Summary
Denne artikel beskriver tre nervesystemet præparater ved hjælp af igler: intracellulær optagelse fra neuroner i ventrale ganglier, dyrkning neuroner fra ventrale ganglier, og optagelse fra et plaster på innerverede hud at kortlægge sensoriske felter.
Abstract
Ferskvand igle, Hirudo medicinalis, er en alsidig model organisme, der er blevet brugt til at løse videnskabelige spørgsmål inden for neurofysiologi, neuroethology og udviklingsmæssige biologi. Målet med denne rapport er at konsolidere eksperimentelle teknikker fra agterliget systemet i en enkelt artikel, der vil være til gavn for fysiologer med ekspertise i andre nervesystemet præparater, eller for biologistuderende med ringe eller ingen elektrofysiologi oplevelse. Vi viser, hvordan du dissekere agterliget til optagelse intracellulært fra identificerede neurale kredsløb i ganglion. Næste viser vi, hvordan de enkelte celler med kendt funktion kan fjernes fra ganglion skal dyrkes i en petriskål, og hvordan du optager fra disse neuroner i kultur. Så skal vi vise, hvordan man forbereder et plaster på innerverede hud, der skal bruges til kortlægning sensoriske eller motoriske felter. Disse leech præparater stadig i vid udstrækning brugt til at behandle de grundlæggende elektriske egenskaber af neurale netværks, adfærd, synaptogenesis og udvikling. De er også en relevant uddannelse modul for neurovidenskab eller fysiologi undervisningslaboratorierne.
Introduction
Fremstillingen igle er nyttigt til undersøgelse af funktionen af identificeres (sensoriske, motoriske og inter-neuroner i dyrets centralnervesystem (CNS). Den nyttige egenskab igle neuroner er, at formen på deres virkningspotentialer og biofysiske egenskaber er karakteristiske for en given celletype kan (dvs. P, N, T, Rz). Desuden neuroner blive fjernet fra dyret og dyrkes i et egnet medium, i hvilket cellerne opretholder deres elektriske egenskaber, så længe som 45 dage 1,2.
En klar fordel ved agterliget ganglion for at lære at lave elektrofysiologiske optagelser er, at cellerne karakteristisk og pålideligt er arrangeret i ganglion i et mønster, der giver mulighed for identifikation af forskellige celletyper fra ganglion til ganglion og fra dyr til dyr. Den unikke placering og morfologi af neuroner i agterliget ganglier blev bemærket af Retzius så tidligt som 1891 3. Kendskab til the identitet og funktion af en neuron er fordelagtig for at undersøge neurale kredsløb og for at gøre forsøg med en given celletype. På grund af den relativt store somata af neuroner inden for en ganglion de er synlige med et dissektionsmikroskop og somata selektivt kan spiddet med mikroelektroder til optagelse af deres elektriske egenskaber.
Farvestoffer og store molekyler kan injiceres i de enkelte celler og kanal egenskaber undersøgt af patch clamp. Ionstrømme, der giver anledning til de forskellige former af de karakteristiske virkningspotentialer i forskellige neuroner er blevet identificeret 4-7. Fra undersøgelser i mønstret for innervation og forgrening af individuelle neuroner i CNS, har synaptiske forbindelser er gengivet i kultur med identificerede neuroner 2,8. Studier i agterliget ganglier har givet indsigt i udviklingen af funktionelle kredsløb, der kan måles med elektrofysiologi samt med engroe dyrs adfærd studier. Agterliget CNS har også tjent som en god forberedelse til at undersøge mekanismer involveret med neuronal reparation og regeneration i hele dyret og i kultur 4-6,9-12.
I pattedyrhjerner det er en skræmmende opgave at forklare adfærd i forhold til de egenskaber og forbindelser enkelte identificerede neuroner. I princippet kan man håbe, at studiet af mindre komplekse systemer såsom agterliget kunne bidrage til at definere de grundlæggende mekanismer, der anvendes i højere dyr. De forbindelser, der bruges som ligger til grund for en svømmetur mønster 13,14 og rhythmicity af hjertet 15 er blevet godt karakteriseret i agterliget. Evnen nogle igle neuroner til at danne både elektrisk og kemisk kommunikation er spændende. Nogle forbindelser er tovejs, mens andre er ensrettede kemisk men tovejs elektrisk 7. Forståelse af de synaptiske forbindelser inden dyret samt genskabe samme type af forbindelser i en kultur fad er stærke værktøjer til at undersøge synaptogenesis 16-18 samt farmakologiske profilering af synapser 19. De intracellulære optagelse og stimulering teknikker er beskrevet her giver et fundament for farmakologiske analyser og forskning i neuroethology og udvikling.
Desuden kan segmental ventrale nerve ledning dissekeres med et plaster på innerverede hud. Med evnen til at holde et plaster på huden og neuroner i live, kan sensoriske receptive felter probes ved at optage elektriske signaler fra cellen kroppen (dvs. soma) af sensoriske neuroner i respektive abdominal ganglion i CNS. Derved kan man vurdere følsomheden af de sensoriske slutninger ved at anvende varierende grader af kraft på huden og kortlægge receptive områder: let berøring, tryk og skadelige (smertefulde) stimuli 20,21.
En fordel ved denne igle præparat ganglion-hud er, at en CAn tegne anatomisk den receptive felt kort og spore neuronale processer til den identificerede neuron, når de elektriske reaktioner bliver registreret. De tre leech nedenfor beskrevne eksperimenter kan alle være afsluttet flere gange med et enkelt eksemplar, hvilket gør dette en omkostningseffektiv undervisningsmodul til akademiske laboratorier.
Protocol
1.. Fremstilling af elektroder og saltvandsopløsning
- Forbered fysiologisk saltvand og elektroderne før dyret dissekeres. Leech Ringers opløsning består af følgende: 115,3 mM NaCl, 1,8 mM CaCl2, 4,0 mM KCI, 10 mM Tris / maleinsyre eller HEPES. PH justeres til 7,4.
- Forbered en Ag-Cl tråd ved at dyppe en renset sølvtråd i en lille mængde af blegemiddel i 20 minutter eller indtil tråden har en glat mørkegrå finish. Vask ledning med destilleret vand inden brug. Derefter placere tråden i en mikropipette holder, der sættes i forstærkeren.
- Forbered en skarp glas elektrode i borosilikatglas ved hjælp af en pipette aftrækker. Den elektrode modstand bør være i størrelsesordenen af 20 MOhm.
- Efterfylde pipetten med 3 M kaliumacetatopløsning og indsætte i ind mikropipette holderen.
- For et ekstracellulært elektrode forberede en skarp glaspipette som beskrevet ovenfor, bryde spidsen tilbagegnide en anden skarp pipette nær den skarpe kant. Så fyre polere spidsen, så den ikke rive connectives. Plastic ekstracellulære elektroder vil også virke, så længe der er god kontakt mellem elektroden og nerve.
- Sæt ekstracellulære elektrode i en mikropipette holder (med Ag-Cl tråd), som er udstyret med en gummislange og sprøjte til sugning. Brug sprøjte til at udtrække saltvand ind i elektroden i det mindste niveauet af sølvtråd.
- Opsætte hardwaren (forstærker og stimulus isolator) og software indspilningsparametre ved at følge vejledningen til din specifikke signal optageenhed. Se Leksrisawat et al. 22 for at se detaljer om udstyr, der anvendes i forsøgene beskrevet nedenfor.
2. Ventral Gangliet Dissection
- Dissekere igle i et stort silicone elastomer-foret fad med igle Ringers opløsning. Hvis dyret er strakt i længderetningen vilvære lettere at fjerne den ventrale nerve ledning (se figur 1A).
- Med nr. 10 eller nr. 11 størrelse skalpel en langsgående snit med meget lavvandet nedskæringer i den ventrale midterlinjen. Omkring midten 2/3rd ventrale snit er vist i figur 1B. Prøv ikke at skære igennem den sorte strømpe (ventrale blod sinus), indtil dyret er helt åben og blodet sinus strækkes uden knæk. Dette blod sinus løber længden af dyret langs den ventrale midterlinie. VNC er indeholdt inde i denne blodkar.
- Når huden er blevet skåret den fulde længde af dyret bruge de fine iris saks til nick blod sinus (Figur 2). Slip en klinge af de fine iris saks under sinus og lidt hæve bladet for at adskille den fra nervevæv. Skær sinus længden af VNC samtidig undgå nerve rødder, segmenter nerver, eller connectives mellem ganglier.
- Dernæst fjerner en del af den ventrale nerve ledningen vedskære rødderne distale hvor blodkarret slutter rødderne. Gentag denne proces for hver ganglion langs længden af den ventrale nerve ledningen.
- Overfør et segment af en eller to ganglier til en mindre petriskål. Ganglier eller enkelt ganglion skal pinned stramt med nogle slap.
- Pin connectives og rødderne så ganglion glial kappe er let strakt at forhindre neuron celle organer fra at flytte rundt, når spidde gennem glial kappe og ind i neuron af interesse. Stifterne skal placeres ved den sorte sinus for rødderne og i midten af de to connectives at minimere beskadigelse af axoner (fig. 3).
- Placer petriskålen med forberedelse under lup og fastgør den med voks i bunden af skålen for at forhindre bevægelse.
- Forsigtigt fokusere lysstrålen ved hjælp af et spejl og kondensatoren se neuroner i figur 4A (skematisk vist i figur 4B
- For at gøre en intracellulær optagelse af Rz, T, P og N neuroner omhyggeligt placere spidsen af elektroden over cellen af interesse og sænk forsigtigt spidsen, indtil en forsænkning ses i glial kappe.
- Tryk elektrode holderen eller manipulator (meget forsigtigt), så elektrode tip "popper" ind i cellen af interesse.
- Injicer korte pulser (30-40 millisekunder) af positiv strøm (1-10 nA) i cellen til at fremkalde virkningspotentialer.
3. Dyrkning af neuroner fra den ventrale ganglion Fremstilling
- Nål ganglier ventrale side op i en ren skål indeholdende L-15 med føtalt kalveserum (FCS) (figur 3). Pin rødder således at ganglier let strakt som udført ovenfor for intracellulære optagelser. Med fine sakse, nick glial kapslen i den ene ende, glider en saks kniv under kapslen, derefter skæres på tværs af glial kapselsom vist i figur 5A.
- Tilsæt 100 ul portion af Collagenase / Dispase til fadet og sted på en shaker i 15 min. Undersøg cellerne ved at flytte dyrkningsmedier omkring de udsatte cellelegemer. Retur cellerne et rysteapparat i yderligere 15 minutter eller længere, indtil cellerne kommer ud med minimal sugning.
- Anvend en pipette fastgjort til en sprøjte til forsigtigt at ekstrahere celler fra ganglion. Fire polere pipettespidsen, så den er lidt større end cellen kroppen diameter. For Rz-celler i en voksen igle diameter bør være ca 50 um.
- Forbered en række af pipetter med forskellige diametre uden en glødetråd, da dette mindsker chancerne for de celler, der stikker inde i pipetten. Opbevar pipetterne i en flaske, der indeholder 80% ethanol (EtOH) ved hjælp af et stykke vat i bunden for at beskytte tips fra chipping. Husk at vaske EtOH ud af pipetten med medium før opsugning af celler.
- Efter enzymet behandling, vask detenzymholdige medium med L-15 (FCS) 2x. Identificer cellerne af interesse og forsigtigt trække dem ind i pipetten ved at trække sprøjten (figur 6A). Aflad de aspirerede celler ind i en anden skål, som indeholder L-15 (med FCS).
- Indtil nu alle procedurer var ikke-sterile. Udfør følgende trin i en steril hætte. Placer 3-4 store dråber steril L-15 (med FCS) på forskellige steder inde i en steril petriskål.
- Pipette cellerne i en af de før-nævnte dråber, blæser dem rundt i drop at vaske dem. Gentag dette i serie 3 eller 4 dråber af medium.
- Placer celler i en ren petriskål fyldt med L-15 (FCS).
- Inkubér cellerne i 1-24 timer ved stuetemperatur. Bagefter de rene celler kan belagt. Ved at lade cellerne i et par timer eller natten over den ekstracellulære matrix kommer nemt. Plate cellerne straks at generere længere processer.
- Anvend sterilt substrat til at belægge en mikrobrønd di sh og lad det tørre helt (natten), før dyrkning eksperimenter.
- Når skålen er blevet belagt, vaske skålen forsigtigt med sterilt vand og derefter med en lille mængde af L-15-medium. Husk at bruge L-15 løsning uden FCS tilføjet for at tillade cellerne at holde sig til fadet. Mediet kan forsigtigt ændres til L-15 med FCS efter at cellerne er klæbet til substratet. Hvis cellerne skal anvendes nogle få timer efter udpladning, derefter skifte mediet for L-15 med FCS er ikke nødvendig.
- Placer celler ved siden af hinanden på udpladningstidspunktet at inducere hurtig synaptogenesen (figur 6B). Efter 24 timer foranstaltning fysiologisk aktivitet i parringer af neuroner.
- Brug intracellulære elektrofysiologiske teknikker til at optage RP eller synaptiske reaktioner i dyrkede par af celler (stimulere 1 neuron gennem en intracellulær elektrode og registrere svar fra den parrede celle ved hjælp af en 2. intracellulær elektrode).
- Nål agterliget dorsalsiden ned i en som beskrevet ovenfor elastomer-foret fad.
- Pin huden på den ene side med rødder på den anden side af afhuggede ganglion (figur 7A, forstørret i figur 7B) eller gøre et vindue på den ventrale aspekt af igle over en ganglion (figur 7C) med alle rødderne til kroppen væg intakt.
- Efter opnåelse af en stabil intracellulær optagelse i en af de sensoriske celler (T, P, N) benytter et lille glas stang, der har været brand poleret lige rører huden i samme segment. Hvis neuron, der optages fra, er en N-celle så mere pres bliver nødt til at blive anvendt på huden. I de fleste tilfælde vil N cellen kun reagere, hvis huden er klemt med en pincet. Af denne grund er disse celler bør være forsøgt sidste, som man kunne skade huden eller fortrænge den intracellulære omkodning ved at forstyrre præparatet på en sådan måde.
- Man skal værestand til hurtigt at skitsere huden og ganglion med detaljer tilstrækkelig nok til, at et kort over hvor rørt kan anvendes til at bestemme det receptive felt for en bestemt neuron. Efter optagelsen fra så mange T og P-celler som muligt på begge sider af et ganglion prøve N celler.
- For at undersøge, om de sensoriske neuroner har processer, der rejser gennem connectives i en rostral eller kaudal måde og derefter ud rødderne i det tilstødende segment på huden, kan connectives mellem ganglier skæres og de receptive felter gennemgået i forhold til den spredning af afsløring. Dybest set den ene er at undersøge, om der har været tab på den receptive felt.
5.. Injektion af fluorescerende farvestoffer
- Forbered en igle ganglion som beskrevet ovenfor.
- Fyld en mikroelektrode med en opløsning af Lucifer gul-CH (3,0%) og lithiumchlorid (300 mM).
- Spidde en af de sensoriske celler eller Rz celler på den ventrale side af ganglion som beskrevetovenfor.
- Injicer farvestof i cellen ved at passere negativ strøm (3NA) gennem elektroden i 15 min. Indstil pulsvarigheden til 100 ms, og frekvensen til 2 Hz.
- Visualiser dye-fyldte neuroner ved spændende farvestoffet med en kviksølv lampe og et FITC / GFP filter sæt.
Representative Results
Intracellulære optagelser fra sensoriske neuroner i agterliget ganglion er kendetegnet ved deres distinkte spænding-tid spor vist i figur 4C. Den hvilende potentiale cellemembranen hos raske igle ganglieceller er -45 til -60 mV. Hvis potentialer er mindre (mindre negativ) man bør ændre glaselektrode, eller hvis potentialet er fortsat lav, gå videre til et andet segment af nerve ledningen. Spontane virkningspotentialer med lille amplitude kan indikere, at elektroden er i en motor neuron. Hvis dette sker i ganglion-kropsvæggen en aktuel injektion kan bruges til at bestemme, om neuron innerverer nogen af de muskler stadig er fastgjort til huden. Annulus opstilleren motorneuroner (AE) er på den ventrale side af ganglion (figur 4B), og det vil medføre ringåbningerne (kamme eller segmenter) til at stige ved at aktivere den ringformede opstilleren muskel.
Injektion strøm ind i de sensoriske celler bør fremkalde handling potentiales med de karakteristiske kurver vist i figur 4C. Hvis bølgeformer se anderledes det kunne være på grund af en skæv bro eller forskudt kapacitans kompensation. Man bør konsultere manualen, der følger med købet signal enhed for oplysninger om, hvordan at afbalancere broen inde i en celle. Bemærk de stimulerende artefakter i begyndelsen og slutningen af de aktuelle impulser i figur 4C. Dette er, hvordan artefakterne ser ud, når broen er afbalanceret.
Primære kulturer af neuroner fra agterliget ganglion danner elektriske og kemiske synapser i fadet. I første omgang de elektriske egenskaber af de dyrkede celler ikke er præcis de samme som de er in vivo. Men efter et par dage impulserne er næsten ikke skelnes fra dem, der er optaget i ganglion. Dette er demonstreret i figur 6C med et par Rz celler. Efter 7 timer i kultur amplituden af synaptiske potentialer var 1-2 mV. Efter 56 timers i kultur synaptic potentialer var større end 10 mV (top spor i figur 6C). Formen af aktionspotentialet skifter også efter 56hr i kultur. Under de beskrevne betingelser disse celler er levedygtige i flere dage.
Intercellulære kommunikation kan påvises ved at stimulere nerve rødder eller connectives og optagelse fra neuroner i ganglion. Stimulering disse nerver genererer robuste synaptiske potentialer og handling potentialer i forskellige gangliecellerne. Spor i figur 8B blev registreret fra en Retzius celle i en ganglion, der var blevet fjernet fra dyret og fastgjort i en skål. Den sorte spor blev fremkaldt af en subthreshold stimulus påføres med en ekstracellulær elektrode til bindevæv. Forøgelse af stimulus spænding forårsaget cellen at affyre en handling potentiale (rød trace). Fluorescerende farvestoffer eller peberrodsperoxidase kan injiceres ind i disse celler for at studere deres morfologi. Lucifer gul blev injiceret i en Rzneuron ved at lede en negativ strøm gennem elektroden. Et alternativ er at injicere farvestoffet ved hjælp af pust af lufttryk. 9A viser farvestoffet kort efter injektionen begyndte. Tredive minutter senere farvestoffet allerede var diffunderet ind nerverødderne (figur 9B). Den type af farvestof afhænger af anvendelsen, fx lavmolekylære farvestoffer, der kan passere gennem gap junctions anvendes til at identificere elektriske synapser.
Figur 1. . Ventral igle dissektion (A) Dyret er grundigt fastgjort ventrale side op i fyldt med igle saltvand en elastomer-foret fad (B) En lavvandet snit spænder den forreste:. Posterior akse er lavet bare lateral til midterlinjen for at undgå at beskadige nerven ledningen. Den sorte blod sinus (som contains den ventrale nerve ledning) let kan ses. Bemærk den ene udsatte gangliet der er hvid i forhold til hylsteret. Klik her for at se større billede .
Figur 2. Dissektion af den sorte sinus. Blodkarret (pil) bør omhyggeligt skåret på den ene side for at blotlægge den ventrale nerve ledning (dobbelt pil). Lad segmenter af blodkar intakt omkring segmenter rødder til brug som et håndtag til at manipulere den ventrale nerve ledning, når der overføres mellem dissektion og optagelse retter. Klik her for at se større billede .
Fig. 3. Isoleret del af den ventrale nerve ledningen. Pinning ventrale nerve ledningen ved blodkarrenes fragmenter forbliver på de enkelte segmenter rødder og ved enderne af de enkelte segmenter connectives udsætter ganglier for elektrofysiologiske optagelser. En stram strækning af ganglierne tillader en at se identificerbare celle organer og vil give en lettere indtrængning af glial kappe med en skarp glas elektrode. Klik her for at se større billede .
Figur 4.. Cellulær anatomi agterliget ganglion. (A) Ideelt Retzius celler (R) og andre store celle organer (P-pressure, vil T-touch, N-nociceptive, AE-annulus erector) være klart synlig, hvis mikroskop og lys kondensator er korrekt sat op. (B) Skematisk visning af celler i ganglion. Små forskelle i placeringen af SOMA vil forekomme i hver ganglion grundet hvordan ganglion strækkes og bandt stramt. (C) Action potentialer optaget fra soma af disse neuroner har karakteristiske kurver. Disse spikes blev fremkaldt ved injektion af positiv strøm ind i cellen (firkantet puls overlejre spænding-tid spor). Klik her for at se større billede .
Figur 5. Desheathing ganglion at fjerne individuelle cellelegemer. (A) glial kappebør nøje tværs ganglion at undgå skadelige celler af interesse. Den røde linje angiver et snit for at undgå at ramme soma af RZ neuroner. Åbning af kappe giver fordøjelsesenzymer adgang til bindevæv matrix. (B) Sunde celle organer svulmende ud af ganglion efter glial kappe er blevet åbnet. Klik her for at se større billede .
Fig. 6. Dyrkning neuroner fra iglen ganglion. (A) Celler suget fra ganglion ved hjælp af en mikropipette og overføres til en skål indeholdende kulturmedium. (B) Placering flere celler i nærheden af hinanden, vil øge hastigheden af synaptogenesen mellem identificerbare neuroner. Her stuparlamentsmedlemmer af to neuroner har dannet en synapse. (C) neuroner i kultur udviser lidt forskellige elektriske egenskaber. De øverste spor viser synaptiske potentialer, som fremkaldes ved at stimulere den tilstødende celle 7 timer og 56 timer efter cellerne blev belagt. De nederste spor blev fremkaldt ved injektion af strøm direkte ind i en af Rz celler. Bemærk stigningen i synaptisk potentiale amplitude og ændre i aktionspotentialet bølgeform efter 56 hr i kultur. Klik her for at se større billede .
Figur 7. Agterliget ganglion-krop forberedelse væggen for kortlægning receptive felter. (A) En fremgangsmåde er at fjerne en hel del af kroppen væggen sammen med 1-3 ganglier. Her rødderne på den ene side have b.een snit og ganglion er blevet pinned ud til siden. (B) Et pinned ud ganglion ved højere forstørrelse. (C) En anden tilgang er at skabe et lille vindue i kroppen væggen og optage fra den intakte ganglier mens kortlægning et modtageligt felt . (DG) Hver af de sensoriske neuroner udviser en karakteristisk reaktion på en mekanisk stimulus. (D) Et let tryk fremkalder aktivitet i T-celler, men ikke i P eller N-celler. (E) T-celle-respons lukker som reaktion på stærkere stimuli, vigepligt til aktivering af P-celle. Som stimulus bliver stærkere N cellerne bliver aktiveret (FG). Klik her for at se større billede .
Figure 8. Evoked aktivitet i igle ganglion. Ekstracellulær stimulering af connectives kan anvendes til at drive synaptisk transmission i nerve ledningen. (A) Dette gøres ved at montere en suge elektrode til en af de connectives og anvendelse af en lille spænding. Den skarpe glas elektrode (pil) kan ses spidde en Retzius celle i ganglion. (B) Spænding-tid spor viser stimulus artefakt efterfulgt af en synaptisk potentiale (sort) og en handling potentiale (rød). Klik her for at se større billede .
Figur 9. Injektion farvestof i igle neuroner. (A) Lucifer gul kan injiceres i soma ved at lede strøm through optagelsen mikroelektrode. En kviksølv lampe og FITC-filter sæt kan derefter bruges til at visualisere fluorescens. (B) Dye er diffunderet ind i Rz axoner omkring 30 minutter efter injektionen. Klik her for at se større billede .
Discussion
Formålet med dette sæt eksperimenter var 1) at undervise og udstille de grundlæggende principper for intracellulære optagelser fra identificerbare neuroner og 2) at genkende de karakteristiske figurer af elektriske signaler, der kan opstå fra disse særlige neuronale typer ved brug voksne igler. Der er en rig historie af undersøgelser ved hjælp agterliget for neurofysiologiske undersøgelser og forskning er i gang i håndteringen spørgsmål om neurale kredsløb og genregulering under udvikling såvel som i løbet af synaptisk reparation og regeneration 10. Neuromodulation, navnlig gennem biogene amin veje, har også været en succesfuld forskning retning i agterliget. Ved at tilføje dopamin og andre farmakologiske midler til nervesystemet gennem saltvandsopløsning, er det blevet vist, at dopamin modulerer neurale netværk, der er involveret i beslutningsprocessen 23 og motoriske mønstre for kravlende adfærd 24,25. Denne eksperimenterende tilgang er en forenkletle (og billig) måde at indarbejde graduering i undervisningen laboratorium, og justere den ioniske makeup af saltopløsningen er en effektiv måde at lære Nernst og Goldman-Hodgkin-Katz ligninger.
Hvis det skal lykkes med ganglion forberedelserne er det vigtigt at have den ganglion stram inden du forsøger at stikke en soma med en intracellulær elektrode. Ellers soma bevæge sig, når man trykker ned på glial pakke. Hertil kommer, når desheathing ganglion til at fjerne neuroner for kulturen, undgå området af interesse, når der skæres på tværs af ganglion så SOMA ikke beskadiges, når de er fjernet. Desuden kan overdreven inkubering i enzymerne resultere i neuronerne være for skrøbelige til at blive fjernet. Det kræver nogle trial and error til at opnå en ideel inkubationstid, fordi hver batch af enzymer er lidt anderledes i deres handlinger.
Yderligere undersøgelse for at optimere dyrkningsmedier kunne forbedre denne teknik. Variskellige faktorer, såsom tilstedeværelsen af insulin, sukker eller vækstfaktorer kunne undersøges for længere opretholdelse af kulturer. At afgøre, om cellerne opretholder deres evne til at syntetisere sendere, såsom serotonin syntese i Rz celler, neutral rød farvning anvendes til at mærke serotonerge processer. Også microglial invasion til tilskadekomne og regenerere væv kan kvantificeres ved nukleare pletter dage efter en skade.
Selv om dette præparat har mange fordele at tilbyde i at undersøge regenerering og reparation samt neurale kredsløb, farmakologiske og molekylær identifikation af de forskellige receptorsubtyper ved synapser er ikke blevet fuldt karakteriseret. En udtrykt sekvens tag bibliotek er tilgængelig 26 og medicinske igle genom øjeblikket samlet 27, men den vigtigste begrænsning igle sammenlignet med nogle model præparater er evnen til at modificere genomet selektive gener i specifikke celletyper. Med embryoner thans begrænsning er blevet behandlet ved at injicere DNA eller dsRNA til at regulere genekspression 28. Genkanonen teknik er for nylig blevet anvendt til at udtrykke hvirvelløse connexin (innexin) proteiner i igle neuroner. Udtryk for en innexin fra Hirudo verbana (hve-inx6) er tilstrækkelig for dannelsen af ektopiske gap junctions i den medicinske igle 29. Den medicinske igle-eller H. verbena, da det var 30 er sikker på at fremme vores forståelse af fysiologi og evolution af elektriske synapser i de kommende år.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris/maleic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
| Collagenase/Dispase | Boehringer Mannheim | 269-638 | |
| Leibovitz L-15 with L-Glutamine | Gibco | 041-01415H | |
| Fetal calf serum | Ready Systems Ag | ||
| 04-001 | |||
| D-Glucose-Monohydrate | Merck | 8342 | |
| Gentamycin sulfate | any supplier | 10 mg/ml | |
| Glutamine | Gibco | 043-0503H | |
| HEPES | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
| Concanavalin A Type IV | Sigma | C 2010 | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma | P 7890 | MW 15-30,000 |
| Microwell plate, 60 x 10 μl | Falcon | 3034 | Flat bottom, 10 in a bag |
| Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
| Intracellular electrode probe | |||
| Faraday cage | |||
| Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Dissecting microscope (100X) | |||
| Fiber optic lamp | |||
| Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
| Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, Suction electrodes |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
| Raised preparation stand | |||
| Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
| Computer | any company | ||
| AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
| PowerLab 26T |  AD Instruments |
27T | |
| Head stage | AD Instruments |
Comes with AC/DC amplifier | |
| LabChart7 | AD Instruments |
||
| Electrical leads | any company | ||
| Glass tools | make yourself | For manipulating nerves | |
| Cable and connectors | any company | ||
| Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
| Beakers | any company | ||
| Wax or modeling clay | any company or local stores | ||
| Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
| Plastic tip for suction electrode | local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size. |
References
- Fuchs, P. A., Nicholls, J. G., Ready, D. F. Membrane properties and selective connexions of identified leech neurones in culture. J Physiol. 316, 203-223 (1981).
- Ready, D. F., Nicholls, J. Identified neurones isolated from leech CNS make selective connections in culture. Nature. 281, 67-69 (1979).
- Blackshaw, S. E. Neurobiology of the Leech. Muller, K. J., Nicholls, J. G., Stent, G. S. , Cold Spring Harbor Laboratory. 51-78 (1981).
- Drapeau, P., Sanchez-Armass, S. Parallel processing and selection of the responses to serotonin during reinnervation of an identified leech neuron. J Neurobiol. 20, 312-325 (1989).
- Garcia, U., Grumbacher-Reinert, S., Bookman, R., Reuter, H. Distribution of Na+ and K+ currents in soma, axons, and growth cones of leech Retzius neurones in culture. J. Exp. Biol. , 1-17 (1990).
- Cooper, R. L., Miguel Fernandez, de, Adams, F., B, W., Nicholls, J. G. Synapse formation inhibits expression of calcium currents in purely postsynaptic cells. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. , 217-222 (1992).
- Liu, Y., Nicholls, J. Steps in the development of chemical and electrical synapses by pairs of identified leech neurons in culture. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. , 236-253 (1989).
- Fernandez de Miguel, F., Cooper, R. L., Adams, W. B. Synaptogenesis and calcium current distribution in cultured leech neurons. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. 247, 215-221 (1992).
- Briggman, K. L., Kristan, W. B. Multifunctional pattern-generating circuits. Annu. Rev. Neurosci. 31, 271-294 (2008).
- Macagno, E. R., Muller, K. J., Deriemer, S. A. Regeneration of axons and synaptic connections by touch sensory neurons in the leech central nercoys system. J. Neurosci. 5, 2510-2521 (1985).
- Becker, T., Macagno, E. R. CNS control of a critical period for peripheral induction of central neurons in the leech. Development. 116, 427-434 (1992).
- Marin-Burgin, A., Kristan, W. B., French, K. A. From Synapses to behavior: Development of a sensory-motor circuit in the leech. Dev. Neurobiol. 68, 779-787 (2008).
- Kristan, W. B. The Neurobiology of Swimming in the leech. Trends Neurosci. 6, 84-88 (1983).
- Brodfuehrer, P. D., Friesen, W. O. From stimulation to undulation: a neuronal pathway for the control of swimming in the leech. Science. 234, 1002-1004 (1986).
- Arbas, E. A., Calabrese, R. L. Slow oscillations of membrane potential in interneurons that control heartbeat in the medicinal leech. J. Neurosci. 7, 3953-3960 (1987).
- Ching, S. Synaptogenesis between identified neurons. , McGill University. (1995).
- Kristan, W. B., Eisenhart, F. J., Johnson, L. A., French, K. A. Development of neuronal circuits and behaviors in the medicinal leech. Brain Res. Bull. 53, 561-570 (2000).
- French, K. A. Gap junction expression is required for normal chemical synapse formation. J. Neurosci. 30, 15277-15285 (2010).
- Li, Q., Burrell, B. D. Two forms of long-term depression in a polysynaptic pathway in the leech CNS: one NMDA receptor-dependent and the other cannabinoid-dependent. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Behav. Physiol. 195, 831-841 (2009).
- Nicholls, J. G., Baylor, D. A. Specific modalities and receptive fields of sensory neurons in CNS of the leech. J. Neurophysiol. 31, 740-756 (1968).
- Yau, K. W. Receptive fields, geometry and conduction block of sensory neurones in the central nervous system of the leech. J. Physiol. 263, 513-538 (1976).
- Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. Muscle receptor organs in the crayfish abdomen: a student laboratory exercise in proprioception. J. Vis. Exp. (45), e2323 (2010).
- Crisp, K. M., Mesce, K. A. Beyond the central pattern generator: amine modulation of decision-making neural pathways descending from the brain of the medicinal leech. J. Exp. Biol. 209, (2006).
- Puhl, J. G., Mesce, K. A. Dopamine activates the motor pattern for crawling in the medicinal leech. J. Neurosci. 28, 4192-4200 (2008).
- Crisp, K. M., Gallagher, B. R., Mesce, K. A. Mechanisms contributing to the dopamine induction of crawl-like bursting in leech motoneurons. J. Exp. Biol. 215, 3028-3036 (2012).
- Macagno, E. R., et al. Construction of a medicinal leech transcriptome database and its application to the identification of leech homologs of neural and innate immune genes. BMC Genomics. 11, 407 (2010).
- Kandarian, B., et al. The medicinal leech genome encodes 21 innexin genes: different combinations are expressed by identified central neurons. Dev. Genes Evol. 222, 29-44 (2012).
- Shefi, O., Simonnet, C., Groisman, A., Macagno, E. R. Localized RNAi and ectopic gene expression in the medicinal leech. J. Vis. Exp. (14), e697 (2008).
- Firme, C. P., Natan, R. G. 3rd, Yazdani, N., Macagno, E. R., Baker, M. W. Ectopic expression of select innexins in individual central neurons couples them to pre-existing neuronal or glial networks that express the same innexin. J. Neurosci. 32, 14265-14270 (2012).
- Siddall, M. E., Trontelj, P., Utevsky, S. Y., Nkamany, M., Macdonald, K. S. Diverse molecular data demonstrate that commercially available medicinal leeches are not Hirudo medicinalis. Proc. Biol. Sci. 274, 1481-1487 (2007).
