агрегатов присутствуют антитела, которые должны быть удалены во всех последующих экспериментах путем центрифугирования антитела 10000 оборотов в минуту в течение 5 минут перед использованием. Некоторые антитела, используемые в настоящее время нашей лаборатории в список материалов с соответствующим разведением (табл. 1). Выбор совместимого комбинацию антител, очень важно, чтобы избежать нежелательных перекрестной реакции между первичными и вторичными антителами. Клеточная пролиферация может контролироваться путем инъекции мышей с раствором BrdU примерно за два часа до сбора ткани. Этот аналог тимин включена в пролиферирующих ДНК и могут быть обнаружены с помощью специального анти-BrdU антителами, как описано выше 8.
Каждый сетчатки очень хрупкая, но могут быть окрашены для различных сосудистых маркеров при обработке ткани мягко во время работы через протокол. Ряд элементов управления, включенные вкаждый эксперимент, чтобы показать специфику окрашивания. Необработанные сетчатки покажет степень флуоресценции в ткани, которая должна быть минимальной. Нет первичного контрольного антитела не позволит определения неспецифического связывания вторичного антитела к ткани. Сетчатки, которые были случайно разрывается во время вскрытия может предоставить полезную ткани для элементов управления. После монтажа флуоресцентного окрашивания сохраняется в течение нескольких дней до тех пор, слайды хранили при 4 ° C в темноте. Изображений по epifluorescent микроскопии улучшается за счет использования apotome, что снимает не в фокусе света. Кроме того, конфокальной микроскопии обеспечивает точное соты изображений (фиг. 3 и 4).
Этот способ имеет много возможных применений. Он может быть применен к мышей, у которых ключевые гены, которые регулируют ангиогенез истощаются, в том числе работы, которые использует индуцибельным CRE-LoxP генетики 8-10. Альтернативно ангиогенеза сетчатки может бытьопрошенных следующих лекарств поставляется либо системно, либо внутри-глазное исследовать их про-или антиангиогенную эффекты 11. Кроме того, можно воспользоваться трансгенных инструментов и использовать GFP или RFP трансгенных мышей, чтобы визуализировать ключевые элементы сосудистой сети сетчатки 11,12. (Обратите внимание, что фиксация с использованием 4% PFA в PBS в течение 1 часа при комнатной температуре используется вместо метанола для шага 2,12 протокола до визуализации эндогенный GFP или RFP в сетчатке от трансгенных мышей.) Кроме того, в целях изучения молекулярных сигналов Механизмы, это полезно для визуализации мРНК экспрессии специфических генов в сетчатке сплетение использованием в гибридизация 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Wellcome Trust и Британского фонда сердца.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Plastic pipettes 3 ml | Scientific Laboratory Supplies | PIP4210 | Remove tip with scissors to create a wide bore |
| BD Falcon 24-well plates | Scientific Laboratory Supplies | 353226 | |
| Select Petri dishes TV 90 mm | Scientific Laboratory Supplies | SLS2002 | |
| Histobond slides | VWR | 631-0624 | |
| Coverslips 22 x 22 mm | VWR | 631-1336 | |
| Dumont Tweezers #5 | World precision instruments | 14095 | |
| Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades | World precision instruments | 501235 | Used for enucleation |
| Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips | World precision instruments | 500086 | Used for dissecting retina |
| Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips | World precision instruments | 501778 | Used for dissecting retina |
| crystal clear’ tubes 2 ml | Starlab | E1420-2000 | |
| Reagents | |||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | PBS reagent |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | PBS reagent |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | PBS reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Make up in 2x PBS and store at -20 °C |
| BSA | Sigma | A7638 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey serum | Sigma | D9663 | |
| Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Prolong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36930 | Mounting reagent |
| Isolectin GS-IB4-alexa 594 | Invitrogen | I21413 | Use at 1:200 dilution |
| Isolectin GS-IB4-alexa 488 | Invitrogen | I21411 | Use at 1:200 dilution |
| Primary Antibodies | |||
| Anti-NG2 (rabbit polyclonal ) | Millipore | AB5320 | Detects pericytes |
| Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal) | Millipore | MAB360 | Detects astrocytes |
| Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal) | Millipore | 04-585 | Detects pericytes |
| Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal ) | Chemicon | AB756P | Detects vascular basement membrane |
| Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal) | Sigma | C6198 | Detects vascular smooth muscle cells. |
| Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 550546 | Detects endothelial cells |
| Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 553370 | Detects endothelial cells |
| Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 550548 | Detects endothelial cell junctions |
| Anti-Alk1 (goat polyclonal) | R&D Systems | AF770 | Detects endothelial cells |
| Secondary Antibodies | |||
| Goat anti-rabbit-Alexa594 | Invitrogen | A11012 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Goat anti-rat-Alexa488 | Invitrogen | A11006 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Goat anti-rat-Alexa594 | Invitrogen | A11007 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Goat anti-mouse-Alexa488 | Invitrogen | A11029 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Donkey anti-goat-Alexa594 | Invitrogen | A11058 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Microscopes | |||
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Camera | Zeiss | Axiocam HRc | Camera for dissection microscope |
| Epifluorescent Microscope | Zeiss | Axioimager with Apotome | |
| Camera | Zeiss | Axiocam HRm | Camera for Axioimager |
| Confocal Microscope | Nikon | A1R | |
References
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).
- Staton, C. A., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int J. Exp. Pathol. 85 (5), 233-248 (2004).
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74 (2-3), 172-183 (2007).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).
- Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat. Protoc. 5 (10), 1659-1665 (1038).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping. J. Vis. Exp. (57), e3184 (2011).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat. Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Allinson, K. R., Lee, H. S., Fruttiger, M., McCarty, J., Arthur, H. M. Endothelial expression of TGFbeta type II receptor is required to maintain vascular integrity during postnatal development of the central nervous system. PLoS One. 7 (9), e39336 (2012).
- Mahmoud, M., et al. Pathogenesis of arteriovenous malformations in the absence of endoglin. Circ. Res. 106 (8), 1425-1433 (2010).
- Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nat. Med. 16 (4), 420-428 (2010).
- Pi, L., et al. Role of connective tissue growth factor in the retinal vasculature during development and ischemia. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (12), 8701-8710 (2011).
- Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nat. Protoc. 7 (6), 1086-1096 (2012).
