Denne artikel beskriver tre nervesystemet præparater ved hjælp af igler: intracellulær optagelse fra neuroner i ventrale ganglier, dyrkning neuroner fra ventrale ganglier, og optagelse fra et plaster på innerverede hud at kortlægge sensoriske felter.
Ferskvand igle, Hirudo medicinalis, er en alsidig model organisme, der er blevet brugt til at løse videnskabelige spørgsmål inden for neurofysiologi, neuroethology og udviklingsmæssige biologi. Målet med denne rapport er at konsolidere eksperimentelle teknikker fra agterliget systemet i en enkelt artikel, der vil være til gavn for fysiologer med ekspertise i andre nervesystemet præparater, eller for biologistuderende med ringe eller ingen elektrofysiologi oplevelse. Vi viser, hvordan du dissekere agterliget til optagelse intracellulært fra identificerede neurale kredsløb i ganglion. Næste viser vi, hvordan de enkelte celler med kendt funktion kan fjernes fra ganglion skal dyrkes i en petriskål, og hvordan du optager fra disse neuroner i kultur. Så skal vi vise, hvordan man forbereder et plaster på innerverede hud, der skal bruges til kortlægning sensoriske eller motoriske felter. Disse leech præparater stadig i vid udstrækning brugt til at behandle de grundlæggende elektriske egenskaber af neurale netværks, adfærd, synaptogenesis og udvikling. De er også en relevant uddannelse modul for neurovidenskab eller fysiologi undervisningslaboratorierne.
Fremstillingen igle er nyttigt til undersøgelse af funktionen af identificeres (sensoriske, motoriske og inter-neuroner i dyrets centralnervesystem (CNS). Den nyttige egenskab igle neuroner er, at formen på deres virkningspotentialer og biofysiske egenskaber er karakteristiske for en given celletype kan (dvs. P, N, T, Rz). Desuden neuroner blive fjernet fra dyret og dyrkes i et egnet medium, i hvilket cellerne opretholder deres elektriske egenskaber, så længe som 45 dage 1,2.
En klar fordel ved agterliget ganglion for at lære at lave elektrofysiologiske optagelser er, at cellerne karakteristisk og pålideligt er arrangeret i ganglion i et mønster, der giver mulighed for identifikation af forskellige celletyper fra ganglion til ganglion og fra dyr til dyr. Den unikke placering og morfologi af neuroner i agterliget ganglier blev bemærket af Retzius så tidligt som 1891 3. Kendskab til the identitet og funktion af en neuron er fordelagtig for at undersøge neurale kredsløb og for at gøre forsøg med en given celletype. På grund af den relativt store somata af neuroner inden for en ganglion de er synlige med et dissektionsmikroskop og somata selektivt kan spiddet med mikroelektroder til optagelse af deres elektriske egenskaber.
Farvestoffer og store molekyler kan injiceres i de enkelte celler og kanal egenskaber undersøgt af patch clamp. Ionstrømme, der giver anledning til de forskellige former af de karakteristiske virkningspotentialer i forskellige neuroner er blevet identificeret 4-7. Fra undersøgelser i mønstret for innervation og forgrening af individuelle neuroner i CNS, har synaptiske forbindelser er gengivet i kultur med identificerede neuroner 2,8. Studier i agterliget ganglier har givet indsigt i udviklingen af funktionelle kredsløb, der kan måles med elektrofysiologi samt med engroe dyrs adfærd studier. Agterliget CNS har også tjent som en god forberedelse til at undersøge mekanismer involveret med neuronal reparation og regeneration i hele dyret og i kultur 4-6,9-12.
I pattedyrhjerner det er en skræmmende opgave at forklare adfærd i forhold til de egenskaber og forbindelser enkelte identificerede neuroner. I princippet kan man håbe, at studiet af mindre komplekse systemer såsom agterliget kunne bidrage til at definere de grundlæggende mekanismer, der anvendes i højere dyr. De forbindelser, der bruges som ligger til grund for en svømmetur mønster 13,14 og rhythmicity af hjertet 15 er blevet godt karakteriseret i agterliget. Evnen nogle igle neuroner til at danne både elektrisk og kemisk kommunikation er spændende. Nogle forbindelser er tovejs, mens andre er ensrettede kemisk men tovejs elektrisk 7. Forståelse af de synaptiske forbindelser inden dyret samt genskabe samme type af forbindelser i en kultur fad er stærke værktøjer til at undersøge synaptogenesis 16-18 samt farmakologiske profilering af synapser 19. De intracellulære optagelse og stimulering teknikker er beskrevet her giver et fundament for farmakologiske analyser og forskning i neuroethology og udvikling.
Desuden kan segmental ventrale nerve ledning dissekeres med et plaster på innerverede hud. Med evnen til at holde et plaster på huden og neuroner i live, kan sensoriske receptive felter probes ved at optage elektriske signaler fra cellen kroppen (dvs. soma) af sensoriske neuroner i respektive abdominal ganglion i CNS. Derved kan man vurdere følsomheden af de sensoriske slutninger ved at anvende varierende grader af kraft på huden og kortlægge receptive områder: let berøring, tryk og skadelige (smertefulde) stimuli 20,21.
En fordel ved denne igle præparat ganglion-hud er, at en CAn tegne anatomisk den receptive felt kort og spore neuronale processer til den identificerede neuron, når de elektriske reaktioner bliver registreret. De tre leech nedenfor beskrevne eksperimenter kan alle være afsluttet flere gange med et enkelt eksemplar, hvilket gør dette en omkostningseffektiv undervisningsmodul til akademiske laboratorier.
Formålet med dette sæt eksperimenter var 1) at undervise og udstille de grundlæggende principper for intracellulære optagelser fra identificerbare neuroner og 2) at genkende de karakteristiske figurer af elektriske signaler, der kan opstå fra disse særlige neuronale typer ved brug voksne igler. Der er en rig historie af undersøgelser ved hjælp agterliget for neurofysiologiske undersøgelser og forskning er i gang i håndteringen spørgsmål om neurale kredsløb og genregulering under udvikling såvel som i løbet af synaptisk reparation og regeneration 10. Neuromodulation, navnlig gennem biogene amin veje, har også været en succesfuld forskning retning i agterliget. Ved at tilføje dopamin og andre farmakologiske midler til nervesystemet gennem saltvandsopløsning, er det blevet vist, at dopamin modulerer neurale netværk, der er involveret i beslutningsprocessen 23 og motoriske mønstre for kravlende adfærd 24,25. Denne eksperimenterende tilgang er en forenkletle (og billig) måde at indarbejde graduering i undervisningen laboratorium, og justere den ioniske makeup af saltopløsningen er en effektiv måde at lære Nernst og Goldman-Hodgkin-Katz ligninger.
Hvis det skal lykkes med ganglion forberedelserne er det vigtigt at have den ganglion stram inden du forsøger at stikke en soma med en intracellulær elektrode. Ellers soma bevæge sig, når man trykker ned på glial pakke. Hertil kommer, når desheathing ganglion til at fjerne neuroner for kulturen, undgå området af interesse, når der skæres på tværs af ganglion så SOMA ikke beskadiges, når de er fjernet. Desuden kan overdreven inkubering i enzymerne resultere i neuronerne være for skrøbelige til at blive fjernet. Det kræver nogle trial and error til at opnå en ideel inkubationstid, fordi hver batch af enzymer er lidt anderledes i deres handlinger.
Yderligere undersøgelse for at optimere dyrkningsmedier kunne forbedre denne teknik. Variskellige faktorer, såsom tilstedeværelsen af insulin, sukker eller vækstfaktorer kunne undersøges for længere opretholdelse af kulturer. At afgøre, om cellerne opretholder deres evne til at syntetisere sendere, såsom serotonin syntese i Rz celler, neutral rød farvning anvendes til at mærke serotonerge processer. Også microglial invasion til tilskadekomne og regenerere væv kan kvantificeres ved nukleare pletter dage efter en skade.
Selv om dette præparat har mange fordele at tilbyde i at undersøge regenerering og reparation samt neurale kredsløb, farmakologiske og molekylær identifikation af de forskellige receptorsubtyper ved synapser er ikke blevet fuldt karakteriseret. En udtrykt sekvens tag bibliotek er tilgængelig 26 og medicinske igle genom øjeblikket samlet 27, men den vigtigste begrænsning igle sammenlignet med nogle model præparater er evnen til at modificere genomet selektive gener i specifikke celletyper. Med embryoner thans begrænsning er blevet behandlet ved at injicere DNA eller dsRNA til at regulere genekspression 28. Genkanonen teknik er for nylig blevet anvendt til at udtrykke hvirvelløse connexin (innexin) proteiner i igle neuroner. Udtryk for en innexin fra Hirudo verbana (hve-inx6) er tilstrækkelig for dannelsen af ektopiske gap junctions i den medicinske igle 29. Den medicinske igle-eller H. verbena, da det var 30 er sikker på at fremme vores forståelse af fysiologi og evolution af elektriske synapser i de kommende år.
The authors have nothing to disclose.
Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
Tris/maleic acid | Sigma-Aldrich | ||
Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
CULTURING MATERIALS | |||
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Collagenase/Dispase | Boehringer Mannheim | 269-638 | |
Leibovitz L-15 with L-Glutamine | Gibco | 041-01415H | |
Fetal calf serum | Ready Systems Ag | ||
04-001 | |||
D-Glucose-Monohydrate | Merck | 8342 | |
Gentamycin sulfate | any supplier | 10 mg/ml | |
Glutamine | Gibco | 043-0503H | |
HEPES | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
Concanavalin A Type IV | Sigma | C 2010 | |
Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma | P 7890 | MW 15-30,000 |
Microwell plate, 60 x 10 μl | Falcon | 3034 | Flat bottom, 10 in a bag |
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
Intracellular electrode probe | |||
Faraday cage | |||
Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
Dissecting microscope (100X) | |||
Fiber optic lamp | |||
Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, Suction electrodes |
Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
Raised preparation stand | |||
Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
Computer | any company | ||
AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
LabChart7 | AD Instruments | ||
Electrical leads | any company | ||
Glass tools | make yourself | For manipulating nerves | |
Cable and connectors | any company | ||
Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
Beakers | any company | ||
Wax or modeling clay | any company or local stores | ||
Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
Plastic tip for suction electrode | local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size. |