Summary
Anvendelsen af en model, der efterligner tilstanden af lungesygdomme hos mennesker er afgørende for at studere patofysiologi og / eller ætiologi af en bestemt sygdom, og for udvikling af terapeutisk intervention. Her en noninvasiv intratrakeal intubation metode, der kan direkte levere eksogene materialer muselunger præsenteres.
Abstract
Anvendelsen af en model, der efterligner tilstanden af lungesygdomme hos mennesker er afgørende for at studere patofysiologi og / eller ætiologi af en bestemt sygdom, og for udvikling af terapeutisk intervention. Med den øgede tilgængelighed af knockout og transgene derivater, sammen med en stor mængde af genetisk information, mus giver en af de bedste modeller til at studere de molekylære mekanismer, der ligger patologi og fysiologi lungesygdomme. Indånding, intranasal instillation, intratrakeal instillation, og intratrakeal intubation er de mest anvendte teknikker ved en række forskere til at administrere materialer af interesse for muselunger. Der er fordele og ulemper for hver teknik, afhængigt af målene for en undersøgelse. Her en noninvasiv intratrakeal intubation metode, der kan direkte levere eksogene materialer muselunger præsenteres. Denne teknik blev anvendt til at administrere bleomycin til muselunger som en model til at studere lungefibrose. </ P>
Introduction
Lung er et organ, hvor mange ødelæggende sygdomme er almindeligt diagnosticeret. Blandt dem, lungekræft er den næstmest diagnosticeret kræft hos både mænd og kvinder, og den mest almindelige årsag til kræft død. Kronisk obstruktiv lungesygdom, også kendt som emfysem og kronisk bronkitis, er en meget alvorlig sygdom, og den tredje hyppigste årsag til død i USA. I 2011 blev det anslået, at 25,9 mio amerikanere havde astma, herunder 7,1 millioner børn under 18 år. Astma er den tredje hyppigste årsag til hospitalsindlæggelse blandt børn under 15 år (American Lung Association, http://www.lung.org ). For at studere patofysiologien og / eller ætiologi af disse ødelæggende sygdomme og deres underliggende mekanismer, anvendelse af nøjagtige modeller er kritisk i forbindelse med praktisk og ikke-invasiv administration af forskellige materialer af interesse for lungen. Mus giver en af de bedste modeller tilstudere de molekylære mekanismer, der ligger patologi og fysiologi lungesygdomme på grund af den øgede tilgængelighed af knockout og transgene mus og et stort mængden af tilgængelig genetisk information.
Forskellige metoder er blevet brugt af en række af efterforskere i forskellige indstillinger for at levere materiale af interesse for muselunger, herunder indånding, intranasal instillation, intratrakeal instillation, og intratrakeal intubation 1-4. Sidstnævnte procedure er ikke blevet rutinemæssigt anvendes, fordi det anses temmelig vanskeligt at udføre. Intratracheal intubation beskrevet heri er en ikke-invasiv, enkel og hurtig metode til at levere materialer af interesse for muselunger med henblik på at undersøge virkningen af de leverede materialer på genekspression mønstre, patologi og / eller fysiologi lunge 5. Denne teknik sikrer levering af udefra kommende materiale til en hel lunge og ikke indebærer nogen overlevelse kirurgi, og dermed vil likely skal godkendes af enhver form for institutionelle dyr pleje og brug udvalg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokol beskriver en ikke-invasiv, enkel og hurtig metode til at levere materialer af interesse for muselunger. Denne procedure blev godkendt af National Cancer Institute Animal Care og brug Udvalg.
1.. Anæstesi
- Først bedøver musen under anvendelse af en blanding af ketamin og xylazin (100 mg / kg legemsvægt og 10 mg / kg legemsvægt, henholdsvis). Dette er ACUC anbefalede anæstesi og dosis. Med dette beløb, mus er bevidstløs mindste for ~ 20 min.
- Påfør dyrlæge salve til øjnene af musen for at forhindre udtørring af øjnene under bedøvelse.
- Efter flere minutter, klemmes en fod af musen til at kontrollere for bevidsthed. Når du har bekræftet bevidstløs, skal du placere musen på en intubation stativ vinklet på ~ 60 ° og holde det på plads ved at hægte sine øverste fortænder over en lille elastik placeret øverst på standeren.
2. Intratracheal Intubation
Bemærk: For at opnå den korrekte længde af kateteret, der skal indsættes, først måle længden mellem munden og bronchiale forgreningspunkt ved hjælp af en praksis mus af samme størrelse i forvejen (figur 1). Længden afhænger i høj grad af størrelsen af musen. Indsættelse af kateteret skal stoppe over forgreningen punkt (~ 1,5 cm for mus med ~ 25 g legemsvægt). Dette sikrer, at intuberet materiale vil gå til alle lapper. Mindst 50 praksis mice kan være påkrævet for en person, der udfører intubation at blive dygtige i teknikken (Kompetent betyder, at succesraten for intubation er mere end 95%).
- Når kateteret er indsat, hurtigt at fjerne fiber-lysleder fra katetret for at tillade, at dyret kan trække vejret normalt. Når Intubation Illumination System ikke anvendes direkte indsætte et kateter som beskrevet.
- Tilføj en opløsning indeholdende materialer af interesse for et kateter. Sørg for, at opløsningen suges ind i lungerne umiddelbart efter tilsætning. Halvtreds mikroliter til ~ 25 g mus legemsvægt anvendes rutinemæssigt.
3. Animal Recovery
- Så snart opløsningen suges ind i lungerne, tage ned musen fra stativet, og sæt den tilbage i den oprindelige bur.
- Overhold musen, indtil det begynder at bevæge sig.
- Når du har bekræftet, at musen er i god stand, tilbage i buret til et rack.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I første omgang blev grøn-farvet løsning, der bruges til at intubere mus til praksis. Lungerne blev reseceret umiddelbart efter intubation at undersøge, hvordan jævnt farve blev fordelt i lunge (figur 2). Denne teknik blev anvendt til at studere bleomycin-induceret lungefibrose hjælp C57BL / 6 mus. Når musene blev intratrachealt intuberet med 1,2 U / kg af bleomycin eller saltvand som kontrol og obduceres 3 uger senere udviklede musene bleomycin-induceret fibrose hele deres lunger, støttet af histologi og den øgede hydroxyprolin indhold (figur 3). Det beskadigede område blev evalueret ved brug 20X mål skabte lunge billeder og en 121-points gitter gitter. Antallet af vejkryds (points) falder over de fibrøse områder blev talt og udtrykt som den procentdel af det samlede (121) point. Procentdelen af de beskadigede områder således talt var proportional med mængden af bleomycin administreret (Figur 4).
"Jove_content" fo: keep-together.within-side = "altid"> 
Fig. 1. Illustration af muse luftrøret. De røde barer og pile angiver længden, hvor målingen skal tages før intubation ved hjælp af en praksis mus. Klik her for at se større billede .
Figur 2. Udseende lunge lige efter at være blevet intuberet med grønt farvestof. Hvis farvestoffet farve kan ses i de fleste dele af lungerne, er intubation betragtet som en succes.ad/50601/50601fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.
Fig. 3. Repræsentative billeder af fibrotiske lunger induceret ved intratrakeal intubation af bleomycin. C57BL / 6 mus blev intuberet med 1.2U/kg af bleomycin (B, D) eller saltvand som kontrol (A, C) og deres lunger histologisk blev undersøgt på dag 21 efter bleomycin administration. Forstørrelse: A, B: 40X, C, D: 100X. (E) hydroxyprolin indhold pr lunge målt på dag 21 til kontrol og bleomycin behandlede lunger. N = 6, ***:. P <0,001 Klik her for at se større billede .
Figur 4.. Forholdet mellem bleomycin dosis og beskadigede område af lungen. Øget dosis af bleomycin (0,5, 1 og 2 U / kg) proportionalt forøget procentdelen af beskadigede områder. Klik her for at se større billede .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intratrakeal intubation beskrevet her er en enkel, men alligevel fremragende noninvasive metode til at jævnt levere materialer af interesse for mus lunge. Denne fremgangsmåde muliggør undersøgelse af effekten og / eller rolle materiale administreret på fysiologi og / eller patologi af lungen. De materialer, der administreres kan være endogene molekyler såsom cytokiner eller eksogene materialer såsom miljøfremmede kemikalier / stoffer, kræftfremkaldende stoffer, forurenende stoffer, allergener, eller virus, der resulterer i forskellige lungesygdomme, der kan udgøre en model for at studere forskellige menneskelige sygdomme 6-10. Denne teknik kan også anvendes i forbindelse med rekombinant adenovirus eller lentivirus at indføre overekspression eller deletion af generne af interesse i luftvejs-epitelceller til at undersøge den rolle, som disse gener i homeostase, fysiologi, patologi og / eller carcinogenese lunge. Forstyrrelsen af et gen kan opnås ved transient udtrykker Cre-rekombinase i epitelceller for at forstyrre en floxet gen irenter i de epitelceller 11.
Et kateter kan let ved en fejl indsat i spiserøret, som er anbragt ved siden af trachea. I den her beskrevne fremgangsmåde, det Intubation Illumination System giver vejledning til den korrekte position, hvor kateteret skal indsættes 5.. Systemet består af en fiber-optisk fiber, der er stabilt forbundet til en lyskilde og en specialudviklet miniature optisk linse, der tillader lys at fokusere på fiberoptisk fiber. Leveringen ende af det fiberoptiske fibre passer ind i engangs intravenøse katetre, der anvendes som intratracheal rør. Dette system giver direkte belysning af oropharynx, så klar visualisering af larynx under intubering. Når man bliver dygtige til at udføre denne teknik ved hjælp af Illumination System anvendelsen af systemet er ikke længere nødvendig. Proceduren kan udføres effektivt med kun et kateter, og hele pROCEDURE kræver kun et par minutter. Den nøjagtige samme metode kan anvendes til rotter med en større størrelse belysningssystem eller et kateter.
Tre punkter er afgørende for en jævn fordeling af materialet over hele lungen. Først, altid måle længden mellem munden og bronchiale bifurkationspunkt før intubation for at få en idé om, hvor dybt kateteret skal indsættes ved hjælp af en praksis mus (figur 1). Da dette i høj grad afhænger af størrelsen af musen, kan det samme indsættelse længde skal bruges, når det er bestemt for mus af en bestemt størrelse. For det andet, så sørg for, at den løsning føjet til intubationsrøret suges lige efter tilsætning. Hvis intubationsrøret fejlagtigt er indsat i spiserøret, vil opløsningen ikke suges ind øjeblikkeligt og således blive i røret. Hvis dette sker, skal du gentage hele processen med intubation. Denne bekræftelse proces sikrer, at opløsningen er i luftrøret, men ikke ispiserøret. Operatøren kan prøve 3x ved maksimal at gentage hele intubation proceduren, hvis løsningen ikke suges ind i lungen. Hvis dette sker ofte, anbefales det dog at gå tilbage til praksis at erhverve højere succes rate. Endelig bør mus være bevidstløs i løbet af intubation, som sikrer, at musen ikke ville expectorate hvad der blev intuberet. I denne forstand er anvendelse af isofluran med en forpart, som også kan fysisk interferere med intubation ikke anbefales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Intramural Research Program for National Cancer Institute, Center for Cancer Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KetaVed | Vedco | Ketamine | |
| AnaSed Injection 20 mg | LLOYD | Xylazine | |
| BioLite Stand | Braintree Scientific | RIS100 | For mice |
| BioLite Intubation Illumination System | Braintree Scientific | BIO MI-KIT | For mice |
| 22 G, 1 inch i.v. catheter | Terumo | SR-OX2225CA | For mice below 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used. |
| 20 G, 1 inch i.v. catheter | Terumo | SR-OX2025CA | For mice over 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used. |
References
- Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J. Vis. Exp. (73), e50318 (2013).
- Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS One. 7, e31359 (2012).
- Rayamajhi, M., Redente, E. F., Condon, T. V., Gonzalez-Juarrero, M., Riches, D. W., Lenz, L. L. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. (51), e2702 (2011).
- Riesenfeld, E. P., et al. Inhaled salmeterol and/or fluticasone alters structure/function in a murine model of allergic airways disease. Respir. Res. 11, 22 (2010).
- Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies. Contemp. Top. Lab Anim. Sci. 44, 52-55 (2005).
- Bonniaud, P., et al. Progressive transforming growth factor beta1-induced lung fibrosis is blocked by an orally active ALK5 kinase inhibitor. Am. J. Res. Crit. Care Med. 171, 889-898 (2005).
- Bivas-Benita, M., Zwier, R., Junginger, H. E., Borchard, G. Non-invasive pulmonary aerosol delivery in mice by the endotracheal route. Eur. J. Pharm. Biopharm. 61, 214-218 (2005).
- Haegens, A., et al. Myeloperoxidase deficiency attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung inflammation and subsequent cytokine and chemokine production. J. Immunol. 182, 7990-7996 (2009).
- Jackson, P., et al. Exposure of pregnant mice to carbon black by intratracheal instillation: toxicogenomic effects in dams and offspring. Mutat. Res. 745, 73-83 (2012).
- Bodewes, R., et al. Pathogenesis of Influenza A/H5N1 virus infection in ferrets differs between intranasal and intratracheal routes of inoculation. Am. J. Pathol. 179, 30-36 (2011).
- Winslow, M. M., et al. Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1. Nature. 473, 101-104 (2011).
