Summary
Parabiotic הצטרפותו של שני אורגניזמים מוביל להתפתחותה של מערכת דם משותפת. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הצעדים כירורגית כדי ליצור חיבור בין parabiotic עכבר wild-type ועכבר-GFP-לבטא מכונן.
Abstract
Parabiosis הוא איחוד כירורגית של שני אורגניזמים המאפשרים שיתוף של זרימת הדם. מצרף את העור של שתי חיות מקדם היווצרות של נימי דם באתר של דלקת. שותפי Parabiotic לשתף אנטיגנים במחזור שלהם ולכן הם חופשיים של תגובה חיסונית שלילית. תואר לראשונה על ידי פול ברט בשנת 1864 1, ניתוח parabiosis היה מעודן על ידי Bunster ומאייר ב -1933 כדי לשפר את ההישרדות של בעלי החיים 2. בפרוטוקול הנוכחי, שני עכברים בניתוח הצטרפו הבא שינוי של Bunster והטכניקה מאייר. בעלי חיים מחוברים באמצעות מפרקי המרפק והברך ואחרי חיבור של העור ומאפשר תמיכה איתנה המונעת עומס על העור נתפר. בזאת, אנו מתארים בפירוט את parabiotic הצטרפותו של ה-GFP בכל מקום להביע את העכבר לסוג בר עכבר (WT). שבועיים לאחר ההליך, הזוג מופרד וניתן לאתר תאי GFP החיוביים על ידי ניתוח התזרים cytometric בcirculat הדםיון של עכבר WT. Chimerism הדם מאפשר לבחון את תרומתם של התאים במחזור מחיה אחת בשנייה.
Introduction
Parabiosis, כירורגית הצטרפותו של שני אורגניזמים, תואר לראשונה בשנת 1864 ידי פול ברט כדרך לפתח מודל ללמוד מערכות מחזור הדם משותפות וכללה את הצטרפותו של העור וקירות שריריים של שתי חולדות 1. Parabiosis מקדם היווצרות של נימי דם באתר של דלקת 3 ויש לו כמה יישומים במחקרים פיסיולוגיים, כגון תקשורת הורמונלית בין בלוטת יותרת המוח ובלוטות המין, כמו גם את תפקידו של כליות יתר לחץ דם 4. זה כבר מועסק נוסף כדי לחקור את הגיוס ושילוב של תאי אב בneovascularization 5, הגירה של תאי גזע hematopoietic 6, וסחר הלימפוציטים 7, כמו גם את התפקיד וקינטיקה של מחזורי תאים דלקתיים או תאי גזע בגרורות סרטניים 8,9, ומחלות ניווניות 10.
יתרון משמעותי אחד משקרי parabiosisשבחי השותפות לשתף אנטיגנים במחזור משותפים, המאפשרים נדידת תאים וneovascularization בלי לעורר תגובה חיסונית. חשוב לציין, וייסמן ואח'. הראו parabiosis שבין עכברי זכרים ונקבה אינו מביא להיווצרות של ח.י. אנטי נוגדני 11.
בפרוטוקול המקורי שתואר על ידי פול ברט שני בעלי החיים חוברו יחדיו באמצעות חיבור של העור ושרירים קירות 1. שיטה זו לעומת זאת, גרמה למתח משמעותי לבעלי החיים וגרמה לתמותה גבוהה עקב זיהום של הפצע. מאז טכניקת parabiosis תוקן על ידי מספר קבוצות עם השולט ביותר להיות הפרוטוקול שהוצע על ידי Bunster ומאייר ב -1933 2. השיטה שלהם כללה הצטרפות של מפרקי עצם השכם, חללים בגוף, ועור, ומאפשר תמיכה טובה יותר ופחות כאב לבעלי החיים. במקביל, השיטה החדשה הביאה לטיפול שלאחר ניתוח מינימאלי ומובהקcantly ירידה בשיעורי תמותה. הפרוטוקול המתואר כאן הוא שינוי של טכניקת Bunster והמאיירת שהיא פחות פולשני ומאפשרת הצטרפות מוצקה יותר. כלומר, מחוברים עכברים דרך מפרקי מרפק והברך, כמו גם את העור. הרחבה זו מצטרפת מונעת מהעור ולכן גורמת פחות כאבים וסיבוכים. כאן אנו מתארים את הצטרפותו של סוג בר עכבר בוגר (ט ') לGFP מכונן המבטא עכבר. אנו מראים כי שבועיים לאחר ניתוח אנחנו יכולים להשיג 50% מchimerism הדם הממחישים את היעילות של פרוצדורה כירורגית זו כדי ליצור מערכת דם משותפת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל המחקרים בבעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות של ועדת הטיפול בבעלי החיים ושימוש של UCLA והמכונים הלאומיים לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה. משך הזמן של ההליך המתואר להלן הוא כ 45-60 דקות מהתחלה ועד הסוף.
1. הכנה של שדה כירורגי
- לבצע הליך בחדר ניתוח של בעלי החיים נקי.
- ציוד: מאדה isoflurane, Gaymer T משאבה עם כרית חימום.
- כלים סטריליים: שני מלקחיים מעוקלים, מספריים בסדר, בעל מחט.
- כפפות סטריליות יש להשתמש במהלך ההליך כולו.
2. הכנת בעלי חיים
- הנח שני עכברי זכר או נקבה, מאותו הרקע גנטי, של משקל וגודל דומים באותו הכלוב ולפקח לשבועות לפחות, כדי להבטיח חיים משותפים והרמוניים. נקבות עכברים הם העדיפו בשל ההתנהגות פחות האגרסיבית שלהם.
- להרדים בעלי חיים על ידיבאמצעות אידוי isoflurane. מקום עכברים בPOSI-חותם אינדוקציה הלשכה מחוברים לאידוי isoflurane (4-5% V / V). לאחר ההרדמה מושרה, להעביר את בעלי החיים לאזור גילוח הפרווה ולשמור על ההרדמה בכל ההליך באמצעות חרטומו מחובר לisoflurane (1.5-2% V / V). החל משחת עיניים עם Q-טיפ כדי למנוע יובש בעיניים.
- מניחים את החיה במצב שכיבה. יסודיות לגלח את צד השמאל של העכבר ממוקם בצד השמאל וצד ימין של העכבר ממוקם בצד הימין מתחיל בכ 1 סנטימטר מעל המרפק עד 1 סנטימטר מתחת לברך.
- סביבה נקיה מחיידקים להכין את האזורים המגולחים ידי ניגוב יסודי (2-3x) עם מגבונים ספוגים פולידין ואחרי מגבוני אלכוהול. מניחים את העכברים על משטח מחומם המכוסה במשטח סטרילי.
- לשיכוך כאבים, לנהל Carprofen ועצירות intraperitoneally או תת עורית במינון של 10 מ"ג / קילוגרם ו0.1 מ"ג / קילוגרם בהתאמה.
- הנח בעלי חיים בצד שלהם, גב אל גב, עםdjacent אזורים מגולחים פונים כלפי מעלה. כדי להימנע מכל זיהום של אזור הניתוח, לכסות את העכברים עם וילון סטרילי חושף רק את אזור הניתוח. ליצור פתח וילון קטן להישאר סטרילי בעת ביצוע הניתוח. אנחנו עשינו את חלון הווילון גדול שתהיינה לי צפייה טובה יותר בצילום וידאו.
3. Parabiosis
- באמצעות מספריים חדים, לבצע חתכים בעור אורך לצדדים המגולחים של כל התחלה של בעלי חיים ב0.5 סנטימטר מעל המרפק כל הדרך ל0.5 סנטימטר מתחת למפרק הברך (איור 1). בעקבות החתך, בעדינות לנתק את העור מfascia תת עורית על ידי מחזיק את העור עם זוג מלקחיים מעוקלים ולהפריד את fascia עם זוג שני כדי ליצור 0.5 סנטימטר של עור בחינם. לבצע הפרדה זו לכל אורך החתך.
- בגין הצטרפותו על ידי הצמדת olecranon השמאלית של חיה אחת לolecranon זכותו של האחר. olecranons ומפרקי הברך שניהם בצורה ברורה ה הבאה להבחיןחתך בעור דואר. כדי להקל על הצטרפותו, לכופף את המרפק של העכבר הראשון ולהעביר את המחט של 3-0 התפר שאינו נספג מתחת olecranon. בדומה לכך, לכופף את המרפק של העכבר השני ולהעביר את אותו התפר מתחתיה. צרף מפרקים בחוזקה על ידי קשר כפול כירורגית.
- חבר את מפרקי הברך בעקבות אותו ההליך.
- בעקבות החיבור של המפרקים, לחבר את העור של שתי חיות עם תפר נספג רציף 5-0 Vicryl מתחיל ventrally מהמרפק לכיוון הברך. כדי למנוע קרע בעור והפרדה לבצע סגירת תפר הדוקה של העור באזור שסביב המרפקים והברכיים האזור. ברגע שהקובץ מצורף עור הגחון הושלם, לבצע קשר כפול כירורגית. מקם את העכברים במצב המועדים ולהמשיך dorsally התפר שהסתיימה עם קשר כפול כירורגית. בדוק את ההמשכיות של התפר ולאשר את חוסר פתחים.
- לנהל 0.5 מיליליטר של .0.9% NaCl תת עורי לכל עכבר כדי למנוע dehydration.
4. החלמה לאחר ניתוח
- לשמור על חיות על משטח מחומם עד להחלמה.
- בעקבות התאוששות, לספק carprofen משככי כאבים ועצירות. חזור intraperitoneally או תת עורי כל שעה 24 ו12, בהתאמה, עבור 48 שעות באותו המינון שתואר לעיל (שלב 2.5). לפקח על בעלי חיים לסימנים של כאב ומצוקה, כגון טלטול, עייפות, לעיסה של זנב, קימר את גבה, חוסר הטיפוח, וכו 'ביום למשך שבועיים.
- Prophylactically, טיפול בעכברים עם השעיה אוראלית sulfamethoxazole / Trimethoprim בבקבוק המים שלהם 2 מ"ג סולפה / מיליליטר +0.4 מ"ג לקצץ מיליליטר / ל10 ימים כדי למנוע זיהומים חיידקיים.
- בית כל זוג parabiotic בכלוב נקי עם חומר מונוליטי מצעים (מגבת נייר למשל או משטח סטרילי סופג) כדי למנוע שאיפה של חומר מצעים. להחזיר את בעלי החיים לכלוב מצעים מלאים כאשר הם מסוגלים לשמור על עינת חזה עם הראש שלהם למעלה. כדי למזער את המתחלהגיע למזון, תוך התאמה לקיום parabiotic, הנח את כדורי מזון הרטיב על רצפת הכלוב. לספק חומר קינון. ב1-2 שבועות יש עכברים parabiotic יכולת ambulate בדרך כלל על קדמיים ואחורי-גפיים לזווג בניתוח.
- chimerism הדם מתרחש 10-14 ימים שלאחר הניתוח.
5. אישור והליך הפוך
- אחרי שבועיים להקיז דם מורידי הזנב של כל עכבר לניתוח הזרימה cytometric כדי לאשר chimerism דם (איור 3).
- עיבוד דם לצורך ניתוח התזרים cytometric: לדלל 2-3 טיפות של דם ב500 μl של 10 mM EDTA. הוסף 500 μl של דקסטראן 2% (בדילול מלא PBS), ומערבב היטב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. מעביר את supernatant בצינור חדש, ספין על 1,200 סל"ד במשך 5 דקות ו resuspend תאי pelleted ב PBS (או חיץ אחר) לניתוח התזרים cytometric.
- בהתאם לתכנון ניסוי, ניתן להפריד את זוג parabiotict נקודות זמן מאוחר יותר. מניסיוננו, יש לנו לשמור זוגות parabiosed לתקופה של עד 9 חודשים ללא כל סיבוכים.
- לבצע הליך הפוך על משטח כירורגי סטרילי. הרדימי עכברים ידי הצבת אותם בחדר אינדוקציה המחובר לאידוי isoflurane (4-5%) ולשמור על הרדמה עם isoflurane 1.5-2%, כפי שתואר לעיל (שלב 2.2).
- להסיר שיער מהאזור המקיף את התפר הראשוני וסביבה נקיה מחיידקים להכין את האזורים המגולחים כפי שתואר לעיל (שלבים 2.3, 2.4).
- לשיכוך כאבים, לנהל Carprofen ועצירות intraperitoneally או תת עורית במינון של 10 מ"ג / קילוגרם ו0.1 מ"ג / קילוגרם, בהתאמה.
- כסה אזור ניתוח עם וילון סטרילי כפי שתואר לעיל (שלב 2.6).
- בעזרת מספריים חדים, להפריד את העכברים דרך חתך אורכים עם התפר לרוחב ועדינות לנתק את fascia שהוקם בין שני העכברים עם זוג מלקחיים מעוקלים. כדי להפריד את המפרקים, לחתוך את קשרים של התפרהקושר אותם. חתוך את העור לאורך החתך כדי להשיג קצוות חלקים ולצרף עור עם תפר נספג רציף 5-0 מצופה Vicryl.
- על מנת למנוע התייבשות, לנהל 0.5 מיליליטר של .0.9% מתחת לעור NaCl לכל עכבר. לשמור על חיות על משטח מחומם עד להחלמה.
- לאחר התאוששות, חוזר ממשל משכך כאבים, כל (0.1 מ"ג / קילוגרם) 24 שעות ועצירות carprofen (10 מ"ג / קילוגרם) בכל שעות 12 ל48 שעות.
- כדי למנוע זיהומים חיידקיים טיפול בעכברים עם ההשעיה sulfamethoxazole / Trimethoprim אוראלי (2 סולפה מ"ג / מיליליטר +0.4 מ"ג לקצץ / מיליליטר) בבקבוק המים שלהם ל10 ימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאה הצפויה של parabiosis של שני אורגניזמים היא התרומה שווה של מערכת הדם של כל חיה לזרימת דם נפוצה (איור 2). אפשר בקלות לאמת את האיזון המוצלח של דמם של העכברים החיוביים parabiosed WT וה-GFP על ידי ניתוח התזרים cytometric. הנה, דם ורידים הושג מהזנבות של שני parabionts ב2 שבועות לאחר הניתוח והיה מופרד לתאי דם היקפיים (להוציא אריתרוציטים). שבריר התא שמקורם hematopoietic המופרד נותח לאחר מכן על ידי cytometry זרימה לנוכחות של תאי GFP החיובי וWT. עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים, דם מעכבר WT גילה נוכחות של chimerism, כפי שצוין על ידי תאי ה-GFP כמחצית חיוביים ומחצית WT דם (תאי WT 53% ותאי ה-GFP 47%) (איור 3).
איור 1. Parabioניתוח sis:. אתר חתך הצדדים לרוחב של חיות הרדימו מגולחים וחתכים בעור אורך מבוצעים (אזור פנק) מ0.5 סנטימטר מעל המרפק ל0.5 סנטימטר מתחת למפרק הברך.
איור 2. ייצוג סכמטי של שיטת parabiosis.) הצטרפותו של עכבר WT (משמאל) לעכבר ה-GFP חיובי (מימין). ב ') כשבועות לאחר התקשרות כירורגית, נימי דם חדשים נוצר במיקום שבו שני העכברים מחוברים מאפשרים הצטרפות של זרימת הדם.
איור 3. chimerism הדם של שותפי parabiotic. ניתוח תזרים cytometric של דגימת דם שנאסף משותף parabiotic WT שבועיים הבא מצטרף כירורגית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת parabiosis דנה כאן מציגה קשיים מינימאליים טכניים ותוצאות בשיעורי תמותה נמוכות. הקובץ המצורף של מפרקי הברך ומרפק הוא שיפור משמעותי של Bunster והטכניקה מאייר. עם זאת, ההליך נותר פולשני ובכך שמירה על תנאים סטריליים לאורך כל הניתוח היא הכרחית. כדי למנוע זיהום של האתר כירורגית נוסף, חשוב שבעלי החיים parabiosed יקבלו שילוב של אנטיביוטיקה ולעקוב באופן קבוע. כדי להבטיח את תמיכת משרד ולמנוע כאב, את התפר שמחבר את המרפקים וברכיים צריך להקיף את המפרקים ולא עובר דרך הרקמות.
כחלופה לשאיפת isoflurane, הרדמה עלולה להיגרם עם השימוש בזריקת intraperitoneal של קטמין / xylazine או סמים הרדמה אחרים שאושרו על ידי ועדות מוסדיות. היתרון של שימוש isoflurane הוא שזה במהירות יכול לגרום להרדמה ולהפחית באופן משמעותי recovery זמן. יתר על כן, ברמה של הרדמה ניתן לשלוט באופן מדויק.
Parabiosis, המאפשר למערכות דם משני בעלי חיים כדי להתמזג ולאזן, הוא הליך ניסיוני רב עוצמה למחקרים פיסיולוגיים. הוא מציג מספר יתרונות טכניקות נפוצות אחרות, כגון השתלת מח עצם או הזרקת תא. נהלי משלוח תא, לעתים, לספק חלון קצר כדי לבחון את ההשפעה של תאים מושתלים. בנוסף, החיסון מגביר את הסיכון לזיהום ותחלואה ותמותה שלאחר מכן. עם זאת, עם parabiosis אחד לא יכול לשמור על זרימת chimeric לתקופות ארוכות של זמן ומחקר במחזור גורמים (תאים, ציטוקינים, וכו ') ללא תלות במוצאם. מערכת זו יכולה לשמש כדי לקבוע את התפקיד של מחזורי תאים בריפוי פצעים, היווצרות גידול, הזדקנות, התחדשות, ותגובה דלקתית, בין רבים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לAdriane מוזלי וLibuse ג'רבק (סטנפורד) לקבלת סיוע בטכניקה הניתוחית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane-Phoenix | Clipper | NDC 57319-559-06 | |
| Posi-Seal Induction Chamber | Molecular Imaging Products | AS-01-0530-SM | |
| Portable Anesthesia System | Molecular Imaging Products | AS-01-0007 | |
| Gaymer T Pump | Gaymar Industries, Inc | TP650 | |
| Warming Blanket (Heating pad) | Kent Scientific Corp | TP-22G | |
| Curved forceps | Roboz | RS-5101 | |
| Scissors | Fine Science Tools (FST) | FST 14063-09 | |
| Needle holder | FST | FST 12501-13 | |
| Electrical shaver | Oster | Golden A5 |
References
- Bert, P. Expériences et considérations sur la greffe animale. Journal de l'Anatomie et de la Physiologie. 1, 69-87 Forthcoming.
- Bunster, E., Meyer, R. K. Improved methods of parabiosis. Anat. Rec. 57, 339-380 (1933).
- Waskow, C. Generation of parabiotic mice for the study of DC and DC precursor circulation. Methods Mol. Biol. 595, 413-428 (2010).
- Finerty, J. C. Parabiosis in physiological studies. Physiol. Rev. 32, 277-302 (1952).
- Aicher, A., Heeschen, C. Nonbone marrow-derived endothelial progenitor cells: what is their exact location. Circ. Res. 101, e102 (2007).
- Abe, S., Boyer, C., et al. Cells derived from the circulation contribute to the repair of lung injury. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 170, 1158-1163 (2004).
- Donskoy, E., Goldschneider, I. Thymocytopoiesis is maintained by blood-borne precursors throughout postnatal life. A study in parabiotic mice. J. Immunol. 148, 1604-1612 (1992).
- Powell, A. E., Anderson, E. C., et al. Fusion between Intestinal epithelial cells and macrophages in a cancer context results in nuclear reprogramming. Cancer Res. 71, 1497-1505 (2011).
- Duyverman, A. M., Kohno, M., et al. A transient parabiosis skin transplantation model in mice. Nat. Protoc. 7, 763-770 (2012).
- Ajami, B., Bennett, J. L., et al. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat. Neurosci. 10, 1538-1543 (2007).
- Weissman, I. L., Jerabek, L., et al. Tolerance and the H-Y antigen: Requirement for male T cells, but not B cells, to induce tolerance in neonatal female mice. Transplantation. 37, 3-6 (1984).
