Summary
2つの生物の結合並体結合は、共有循環系の開発につながる。このプロトコルでは、野生型マウスと恒常的GFP発現マウスとの間の並体結合接続を形成するための手術ステップを記載している。
Abstract
並体結合は、血液循環の共有を可能にする2つの生物の外科的和集合である。 2動物の皮膚を取り付けることは、炎症部位での微小血管の形成を促進する。並体結合パートナーは、循環抗原を共有するため、有害な免疫反応の自由である。まず1864年1でポール·バートによって記述、並体結合手術は動物の生存2を改善するために1933年にBunsterとマイヤーによって精製した。現在のプロトコルでは、2匹のマウスを外科Bunsterとマイヤー法の改良法以下の接合されている。動物は縫合し、皮膚に負担を防ぐ強固なサポートを可能にする皮膚の取り付けに続いて、肘と膝関節を介して接続されている。ここで、我々は詳細に野生型（WT）マウスにマウスを表現するユビキタスGFPの合流並体結合を記述します。血液循環液の循環に二週間処置後、ペアを分離し、GFP陽性細胞をフローサイトメトリー分析によって検出することができるWTマウスのイオン。血液キメラ現象は、一方が他方にある1動物からの循環細胞の寄与を調べることができます。
Introduction
並体結合、2生物の外科的接合は、最初に共有循環系を研究するためのモデルを開発するための方法として、ポール·バートによって1864に記載され、2匹のラット1の皮膚や筋肉の壁の接合で構成された。並体結合は、炎症3部位での微小血管の形成を促進し、このような下垂体および生殖腺だけでなく、高血圧4における腎臓の役割の間のホルモン通信などの生理学的研究にはいくつかのアプリケーションを、持っていた。さらに、血管新生5、造血幹細胞6の移動、およびリンパ球輸送7、ならびに腫瘍転移8,9における炎症性または幹細胞を循環させる役割と動態に前駆細胞の動員および組込みを調べるために使用されているおよび神経変性疾患10。
並体結合の嘘の一つの重要な利点その中で提携した動物は、免疫学的反応を誘発することなく、細胞移動および血管新生を可能にする一般的な循環抗原を共有しています。重要なことには、ワイズマンらは、雄と雌のマウス間の並体結合は、抗HY抗体11の形成をもたらさない示した。
ポール·バートによって記述、元のプロトコルでは、2匹の動物は、皮膚と筋肉の壁1の接続を介して接合した。しかしながら、この方法は、動物に重大な歪みを引き起こし、傷口の感染による高い死亡率となった。それ以来、並体結合技術が最も優勢が1933 2でBunsterとマイヤーによって提案されたプロトコルであることをいくつかのグループにより改訂されました。彼らの方法は、動物のためのより良いサポートが少なく、痛みを許可する、肩甲骨の関節、体腔と皮膚の接合含まれています。同時に、新しい方法は、最小限の術後ケアとsignifiの結果cantlyは死亡率を減少させた。本明細書に記載されたプロトコルは、低侵襲性であり、強固な接合が可能とBunsterマイヤー法の改良法である。すなわち、マウスは肘と膝関節、並びに皮膚を介して接続されている。したがって、これは皮膚のを防止拡張子を結合し、痛みが少なく、合併症を引き起こす。ここでは、マウスを表現する構成的GFPに野生型（WT）成体マウスの接合について説明します。私たちは、手術後2週間は、我々が共有循環系を作成するために、この外科処置の有効性を実証する血液キメラの50％を達成できることを示している。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべての動物実験は、実験動物の管理と使用に関するUCLAの動物管理使用委員会のガイドラインと健康ガイドの国立研究所に従って行った。以下の手順の持続時間は、最初から最後まで約45〜60分である。
1。手術野の調製
- きれいな動物の手術室での手順を実行します。
- 設備：イソフルラン気化、加熱パッド付きGaymer Tポンプ。
- 無菌ツール：2湾曲したピンセット、細いハサミ、針ホルダ。
- 滅菌手袋は全体の手順の間に使用されなければならない。
2。動物の作製
- 同じケージに同じ遺伝的背景から、同じような重さと大きさで、2雄または雌のマウスを配置し、調和のとれた共存を保証するために、少なくとも2週間を監視。雌マウスは、それらのより少なく積極的な行動のために好ましい。
- することにより、動物を麻酔イソフルラン気化器を使用する。ポジ·シール誘導チャンバ内でマウスをイソフルラン気化器（4-5％のV / V）に接続されている。麻酔が誘発されると、毛皮のシェービングエリアに動物を転送し、イソフルラン（1.5から2パーセントのV / V）に接続されているノーズコーンを通して作業中は麻酔を維持。ドライアイを防ぐために、Q-ティップで眼軟膏を適用します。
- 仰臥位で動物を置きます。完全に右が少なくとも約1cmの1センチメートル膝下肘の上に載置された出発マウスの左右側に配置されたマウスの左側を剃る。
- 無菌的に徹底的にアルコール綿続いベタジンに浸したワイプで（2〜3倍）を拭いて剃毛エリアを用意。無菌パッドでカバー加熱パッドの上にマウスを置きます。
- 鎮痛のため、それぞれ10 mg / kgの0.1ミリグラム/ kgの用量で腹腔内または皮下にカルプロフェンおよびブプレノルフィンを管理します。
- で、背中合わせに、彼らの側に動物を配置上に向け剃毛分野をdjacent。手術領域の汚染を避けるため、操作領域を露出無菌ドレープでマウスを覆う。手術を行う際に、滅菌滞在する小さなドレープ開口部を作成します。私たちは、ビデオ撮影時に見やすくを持つようにドレープウィンドウを大きく。
3。並体結合
- 鋭いはさみを使用して、肘0.5cm上で膝関節下の0.5センチメートル（ 図1）へのすべての道を開始し、各動物の剃毛側面に縦方向の皮膚切開を行う。切開後、緩やかに湾曲鉗子で皮膚をかざして、皮下筋膜から皮膚をデタッチし、自由な皮膚の0.5cmに作成するために二対の筋膜を分離する。全体の切開に沿って、この分離を行う。
- 他の右肘に1動物の左肘を取り付けることにより、接合を開始します。 olecranonsと膝関節の両方が目以下のはっきりと区別することができるEの皮膚切開。入社を容易にするために、最初のマウスの肘を曲げ肘頭下の非吸収性3-0縫合糸の針を渡します。同様に、第二のマウスの肘を曲げ、その下に、同じ縫合糸を通す。ダブル外科結びでしっかりとジョイントを取り付けます。
- 同様の手順で膝関節を接続します。
- ジョイントの取り付けに続いて、ひざに向かって肘から腹始まる連続吸収5-0ビクリル縫合糸により2動物の皮膚に接続します。皮膚の破裂や剥離を防止する肘と膝の周りの領域における皮膚のタイトな縫合閉鎖を行う。腹側皮膚添付ファイルが完了すると、二重の手術結び目を実行します。腹臥位にマウスを置いて、二重の外科結びで終わる縫合背を続ける。縫合糸の連続性を確認して、開口部がないことを確認する。
- dehyを防ぐために、各マウスの皮下に0.9％NaClを0.5ミリリットルの管理dration。
4。術後の回復
- 回復するまで加熱されたパッドの上に動物を保管してください。
- 回復後、鎮痛剤のカルプロフェンとブプレノルフィンを提供しています。 （ステップ2.5）は、上記と同じ投与量で48時間、それぞれ、腹腔内または皮下に、24および12時間後に繰り返します。このような揺れなどの痛みや苦痛の徴候のために動物を監視し、尾の無気力、咀嚼は、 などグルーミングの欠如は、2週間毎日、バックアーチ。
- 予防的に、細菌感染を防ぐために、10日間ミリリットル/トリムミリグラム2mgのサルファ剤/ mlの0.4彼らのウォーターボトルにスルファメトキサゾール/トリメトプリム経口懸濁液をマウスに扱う。
- 家の寝具材料の吸引を防ぐために、モノリシックの寝具材料（ 例えば 、紙タオルや吸収性の滅菌パッド）できれいにケージの各並体結合ペア。彼らは彼らの頭部を上にして胸骨横臥位を維持することができるとき、寝具いっぱいケージに動物を返します。歪みを最小限に抑えるために、並体結合の存在に調整しながら食品に手を伸ばすの、ケージの床に湿らせた食物ペレットを配置します。ネスティング材料を提供する。 1〜2週間で並体結合マウスは、外科的に対になっ前後と後肢で正常に歩き回るする能力を持っている。
- 血液キメラ現象は、手術後10〜14日に行われます。
5。確認と逆の手順
- 2週間の血液キメラ現象（ 図3）を確認するために、フローサイトメトリー分析のために各マウスの尾静脈から血液を引き出す後
- フローサイトメトリー分析のための血液処理：10 mMのEDTAを500μlの血液を2〜3滴を希釈。 （PBSで希釈）の2％デキストランの500μl加え、完全に混合し、30分間37℃でインキュベートする。 、新しいチューブに上清を移し、5分間1,200 rpmでスピンし、フローサイトメトリー解析のために、PBS中のペレット化した細胞（または他のバッファ）懸濁します。
- 実験設計に応じて、並体結合対は分離することができる後の時点でトン。我々の経験では、合併症のない最長9ヶ月間parabiosedペアを維持している。
- 無菌外科表面に逆の手順を実行します。イソフルラン気化器（4-5％）に接続された導入室に配置することによってマウスを麻酔し（ステップ2.2）上記のように1.5〜2％イソフルランで麻酔を維持する。
- （2.3、2.4ステップ）初期縫合糸を周囲から髪を削除して、無菌的に上記のように剃らエリアを用意。
- 鎮痛のために、それぞれ、10 mg / kgの0.1ミリグラム/ kgの用量で腹腔内または皮下カルプロフェン及びブプレノルフィンを投与する。
- （ステップ2.6）、上記のように、滅菌ドレープと手術領域をカバーしています。
- 鋭いハサミを使用して、横方向の縫合糸に沿って縦切開を通してマウスを分離し、緩やかに湾曲鉗子のペアで2マウスとの間、新たに形成された筋膜を切り離す。関節を分離するために、縫合糸の結び目をカットそれらを接続する。滑らかなエッジを実現し、吸収性、連続5-0コーティングされたビクリル縫合糸で皮膚を再接続するために切開に沿って皮を切り落とす。
- 脱水症を防ぐために、各マウスに0.9％のNaCl、皮下0.5mlのを投与。回復するまで加熱されたパッドの上に動物を保管してください。
- 回復後、鎮痛剤を投与することを繰り返して、カルプロフェン（10 mg / kg）を24時間毎とブプレノルフィン（0.1 mg / kg）を48時間ごとに12時間。
- 細菌感染を防止するために10日間、彼らのウォーターボトルに（2mgのサルファ剤/ mlの0.4 mg / mlのトリム）スルファメトキサゾール/トリメトプリム経口懸濁液をマウスに扱う。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
2の生物の並体結合の予想結果は、一般的な血液循環（ 図2）に、それぞれの動物の循環系の等しい貢献である。一つは、簡単にフローサイトメトリー分析によってparabiosed WT及びGFP陽性マウスの血液の正常な平衡を確認することができます。ここでは、静脈血を、手術後2週間目に両方parabiontsの尾から得られ、（赤血球を除くために）、末梢血細胞を分画した。分画された造血由来細胞画分は、その後、GFP陽性およびWT細胞の存在についてフローサイトメトリーによって分析した。約半分GFP陽性半WT血液細胞（53％のWT細胞および47％のGFP細胞）（ 図3）によって示されるように、以前の研究と一致して、WTマウスからの血液は、キメラ現象の存在を明らかにした。
図1。 Parabiosisの手術：切開部位麻酔した動物の側面を剃毛され、長手方向の皮膚切開は、膝関節0.5以下cmの肘0.5cm上から（破線の引き出し領域）が行われる。
図2。並体結合方式の模式図。A）GFP陽性マウス（右）。B）外科アタッチメント後約2週間、新たな微小血管系が2マウスが参加することができ接続されている位置に形成されている重量のマウス（左）の接合血液循環の。
図3。並体結合パートナーの血液キメリズムは 、WT並体結合パートナーに参加外科に続く2週間から採取した血液サンプルのフローサイトメトリー分析。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここで説明並体結合の方法は、低死亡率の最低限の技術的な問題と結果を示す。膝や肘の関節の取り付けはBunsterとマイヤー技術の大幅な改善である。しかし、手順はこのように、手術を通して無菌状態の維持が不可欠である侵襲性のままになります。さらに、手術部位の感染を防止するためには、parabiosed動物は抗生物質の組み合わせを受信し、定期的に監視することが重要である。しっかりとサポートを確保し、痛みを防ぐために、肘と膝を結ぶ縫合糸ではなく組織を通過よりも関節を囲む必要があります。
イソフルラン吸入の代替として、麻酔をケタミン/キシラジン又は制度委員会によって承認された他の麻酔薬の腹腔内注射を用いて誘導することができる。イソフルランを使用する利点は、それが急速に麻酔を誘導し、rは著しく減らすことができるということであるecovery時間。さらに、麻酔のレベルを精密に制御することができる。
2匹の動物からの循環系が混ざり合っと平衡化することを可能にする並体結合は、生理学的研究のための強力な実験手順である。このような骨髄移植または細胞注射のような他の一般的に使用される技術にいくつかの利点を提示する。細胞送達手順は、時々、移植された細胞の効果を調べるために、短いウィンドウを提供する。また、免疫抑制は、感染およびその後の罹患率および死亡率のリスクを増大させる。しかし、並体結合と1は、その起源の独立因子（細胞、サイトカインなど ） を循環させる時間と研究の長時間キメラ循環を維持することができます。このシステムは、他の多くの中でも、創傷治癒、腫瘍形成、老化、再生、および炎症反応に循環細胞の役割を決定するために使用することができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、競合する金融利害関係はありません。
Acknowledgments
著者らは、手術法の支援のためにAdrianeモズレーとLibuse Jerabek（スタンフォード）に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane-Phoenix | Clipper | NDC 57319-559-06 | |
| Posi-Seal Induction Chamber | Molecular Imaging Products | AS-01-0530-SM | |
| Portable Anesthesia System | Molecular Imaging Products | AS-01-0007 | |
| Gaymer T Pump | Gaymar Industries, Inc | TP650 | |
| Warming Blanket (Heating pad) | Kent Scientific Corp | TP-22G | |
| Curved forceps | Roboz | RS-5101 | |
| Scissors | Fine Science Tools (FST) | FST 14063-09 | |
| Needle holder | FST | FST 12501-13 | |
| Electrical shaver | Oster | Golden A5 |
References
- Bert, P. Expériences et considérations sur la greffe animale. Journal de l'Anatomie et de la Physiologie. 1, 69-87 Forthcoming.
- Bunster, E., Meyer, R. K. Improved methods of parabiosis. Anat. Rec. 57, 339-380 (1933).
- Waskow, C. Generation of parabiotic mice for the study of DC and DC precursor circulation. Methods Mol. Biol. 595, 413-428 (2010).
- Finerty, J. C. Parabiosis in physiological studies. Physiol. Rev. 32, 277-302 (1952).
- Aicher, A., Heeschen, C. Nonbone marrow-derived endothelial progenitor cells: what is their exact location. Circ. Res. 101, e102 (2007).
- Abe, S., Boyer, C., et al. Cells derived from the circulation contribute to the repair of lung injury. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 170, 1158-1163 (2004).
- Donskoy, E., Goldschneider, I. Thymocytopoiesis is maintained by blood-borne precursors throughout postnatal life. A study in parabiotic mice. J. Immunol. 148, 1604-1612 (1992).
- Powell, A. E., Anderson, E. C., et al. Fusion between Intestinal epithelial cells and macrophages in a cancer context results in nuclear reprogramming. Cancer Res. 71, 1497-1505 (2011).
- Duyverman, A. M., Kohno, M., et al. A transient parabiosis skin transplantation model in mice. Nat. Protoc. 7, 763-770 (2012).
- Ajami, B., Bennett, J. L., et al. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat. Neurosci. 10, 1538-1543 (2007).
- Weissman, I. L., Jerabek, L., et al. Tolerance and the H-Y antigen: Requirement for male T cells, but not B cells, to induce tolerance in neonatal female mice. Transplantation. 37, 3-6 (1984).
