Summary
Denne artikkelen beskriver tre nervesystemet forberedelser hjelp igler: intracellulær opptak fra nevroner i ventrale ganglia, dyrking nevroner fra ventral ganglier, og opptak fra en lapp av innervated huden å kartlegge sensoriske felt.
Abstract
Ferskvann igle, Hirudo medicin, er en allsidig modell organisme som har blitt brukt til å adressere vitenskapelige spørsmål innen nevrofysiologi, neuroethology, og utviklingsbiologi. Målet med denne rapporten er å konsolidere eksperimentelle teknikker fra igle systemet inn i en enkelt artikkel som vil være til nytte for fysiologer med kompetanse i andre nervesystemet forberedelser, eller til biologi studenter med liten eller ingen elektro erfaring. Vi demonstrerer hvordan å dissekere den igle for opptak intracellulært fra identifiserte nevrale kretser i ganglion. Neste vi vise hvordan de enkelte celler med kjent funksjon kan fjernes fra ganglion som skal kultiveres i en petriskål, og hvordan man skal ta opp fra disse neuroner i kultur. Deretter viser vi hvordan du kan forberede en oppdatering av innervated huden til å bli brukt for å kartlegge sensoriske eller motoriske felt. Disse igle forberedelser er fortsatt mye brukt for å løse grunnleggende elektriske egenskapene til neural nettverks, atferd, synaptogenesis, og utvikling. De er også en passende opplæringsmodul for nevrovitenskap eller fysiologi undervisning laboratorier.
Introduction
Den igle preparatet er nyttig for å undersøke funksjonen av identifiserbar (sensorisk, motor-og inter-neuroner i løpet av dyrets sentralnervesystemet (CNS). Utnyttbare egenskap ved igle neuroner er at formen på deres aksjonspotensialer og biofysiske egenskaper er karakteristiske for en gitt celletype (dvs. P, N, T, Rz). Videre nevroner kan fjernes fra dyret og dyrket i et passende medium hvori cellene opprettholde sine elektriske egenskaper så lenge som 45 dager 1,2.
En klar fordel av igle ganglion for å lære hvordan å lage elektrofysiologiske opptak er at cellene er karakteristisk og pålitelig arrangert i ganglion i et mønster som gjør identifisering av forskjellige celletyper fra ganglion til ganglion og fra dyr til dyr. Den unike beliggenheten og morfologi av nevroner i igle ganglia ble bemerket av Retzius så tidlig som i 1891 3. Kunnskap om the identitet og funksjon av et neuron er fordelaktig for å undersøke nevrale kretser og for å gjøre forsøk med en gitt celletype. På grunn av den relativt store somata av neuronene innenfor en ganglion de er synlige med et disseksjonsmikroskop, og somata selektivt kan spiddet med microelectrodes for registrering av deres elektriske egenskaper.
Fargestoffer og store molekyler kan bli injisert inn i individuelle celler og kanalegenskapene studert av patch clamp. Ioniske strømninger som gir opphav til de ulike former av de karakteristiske aksjonspotensialer i ulike nerveceller har blitt identifisert 4-7. Fra undersøkelser i mønsteret av innervasjon og forgrening av enkelte nerveceller i sentralnervesystemet, har de synaptiske forbindelser blitt reprodusert i kultur med identifiserte nevroner 2,8. Studier i igle ganglia har gitt innsikt i utviklingen av funksjonelle kretser som kan måles med elektrofysiologi, så vel som med enge dyrs atferd studier. Akterliket CNS har også fungert som en verdifull forberedelse for å undersøke mekanismene som er involvert med nevronale reparasjon og regenerering i hele dyret og i kultur 4-6,9-12.
I pattedyr hjerner er det en krevende oppgave å forklare atferd i form av egenskaper og tilkoblinger av individuelle identifiserte nevroner. I prinsippet kan man håper at studiet av mindre komplekse systemer som iglen kan bidra til å definere grunnleggende mekanismer som brukes i høyere dyr. Tilkoblingene som brukes som ligger til grunn for en svømmetur mønster 13,14 og rhythmicity av hjertet 15 har blitt godt karakterisert i akterliket. Muligheten av noen igle neuroner for å danne både elektrisk og kjemisk kommunikasjon er interessant. Noen forbindelser er toveis, mens andre er enveis kjemisk men toveis elektrisk syv. Forstå det synaptiske forbindelser i dyret samt gjenskape den samme type av forbindelser i en kultur fatet er kraftige verktøy for å undersøke synaptogenesis 16-18 samt farmakologisk profilering av synapser 19. De intracellulære opptak og stimuleringsteknikker beskrevet her gi et grunnlag for farmakologiske analyser og forskning i neuroethology og utvikling.
I tillegg kan segmental ventrale nerveledning bli dissekert med en lapp av innerverte hud. Med muligheten til å holde en lapp av hud og nervecellene i live, kan sensoriske mottakelig felt bli analysert ved å registrere elektriske signaler fra cellekroppen (dvs. soma) av sensoriske nerveceller innenfor respektive mage ganglion i CNS. Dermed kan man vurdere følsomheten av de sensoriske avslutninger ved å bruke varierende grader av kraft på huden og kartlegge mottakelig felt: lett berøring, trykk, og skadelige (smertefulle) stimuli 20,21.
En fordel med denne igle ganglion-skin preparatet er at man can trekke anatomisk den mottakelig feltet kartet og spore de nevrale prosesser til den identifiserte nevron når de elektriske svarene blir registrert. De tre igle eksperimentene som er beskrevet nedenfor, kan alle bli utført flere ganger med en enkelt prøve, noe som gjør dette til et kostnadseffektivt undervisning modul for vitenskapelige laboratorier.
Protocol
En. Utarbeidelse av elektroder og Saline Solution
- Forbered fysiologisk saltvann og elektrodene før dyret blir dissekert. Leech Ringers oppløsning har følgende sammensetning: 115,3 mM NaCl, 1,8 mM CaCl 2, 4,0 mM KCl, 10 mM Tris / maleinsyre-eller HEPES. Juster pH-verdien til 7,4.
- Tilbered en Ag-Cl ledning ved å dyppe en renset sølvtråd i en liten mengde av blekemiddel i 20 min eller inntil wiren har en jevn mørk grå farge. Vask ledningen med destillert vann før bruk. Deretter plasserer ledningen inn en micropipette holderen som plugges inn i forsterkeren.
- Forbered en skarp glasselektrode av borsilikatglass ved hjelp av en pipette avtrekker. Elektroden motstanden bør være av størrelsesorden 20 MΩ.
- Fylle pipette med 3 M kalium acetat løsning og sette inn i inn i micropipette holderen.
- For et ekstracellulært elektrode forberede en skarp glass-pipette, som beskrevet ovenfor, bryter spissen tilbake avrubbing annen skarp pipette nær den skarpe kanten. Deretter brann polere spissen slik at den ikke rive connectives. Plast ekstracellulære elektroder også vil fungere så lenge det er god kontakt mellom elektroden og nerve.
- Sett ekstracellulære opptakselektrode i en mikropipette holder (med Ag-Cl ledning) som er utstyrt med en gummi-slange og sprøyten for sug. Bruk av sprøyten for å trekke saltvann inn i elektroden i det minste til nivået av sølvtråd.
- Sett opp maskinvaren (forsterker og stimulans isolator) og programvare opptaksparametere ved å følge bruksanvisningen for din spesifikke signalinnspillingsenhet. Se Leksrisawat et al. 22 for å vise detaljer om utstyret som brukes i forsøkene som er beskrevet nedenfor.
2. Ventral Ganglion Dissection
- Dissekere igle i en stor silikon elastomer-lined tallerken med igle Ringer løsning. Hvis dyret er strukket i lengderetningen vil denvære lettere å fjerne den ventrale nerveledning (se figur 1A).
- Med # 10 eller # 11 size skalpell, lag et langsgående snitt med svært grunt kutt i ventral midtlinjen. Om midt 2/3rd av den ventrale snitt er vist i figur 1B. Prøv ikke å skjære gjennom den svarte strømpe (ventral blod sinus) inntil dyret er helt åpne og blodet sinus strekkes uten knekk. Denne blod sinus kjører lengden av dyret langs den ventrale midtlinje. Den VNC er inneholdt inne i dette blodkaret.
- Etter at huden har blitt kuttet i hele lengden av dyret bruker de fine iris saks til nick blod sinus (figur 2). Slip ett blad av de fine iris saks under sinus og litt heve bladet for å skille den fra nervevev. Skjær sinus lengden av VNC samtidig unngå nerverøttene, segment nerver, eller connectives mellom ganglier.
- Deretter fjernes en del av den ventrale nerveledning avkutte røttene distale til der blodåren blir røttene. Gjenta denne fremgangsmåten for hver ganglion langs lengden av den ventrale nerveledning.
- Overfør et segment av en eller to ganglia til en mindre petriskål. Den ganglia eller enkelt ganglion må bli festet stram med en viss slakk.
- Pin connectives og røttene slik ganglion glial skjede er litt strukket for å hindre at nevron celle organer fra å bevege seg rundt når impaling gjennom glial skjede og inn i nervecellen av interesse. Tappene skal plasseres gjennom det svarte sinus for røttene og i midten av de to connectives for å minimere skade på axoner (figur 3).
- Plasser petriskål med preparatet under mikroskopet og sikre den med voks på bunnen av skålen for å hindre bevegelse.
- Fokusere forsiktig lysstråle ved hjelp av et speil og lys-kondensator for å se nevroner som i figur 4A (som skjematisk vist i figur 4B
- For å gjøre et intracellulært opptak av Rz, T, P, og N-neuroner, forsiktig å plassere spissen av elektroden over cellen av interesse og senk tuppen til en fordypning som er sett i glial sliren.
- Trykk på elektrodeholderen eller manipulator (svært nøye), slik at elektrodespissen "spretter" inn i cellen av interesse.
- Injisere korte pulser (30-40 ms) av positiv strøm (1-10 nA) inn i cellen for å fremkalle aksjonspotensialer.
Tre. Dyrkningsnerveceller fra baks Ganglion Forberedelse
- Pin ganglia ventrale side opp i en ren skål som inneholder L-15 med kalvefosterserum (FCS) (figur 3). Pin røttene, slik at gangliene er litt strukket så gjort ovenfor for intracellulære opptak. Med fine saks, nick glial kapsel i den ene enden, slip en saks blad under kapselen, deretter kutte over glial kapselsom vist i figur 5A.
- Tilsett 100 pl alikvot av Collagenase / Dispase til formen og stedet på en ristemaskin i 15 min. Undersøk-celler ved å bevege vekstmedium rundt den eksponerte celle organer. Retur cellene til riste i 15 min eller lenger før cellene komme ut med minimale sug.
- Bruk en pipette festet til en sprøyte for å forsiktig trekke celler fra ganglion. Brann polere pipettespissen, slik at den er litt større enn diameteren av cellelegemet. For Rz celler i en voksen igle, bør diameteren være omtrent 50 mikrometer.
- Forbered en rekke av pipetter med forskjellige diametre uten en glødetråd som dette reduserer sjansene for cellene som stikker inne i pipetten. Oppbevar pipettene i en flaske som inneholder 80% etanol (EtOH) ved hjelp av en bomullsdott i bunnen for å beskytte tips fra chipping. Husk å vaske EtOH ut av pipetten med medium før aspirere celler.
- Etter enzymet behandling, vaske utenzym-inneholdende medium med L-15 (med FCS) 2 x. Identifiser cellene av interesse og forsiktig trekke dem inn i pipetten ved å trekke sprøyten (figur 6A). Utslipp de aspirerte celler inn i en annen tallerken som inneholder L-15 (med FCS).
- Inntil nå, alle prosedyrer var ikke-sterile. Utfør følgende trinn i en steril hette. Plasser 3-4 store dråper av steril L-15 (med FCS) på forskjellige steder inne i en steril petriskål.
- Pipetter cellene inn i en av de før-nevnte dråper, blåser dem rundt i rulle å vaske dem. Gjenta dette i serie i 3 eller 4 dråper medium.
- Plasser-celler i en ren petriskål fylt med L-15 (med FCS).
- Inkuber cellene i 1-24 timer ved romtemperatur. Etterpå kan de rene celler kan bli belagt. Ved å la cellene for noen timer eller over natten den ekstracellulære matrise løsner lett. Plate cellene umiddelbart å generere lengre prosesser.
- Bruk sterilt substrat å belegge en mikro di sh og la det tørke helt (over natten) før dyrking eksperimenter.
- Etter at formen er blitt belagt, vaskes fatet forsiktig med sterilt vann og deretter med en liten mengde av L-15 medium. Husk å bruke L-15 løsning uten FCS legges til at cellene til å følge retten. Mediet kan lett endres til L-15 med FCS etter at cellene er festet til substratet. Hvis cellene skal brukes et par timer etter plettering, og deretter å slå av medium til L-15 med FCS er ikke nødvendig.
- Plasser celler ved siden av hverandre ved plating for å indusere hurtig synaptogenesis (figur 6B). Etter 24 timers tiltaket fysiologisk aktivitet i motstandere av nerveceller.
- Bruk intracellulære elektrofysiologiske teknikker for å spille inn RP eller synaptiske responser i dyrkede cellepar (stimulere en nevron gjennom en intracellulær elektrode og registrere svar fra den sammenkoblede cellen ved hjelp av en andre intracellulære elektrode).
- Pin igle ryggsiden ned i en elastomer-foret fatet som er beskrevet ovenfor.
- Pin huden til den ene siden med røttene på den andre siden av den avkuttede ganglion (figur 7A, forstørret i figur 7B) eller lage et vindu på den ventrale del av akterliket over en ganglion (figur 7C) med alle røttene til legemet vegg intakt.
- Etter å ha fått en stabil intracellulært opptak i en av de sanseceller (T, P, N) bruker et lite glass stang som har vært brann polert forsiktig inntil huden i samme segment. Dersom neuron blir tatt opp fra et N celle deretter mer trykk må brukes på huden. I de fleste tilfeller vil N cellen bare svare hvis huden er klemt med pinsett. Av denne grunn er disse cellene bør prøves siste som man kunne skade huden eller fortrenge det intracellulære omkoding ved å forstyrre fremstillingen på en slik måte.
- Man bør værei stand til raskt å skissere huden og ganglion med detaljer tilstrekkelig nok til at et kart over hvor en rørt kan brukes til å bestemme den mottakelig feltet for en bestemt neuron. Etter opptak fra så mange T og P-celler som mulig på begge sider av en ganglion prøve N-celler.
- For å undersøke om de sensoriske nervecellene har prosesser som reiser gjennom connectives i en rostral eller hale måte og deretter ut røttene i den tilstøtende segmentet til huden, kan de connectives mellom ganglia kuttes og de reseptive felt reexamined i forhold til spredning av gjenkjenning. I utgangspunktet en er å undersøke om det har vært noen tap i mottakelig feltet.
5. Injeksjon av fluorescerende fargestoffer
- Forbered en igle ganglion som beskrevet ovenfor.
- Fyll en mikroelektroden med en oppløsning av Lucifer gult-CH (3,0%) og litiumklorid (300 mM).
- Spidde en av sensoriske celler eller Rz celler på den ventrale side av ganglion som beskrevetovenfor.
- Injiser fargestoff inn i cellen ved å føre negativ strøm (3NA) gjennom elektroden i 15 min. Sett pulsvarighet til 100 msek og frekvensen til 2 Hz.
- Visualisere dye-fylt nevroner etter spennende fargestoff med en kvikksølvlampe og en FITC / GFP filter sett.
Representative Results
Intracellulære opptak fra sensoriske nerveceller i igle ganglion er preget av deres distinkte spenning-time spor som vist i Figur 4C. Den hvilende cellemembranpotensialet i friske igle ganglion-celler er -45 til -60 mV. Hvis potensialene er mindre (mindre negative) en skal forandre glasselektrode, eller hvis potensialet fremdeles er lav, gå videre til et annet segment av nerveledning. Spontane aksjonspotensialer med liten amplitude, kan tyde på at elektroden er i en motor neuron. Hvis dette skjer i ganglion-kroppsveggen en strøm injeksjon kan brukes til å bestemme om neuron Innerverer ethvert av musklene fremdeles festet til huden. Den ringformede erector motor neuron (AE) er på den ventrale side av ganglion (fig. 4B), og det vil føre til at ringrom (rygger eller segmenter) for å stige ved å aktivere ringrom erector muskel.
Injeksjon av strøm inn i sansecellene skal fremkalle aksjonspotensials med de karakteristiske kurvene vist i Figur 4C. Hvis kurvene ser annerledes det kan være grunn til en ubalansert bro eller offset kapasitans kompensasjon. Man bør se i manualen som følger med signal oppkjøpet enhet for informasjon om hvordan å balansere brua inne i en celle. Legg merke stimulanse gjenstander ved begynnelsen og slutten av strømpulser i Figur 4C. Dette er hvordan gjenstander se når broen er balansert.
Primærkulturer av nerveceller fra igle ganglion danner elektriske og kjemiske synapser i fatet. I første omgang de elektriske egenskapene til de dyrkede cellene ikke er nøyaktig de samme som de er in vivo. Men etter noen dager impulsene er nesten umulig å skille fra de som er registrert i ganglion. Dette er vist i figur 6C med et par Rz celler. Etter 7 timer i kultur amplituden av synaptiske potensialer var 1-2 mV. Etter 56 timer i kultur synaptic potensialer var større enn 10 mV (topp spor i figur 6C). Formen på aksjonspotensialet endres også etter 56hr i kultur. Under de forholdene som er beskrevet i disse cellene er levedyktig i flere dager.
Intercellulær kommunikasjon kan påvises ved å stimulere nerverøtter eller connectives og opptak fra nevroner i ganglion. Stimulere disse nervene genererer robuste synaptiske potensialer og aksjonspotensialer i ulike ganglion celler. Spor i figur 8B ble registrert fra en Retzius celle i et ganglion som var blitt fjernet fra dyret, og festet i en tallerken. Den svarte spor ble fremkalt av en subthreshold stimulans påføres med et ekstracellulært elektrode til binde. Økende stimulans spenning forårsaket cellen til å fyre et aksjonspotensial (rød spor). Fluorescerende fargestoffer eller pepperrot peroksidase kan injiseres inn i disse celler for å studere deres morfologi. Lucifer yellow ble injisert i en Rzneuron ved å føre en negativ strøm gjennom elektroden. Et alternativ er å sprøyte fargestoff ved hjelp puffs av lufttrykket. Figur 9A viser fargestoff like etter injeksjonen begynte. Tretti minutter senere fargestoffet allerede hadde diffust i nerverøttene (figur 9B). Den type fargestoff avhenger av programmet, for eksempel små molekylvekt fargestoffer som kan passere gjennom gap veikryss brukes til å identifisere elektriske synapser.
Figur 1. . Ventral igle disseksjon (A) Dyret er grundig festet ventral siden opp i en elastomer-lined tallerken fylt med igle saltvann (B) En grunne snitt spenner over anterior:. Posterior aksen er laget bare lateral til midtlinjen for å unngå skade på nerve ledningen. Den svarte blod sinus (som contains ventrale nerve ledningen) kan lett bli sett. Legg merke til ett synlig ganglion som er hvit i forhold til skjeden. Klikk her for å se større bilde .
Figur 2. Disseksjon av den sorte sinus. Blodkaret (pil) bør være nøye snitt på den ene side for å eksponere den ventrale nerveledning (dobbeltpil). La segmenter av blodkar intakt rundt segmental røttene for bruk som et håndtak for å manipulere den ventrale nerve ledningen ved overføring fra en disseksjon og opptak retter. Klikk her for å se større bilde .
Fig. 3. Isolert seksjon av ventral nerveledning. Pinning ventrale nerveledning av blodkar fragmenter som blir tilbake på segmental røtter og ved endene av de segmental connectives eksponerer ganglia for elektrofysiologiske målinger. En stram strekking av ganglia gjør det mulig å se de identifiserbare celle organer, og vil føre til at en lettere inntrengning av glial kappe med en skarp glasselektrode. for å vise større bilde .
Figur 4. Cellular anatomi av igle ganglion. (A) Ideelt Retzius celler (R) og andre store celle organer (P-pressure, vil T-touch, N-nociceptiv, AE-ringrom erector) være godt synlig hvis mikroskopet og lys kondensator er satt opp riktig. (B) Skjematisk visning av celler i ganglion. Små forskjeller i plasseringen av de Somas vil oppstå i hver ganglion grunnet hvordan ganglion er strukket og festet stramt. (C) Handlings potensialer registrert fra soma av disse nevronene har karakteristiske bølgeformer. Disse toppene ble fremkalt ved å injisere positiv strøm inn i cellen (firkantet puls legge over spennings-time spor). Klikk her for å se større bilde .
Figur 5. Desheathing ganglion å fjerne individuelle celle organer. (A) Den glial slirebør nøye kuttet tvers av ganglion å unngå skadelige celler av interesse. Den røde linjen viser et kutt for å unngå å treffe den soma av RZ nevroner. Åpning skjede gir fordøyelsesenzymer tilgang til bindevev matrise. (B) Sunn celle organer svulmende ut av ganglion etter glial skjede er blitt åpnet. Klikk her for å se større bilde .
Figur 6. Dyrking neuroner fra igle. Ganglion (A) Celler blir aspirert fra ganglion ved hjelp av en mikropipette og overført til en skål inneholdende dyrkningsmediet. (B) å plassere flere celler i nærheten av hverandre, vil øke hastigheten av synaptogenesis mellom identifiserbare neuroner. Her stumps av to nevroner har dannet en synapse. (C) nevroner i kultur utstillingen litt forskjellige elektriske egenskaper. Den øverste spor viser synaptiske potensialer fremkalt ved å stimulere den tilstøtende cellen 7 timer og 56 timer etter at cellene ble platet. De nederste spor ble fremkalt ved å injisere strøm direkte til en av RZ celler. Legg merke til økningen i synaptiske potensial amplitude og endre i handlingen potensielle bølgeform etter 56 timer på kultur. Klikk her for å se større bilde .
Figur 7. Den igle ganglion-kroppsveggen forberedelse for kartlegging mottakelig felt. (A) En tilnærming er å fjerne en hel del av kroppen veggen sammen med 1-3 ganglier. Her røttene på den ene siden har been kutt og ganglion har blitt låst ut til siden. (B) En låste ut ganglion ved høyere forstørrelse. (C) En annen tilnærming er å skape et lite vindu i kroppen veggen og ta opp fra den intakt ganglia mens kartlegge en mottakelig felt . (DG) Hver av de sensoriske nevroner oppviser en karakteristisk respons på en mekanisk stimulus. (D) et lett trykk fremkaller aktivitet i T-celler, men ikke i P-eller N-celler. (E) for T-cellerespons slås av som reaksjon på sterkere stimuli, noe som gir vei til aktivering av P celle. Som stimulans blir sterkere N celler blir aktivert (FG). Klikk her for å se større bilde .
Figure 8. Fremkalt aktivitet i igle ganglion. Ekstracellulær stimulering av connectives kan brukes til å drive synaptisk transmisjon i nerveledning. (A) Dette er gjort ved å koble en sugeelektrode av en av de connectives og påføring av en liten spenning. Den skarpe glasselektrode (pil) kan sees impaling en Retzius celle i ganglion. (B) Spenning-time spor som viser stimulans gjenstand etterfulgt av en synaptisk potensial (svart) og et aksjonspotensial (rød). Klikk her for å se større versjon image .
Fig. 9. Injisering fargestoff inn igle neuroner. (A) Lucifer gult kan injiseres inn i soma ved å føre strøm through innspillingen microelectrode. En kvikksølvlampe og FITC filtersett kan deretter brukes til å visualisere fluorescens. (B) Dye har diffundert inn i den Rz axoner omtrent 30 minutter etter injeksjonen. for å vise større bilde .
Discussion
Hensikten med dette sett av eksperimenter var 1) å lære og viser de grunnleggende prinsipper for intracellulære opptak fra identifiserbare nevroner, og 2) å gjenkjenne de karakteristiske former av elektriske signaler som kan oppstå fra disse bestemte neuronale typer som bruker voksen igler. Det er en rik historie av undersøkelser ved hjelp av igle for nevrofysiologiske undersøkelser og forskning pågår i ta tak i saker av nevrale kretser og genregulering under utvikling så vel som under synaptiske reparasjon og regenerering 10. Neuromodulation, særlig gjennom biogene aminer trasé, har også vært en vellykket forskning retning i akterliket. Ved å legge til dopamin og andre farmakologiske midler til nervesystemet gjennom saltoppløsning, har det vist seg at dopamin modulerer nevrale nettverk som er involvert i beslutnings 23 og motoriske mønstre for gjennomgang atferd 24,25. Dette eksperimentelle tilnærming er en forenkletle (og billig) måte å innlemme modulasjon i undervisningen laboratoriet, og justering av ionisk makeup av saltvann er en effektiv måte å lære Nernst og Goldman-Hodgkin-Katz ligninger.
For å lykkes med ganglion forberedelsene er det viktig å ha ganglion stram før du prøver å dytte en soma med en intracellulær elektrode. Ellers soma vil flytte når presser ned på glial pakken. I tillegg, når desheathing ganglion for å fjerne nevroner for kultur, unngå interesseområdet når du skjærer på tvers av ganglion så Somas ikke blir skadet som de er fjernet. Dessuten kan overdreven inkubering i enzymer resultere i neuronene blir for skjør til å bli fjernet. Det krever litt prøving og feiling for å oppnå en ideell inkubasjonstid fordi hver batch av enzymer er litt annerledes i sine handlinger.
Videre undersøkelser for å optimalisere kultur media kunne forbedre denne teknikken. Varilige faktorer, slik som tilstedeværelse av insulin, sukker eller vekstfaktorer kan bli kontrollert for lengre opprettholdelse av kulturer. For å finne ut om cellene opprettholde sin evne til å syntetisere sendere, som serotonin syntese i Rz celler, kan nøytrale røde flekker brukes til å merke serotonerge prosesser. Også microglial invasjon til skadde og gjenoppfriske vev kan kvantifiseres ved atom flekker dager etter en skade.
Selv om dette preparatet har mange fordeler å tilby i å undersøke regenerering og reparasjon samt nevrale kretser, farmakologiske og molekylær identifisering av de ulike reseptorundertyper ved synapser er ikke fullstendig karakterisert. En uttrykt sekvenssignal bibliotek er tilgjengelig 26, og den medisinske igle genomet blir nå montert 27, men den viktigste begrensning i igle forhold til noen modell preparater er evnen til å modifisere genomet for selektivt gener i spesifikke celletyper. I embryo tbegrensningen hans er løst ved å injisere DNA eller dsrna å regulere genuttrykket 28. Genet pistol teknikken har nylig blitt brukt til å uttrykke virvelløse connexin (innexin) proteiner i igle nevroner. Uttrykk for en innexin fra Hirudo Verbana (Hve-inx6) er tilstrekkelig for dannelsen av ektopiske gap veikryss i medisinsk igle 29. Den medisinske igle-eller H. verbena som det var 30 er sikker på å fremme vår forståelse av fysiologi og utviklingen av elektriske synapser i løpet av de neste årene.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris/maleic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
| Collagenase/Dispase | Boehringer Mannheim | 269-638 | |
| Leibovitz L-15 with L-Glutamine | Gibco | 041-01415H | |
| Fetal calf serum | Ready Systems Ag | ||
| 04-001 | |||
| D-Glucose-Monohydrate | Merck | 8342 | |
| Gentamycin sulfate | any supplier | 10 mg/ml | |
| Glutamine | Gibco | 043-0503H | |
| HEPES | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
| Concanavalin A Type IV | Sigma | C 2010 | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma | P 7890 | MW 15-30,000 |
| Microwell plate, 60 x 10 μl | Falcon | 3034 | Flat bottom, 10 in a bag |
| Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
| Intracellular electrode probe | |||
| Faraday cage | |||
| Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Dissecting microscope (100X) | |||
| Fiber optic lamp | |||
| Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
| Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, Suction electrodes |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
| Raised preparation stand | |||
| Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
| Computer | any company | ||
| AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
| PowerLab 26T |  AD Instruments |
27T | |
| Head stage | AD Instruments |
Comes with AC/DC amplifier | |
| LabChart7 | AD Instruments |
||
| Electrical leads | any company | ||
| Glass tools | make yourself | For manipulating nerves | |
| Cable and connectors | any company | ||
| Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
| Beakers | any company | ||
| Wax or modeling clay | any company or local stores | ||
| Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
| Plastic tip for suction electrode | local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size. |
References
- Fuchs, P. A., Nicholls, J. G., Ready, D. F. Membrane properties and selective connexions of identified leech neurones in culture. J Physiol. 316, 203-223 (1981).
- Ready, D. F., Nicholls, J. Identified neurones isolated from leech CNS make selective connections in culture. Nature. 281, 67-69 (1979).
- Blackshaw, S. E. Neurobiology of the Leech. Muller, K. J., Nicholls, J. G., Stent, G. S. , Cold Spring Harbor Laboratory. 51-78 (1981).
- Drapeau, P., Sanchez-Armass, S. Parallel processing and selection of the responses to serotonin during reinnervation of an identified leech neuron. J Neurobiol. 20, 312-325 (1989).
- Garcia, U., Grumbacher-Reinert, S., Bookman, R., Reuter, H. Distribution of Na+ and K+ currents in soma, axons, and growth cones of leech Retzius neurones in culture. J. Exp. Biol. , 1-17 (1990).
- Cooper, R. L., Miguel Fernandez, de, Adams, F., B, W., Nicholls, J. G. Synapse formation inhibits expression of calcium currents in purely postsynaptic cells. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. , 217-222 (1992).
- Liu, Y., Nicholls, J. Steps in the development of chemical and electrical synapses by pairs of identified leech neurons in culture. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. , 236-253 (1989).
- Fernandez de Miguel, F., Cooper, R. L., Adams, W. B. Synaptogenesis and calcium current distribution in cultured leech neurons. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. 247, 215-221 (1992).
- Briggman, K. L., Kristan, W. B. Multifunctional pattern-generating circuits. Annu. Rev. Neurosci. 31, 271-294 (2008).
- Macagno, E. R., Muller, K. J., Deriemer, S. A. Regeneration of axons and synaptic connections by touch sensory neurons in the leech central nercoys system. J. Neurosci. 5, 2510-2521 (1985).
- Becker, T., Macagno, E. R. CNS control of a critical period for peripheral induction of central neurons in the leech. Development. 116, 427-434 (1992).
- Marin-Burgin, A., Kristan, W. B., French, K. A. From Synapses to behavior: Development of a sensory-motor circuit in the leech. Dev. Neurobiol. 68, 779-787 (2008).
- Kristan, W. B. The Neurobiology of Swimming in the leech. Trends Neurosci. 6, 84-88 (1983).
- Brodfuehrer, P. D., Friesen, W. O. From stimulation to undulation: a neuronal pathway for the control of swimming in the leech. Science. 234, 1002-1004 (1986).
- Arbas, E. A., Calabrese, R. L. Slow oscillations of membrane potential in interneurons that control heartbeat in the medicinal leech. J. Neurosci. 7, 3953-3960 (1987).
- Ching, S. Synaptogenesis between identified neurons. , McGill University. (1995).
- Kristan, W. B., Eisenhart, F. J., Johnson, L. A., French, K. A. Development of neuronal circuits and behaviors in the medicinal leech. Brain Res. Bull. 53, 561-570 (2000).
- French, K. A. Gap junction expression is required for normal chemical synapse formation. J. Neurosci. 30, 15277-15285 (2010).
- Li, Q., Burrell, B. D. Two forms of long-term depression in a polysynaptic pathway in the leech CNS: one NMDA receptor-dependent and the other cannabinoid-dependent. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Behav. Physiol. 195, 831-841 (2009).
- Nicholls, J. G., Baylor, D. A. Specific modalities and receptive fields of sensory neurons in CNS of the leech. J. Neurophysiol. 31, 740-756 (1968).
- Yau, K. W. Receptive fields, geometry and conduction block of sensory neurones in the central nervous system of the leech. J. Physiol. 263, 513-538 (1976).
- Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. Muscle receptor organs in the crayfish abdomen: a student laboratory exercise in proprioception. J. Vis. Exp. (45), e2323 (2010).
- Crisp, K. M., Mesce, K. A. Beyond the central pattern generator: amine modulation of decision-making neural pathways descending from the brain of the medicinal leech. J. Exp. Biol. 209, (2006).
- Puhl, J. G., Mesce, K. A. Dopamine activates the motor pattern for crawling in the medicinal leech. J. Neurosci. 28, 4192-4200 (2008).
- Crisp, K. M., Gallagher, B. R., Mesce, K. A. Mechanisms contributing to the dopamine induction of crawl-like bursting in leech motoneurons. J. Exp. Biol. 215, 3028-3036 (2012).
- Macagno, E. R., et al. Construction of a medicinal leech transcriptome database and its application to the identification of leech homologs of neural and innate immune genes. BMC Genomics. 11, 407 (2010).
- Kandarian, B., et al. The medicinal leech genome encodes 21 innexin genes: different combinations are expressed by identified central neurons. Dev. Genes Evol. 222, 29-44 (2012).
- Shefi, O., Simonnet, C., Groisman, A., Macagno, E. R. Localized RNAi and ectopic gene expression in the medicinal leech. J. Vis. Exp. (14), e697 (2008).
- Firme, C. P., Natan, R. G. 3rd, Yazdani, N., Macagno, E. R., Baker, M. W. Ectopic expression of select innexins in individual central neurons couples them to pre-existing neuronal or glial networks that express the same innexin. J. Neurosci. 32, 14265-14270 (2012).
- Siddall, M. E., Trontelj, P., Utevsky, S. Y., Nkamany, M., Macdonald, K. S. Diverse molecular data demonstrate that commercially available medicinal leeches are not Hirudo medicinalis. Proc. Biol. Sci. 274, 1481-1487 (2007).
