הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Culturing של אדם תאי אפיתל באף בממשק האוויר הנוזלי

37.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50646

⸱

8 באוקטובר 2013

 ,  ,  ,  , 
1Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Pediatrics, The University of North Carolina at Chapel Hill, 3Pulmonary Diseases and Critical Care, The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Curriculum in Toxicology, The University of North Carolina at Chapel Hill

במאמר זה

סיכום

תאי אפיתל באף, שהושגו באמצעות ביופסיה לגרד שטחית של מתנדבים אנושיים, הם התרחבו ומועברים על גבי מוסיף בתרבית רקמה. בהגיעם confluency, תאים גדלים בממשק נוזל האוויר, מניב תרביות של תאי ריסי ולא ריסי. תרביות תאי אפיתל באף מובחנות לספק מודלים ניסויים מעשי ללימוד הרירית בדרכי הנשימה.

תקציר

במודלים של מבחנה באמצעות תאי האפיתל אנושיים עיקריים חיוניים בהבנת פונקציות עיקריות של האפיתל בדרכי הנשימה בהקשר של זיהומי חיידקים או סוכנים בשאיפה. השוואה ישירה של תאים המתקבלות מאוכלוסיות חולות מאפשרת לנו לאפיין פנוטיפים שונים ולנתח את מנגנוני תיווך שינויים בתפקוד תאי אפיתל. Culturing תאי האפיתל מאזור tracheobronchial האנושי תועד היטב, אך מוגבל על ידי הזמינות של רקמה אנושית ריאות או הפולשנות הקשורים בקבלת ביופסיות מברשות הסימפונות. מתקבלים תאי אפיתל באף באמצעות ביופסיות לגרד באף שטחיות הרבה פחות פולשנית ויכולים להיות ביופסיה נושאים מספר פעמים ללא תופעות לוואי משמעותיים. בנוסף, האף הוא נקודת הכניסה למערכת הנשימה, ולכן אחד מהאתרים הראשונים שנחשפו לכל סוג של לחץ באוויר נישא, כגון סוכני חיידקים, מזהמים, או אלרגנים.

בקצרה, תאי אפיתל באף שהתקבלו ממתנדבים אנושיים מורחבים על צלחות תרבית רקמה מצופים, ולאחר מכן מועברים על גבי מוסיף תרבית תאים. בהגיעם confluency, תאים ממשיכים להיות מתורבת בממשק האוויר הנוזלי (עלי), למשך מספר שבועות, שיוצרים יותר מבחינה פיזיולוגית תנאים רלוונטיים. מצב תרבות ALI משתמש בתקשורת מוגדרת מובילה לאפיתל הבדיל שמפגין מאפיינים מורפולוגיים ופונקציונליים דומים לאפיתל באף אדם, עם תאי שני ריסי וריר ייצור. מוסיף תרבית רקמה עם תאי אפיתל באף מובחנים ניתן להשפיע במגוון דרכים בהתאם לשאלות המחקר (טיפול עם סוכנים תרופתיים, התמרה עם וקטורי lentiviral, חשיפה לגזים או זיהום עם סוכני חיידקים) וניתחתי עבור נקודות קצה שונות ומשונות החל מסלולים תאיים ומולקולריים, ch הפונקציונליAnges, מורפולוגיה, וכו '

במודלים של מבחנה של תאי אפיתל באף אנושיים מובחנים יאפשר לחוקרים לכתובת חדש ושאלות מחקר חשובות על ידי שימוש במודלים ניסיוניים organotypic כי במידה רבה לחקות את האפיתל האף in vivo.

מבוא

מטרה של הטכניקה

תאי אפיתל (ECs) בדרכי הנשימה הם בין האתרים הראשונים שנחשפו באופן ישיר ללחץ סביבתי בשאיפה, כגון פתוגנים, אלרגנים או מזהמי אוויר. ECs יותר ממכשול מבני: הם מתנהגים כמו מרכזייה ליזום ולווסת את התגובה החיסונית בדרכי הנשימה 1-3 באמצעות השחרור של מתווכים מסיסים 4-6 ואת הביטוי של ליגנד / קולטנים על surfac 7-9. בעוד שניתן להשתמש שורות תאים הנציחו כמודלים ללמוד ECs נשימה במבחנה, הם אינם מצליחים להתמיין לאוכלוסיות תאים הטרוגנית מורכבות מריסים מקוטבים ותאי ריר ייצור, בדומה למה שרואה בגוף חי. כדי לשחזר מאפיינים חשובים של אפיתל הנשימה נצפה in vivo, ניתן להשתמש ECs דרכי הנשימה העיקרי. לכן, המטרה שלנו הייתה לייעל את השיטה שלנו תוך ניצול האף ECS (NECs) המתקבלת ממתנדבים אנושיים. NECs מורחבים ותרבית במבחנה, מניב מודל תרבית תאים של NECs המובחן אשר מחקה רבות מהתכונות של אפיתל האף ראה in vivo.

רציונל

השימוש במודלים חוץ גופית עם ECs האנושי העיקרי מחקה במצב vivo - כפי שתואר במחקר זה - נותן אפשרויות ייחודיות ללמוד את הבדלי מחלה ספציפיים של ECS, פרמטרים פיסיולוגיים הקשורים לאפיתל דרכי הנשימה, או האינטראקציות בין ECS ו סוגי תאים אחרים, כגון תאים דנדריטים 10, תאים טבעיים רוצח 11 או מקרופאגים. שיטות קיימות כמה לנצל ECs הסימפונות, אשר ניתן להשיג פולשני באמצעות ביופסיות מברשת במהלך bronchoscopies, או מרקמת ריאה שהושלכה אחרת 12-17. בנוסף, מקורות מסחריים כדי להשיג תרביות תאי אפיתל דרכי הנשימה אנושית מובחנות באופן מלא קיימים (מודל EpiAirway מMatTek, אשלנד, MA, CloneticsמLonza, באזל, שוויץ, MucilAir מEpithelix סארס, ז'נבה שוויץ), שבו חוקרים יכולים לבחור מתורמים שונים. עם זאת, בגלל המאגר המצומצם של תאים זמינים מסחרי אפיתל, מוגבלים או סט קבוע של פרמטרים, העלות כרוכה בהשגה באופן מסחרי בדרכי הנשימה אנושיות ראשוניות ECS, והגישה המוגבלת לרקמת ריאה שהושלכה או רקמת ביופסיה הסימפונות טריים הושגה אנושית, אוסרים על חוקרים רבים ממנהלת מחקרים בECs נשימה האנושית המובחן באופן מלא. לכן, אנו יצאנו לפתח טכניקה ש1) לנצל NECs אדם הלא פולשני הושג, 2) מספק פרוטוקול מניב תרבויות של אפיתל דרכי הנשימה אנושית המובחן, ו3) להיות לשעתקו ברוב הגדרות מעבדה עם תשתית תרבית רקמה הקיימת.

יתרונות על פני שיטות / מודלים קיימים

קבלת NECs הטרי, בהשוואה לסימפונות או דרכי הנשימה קטנה ECS, הוא הרבה פחות פולשני, פרטים יכול להיות ביופסיה מספר פעמים ללא תופעות לוואי משמעותיים, ויכולה להיות שנערכו ביופסיות לגרד באף שטחיות באוכלוסיות חולות שאחרת לא היה זכאיות לbronchoscopies הקשורות למחקר. ביופסיות לגרד שטחיות פולשנית כדי להשיג NECs מאפשרות לחוקר לקבוע מפרט תורם מראש, כולל גיל, מין, מצב מחלה, וכו 'בהתאם למטרת המחקר כדי להיות מושלם. לפיכך, בעת תכנון מחקרי חוקרים אינם מוגבלים על ידי רקמות זמינות קליני / דגימת אפיתל, לרכוש מודלים תא תרבות מובחנים יקרים מספקים מסחריים, או לימודים ברונכוסקופיה פולשנית עיצוב. בנוסף, הקלות להשיג NECs מגבירה את היכולת לבצע ניסויים בתאים מתורמים שונים, אשר משפר את האימות סטטיסטית של ממצאים שנצפו. לבסוף, האף הוא אחד האתרים הראשונים שנחשפו לכל סוג של לחץ באוויר נישא. לפיכך, יצירת organotypic במבחנה מערכות תרבות מחקות את האפיתל האף שימושיות ללימוד שאיפה של חלקיקים נגיפיים, מזהמים, אלרגן, או גזים, אשר יכול להיות מושגת בקלות על ידי שימוש במערכת תרבית תאים זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכן את כלי פלסטיק: צלחת מעיל

  1. הוספת PureCol 500 μl (1:100 דילול עם מים סטריליים) היטב בכל צלחת 12 היטב.
  2. לדגור על 37 ° C בחממה במשך 30 דקות, להסיר את PureCol ולשטוף עם זכות HBSS לפני התאים מתווספים לצלחת (ראה שלב 3.1 בהמשך).

2. קבלת וpretreating ביופסיה של NECs האדם

  1. ביופסיה לגרד באף
    1. השג ECs השטחי המצפה את האף turbinates תחת חזון ישיר באמצעות ספקולום 9 מ"מ לשימוש חוזר באף פוליפרופילן (דגם 22009) באוטוסקופ הפעלה עם ספקולום (דגם 21700). מכשיר זה מספק להדמיה אופטימלית של turbinates והגמישות של תנועה באף.
    2. לבצע ביופסיות בנושא יושב זקוף בכיסא בגב ישר עם הראש מוטה לאחור מעט או שוכב בתנוחת פרקדן על שולחן בדיקה.
    3. הכנס את ספקולום Otoscope לתוך הנחיר וturbi הנחותיםנייט דמיינו עם תאורה.
    4. הכנס מגרד תרמופלסטיים סטרילי דרך ספקולום עם הקצה הרחיב distally לחלק האחורי של חלזוני.
    5. שימוש בלחץ עדין על פני השטח הנחות של חלזוני, המגרד נמשך על פני 5x המשטח הרירי וחזר בו. שליפה מוצלחת של תאים הריריים שנערכו על ידי פעולת נימים תהיה ניכרה בכוס המגרד.
  2. הנח לדוגמא בצינור חרוטי 15 מיליליטר המכיל 8 מיליליטר של RPMI 1640, תחבורה על קרח.
  3. שימוש במלקחיים כדי לאחזר את הבדיקה, לסלק רקמה מחללית קרנף עם טפטפת P-1000, לבטל בדיקה
  4. צנטריפוגה לגלולה (4 ° C, 400 XG, 5 דקות), לשאוב supernatant (תשומת לב: היזהר שלא לשאוב את הכדור).
  5. Resuspend גלולה ב 1 מיליליטר BEGM עם 10 μl של 100x DNase 1.
  6. לדגור על RT עבור 20 דקות.
  7. צנטריפוגה (4 ° C, 400 XG, 5 דקות), לא לשאוב supernatant!

3. Seed על התאים בפלסטיק (יום 0)

  1. הסר את PureCol מהצלחת ולשטוף עם HBSS (ראה גם צעד 1.2).
  2. הוספת נפח מינימאלי של BEGM + + תקשורת (80-100 μl, עד המניסקוס של תקשורת מופיע במרכז גם) ל1-4 בארות (תלוי בגודל ביופסיה) של הצלחת המצופה.
  3. השתמש פיפטה P-1000 להסיר בזהירות את גלולה של רקמת הביופסיה מהצינור, בלי הנשיפה יותר מדי תקשורת.
  4. העבר את הכדור לאמצע הבארות, לשמור יחד הביופסיה כמו מקבץ של תאים, ולא לשבור את לעשות השעיה תא בודדת. תשואות ביופסיה טובות עד 4 בארות שניתן זורעים. שים את הצלחת לתוך תרבות רקמות חממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2,> 90% לחות יחסית).
  5. בדוק לאחר שעות כדי להבטיח שיש מספיק מדיה (מבלי להפריע את המניסקוס).
  6. Day1, 24 שעות לאחר זריעה: לאסוף את כל התאים שאינם חסיד של כל הבארות (צלחת הטיה ולאסוף תקשורת עם תאים בP-1000, גollect כל הבארות בצינור צנטריפוגות 1.5 מיליליטר).
  7. צנטריפוגה (4 ° C, 400 XG, 5 דקות).
  8. בעוד צנטריפוגה השעיה תא: להוסיף כ -250 μl של BEGM + + ו250 μl של תערובת מדיה BEGM + לתאים שנזרעו ביום: 0.
  9. חזור על שלבים 3.1-3.5 לתאים שאינם חסיד.
  10. יום 2-5: שינוי בתקשורת של התאים יומיים; להוסיף 500 תקשורת μl היטב כל אחד, להפחית את כמות BEGM + + בשלבים תקשורת (יום 2 לאחר זריעה: 125 μl BEGM + + בתוספת 375 μl BEGM +, Day3 לאחר זריעת והימים הבאים: 73 μl + תוספת + 427 μl BEGM + BEGM).

4. הרחבת התאים בצלוחיות

  1. לעקוב אחר תאים יומיים; ברגע שהם הגיעו confluency 80-90% (בדרך כלל 5-7 ימים לאחר הביופסיה, אם הם ייקחו זמן רב יותר שהם לא יגדלו בהצלחה) תאי מעלית כבא: תקשורת לשאוב בזהירות; להוסיף 500 μl של טריפסין 0.25% לכל טוב, לשמור אותם על 37 מעלות צלזיוס עד התאים מנותקים (זה בדרך כלל לוקח 2-3 דק ').
  2. הכן את הצורךed נפח של סויה שעועית טריפסין מונעי (SBTI) (750 μl לכל 1 מיליליטר טריפסין) בצינור 15 מיליליטר.
  3. לסלק תאים על ידי pipetting למעלה ולמטה שוב ושוב את פתרון טריפסין; תאים מנותקים העברה בצינור חרוטי 15 מיליליטר עם SBTI.
  4. יש לשטוף את כל הבארות בסך 1 מיליליטר HBSS, להוסיף HBSS לצינור עם התאים.
  5. צנטריפוגה לגלולה (4 ° C, 400 XG, 5 דקות), לשאוב את התקשורת, resuspend ב 1 מיליליטר BEGM + תקשורת ומערבולת הצינור.
  6. הרחב את התאים בבקבוק T25 או T75 תלוי בגודל גלולה (זה P1; כשתי בארות מחוברות להיכנס לבקבוק T75 אחד, מחוברות אחת גם היא מספיק לT25 אחד, בדרך כלל 2 בארות מחוברות להניב T75 אחד).
    1. הוספת BEGM + לצלוחיות (5 מיליליטר כל אחד עבור T75, 3 מיליליטר כל אחד עבור T25).
    2. מוסיף את ההשעיה התא לצלוחיות. העבר את צלוחיות לחממה בתרבית רקמה.
  7. 24 שעות לאחר בקבוק-זריעה: להוסיף מדיה BEGM + נוספת לצפחה (3 מיליליטר לT25, 10 מיליליטר לT75).
  8. לשמור על התאים בצלוחיות: הסר תקשורת (לשאוב מהפינה) ולהוסיף BEGM + תקשורת (5 ml/T25, 20 ml/T75). התקשורת צריכה להיות שונה בכל 2-3 ימים. לשמור על התאים בבקבוק עד שהם% ומחוברות על 80 (confluency לא יכול להיות אפילו לאורך כל הבקבוק; בדרך כלל זה לוקח בין 7-10 ימים, ואם הם לא מחוברות לאחר 10 ימים שהם לא יגדלו בהצלחה).

5. זרע על התאים ברקמות תרבות מוסיפה

  1. הסר את המדיה מהבקבוק ולהוסיף טריפסין (3 מיליליטר לT25, 4 מיליליטר לבקבוק T75).
  2. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עד התאים מנותקים (כ 2-3 דקות).
  3. הכן SBTI (750 μl לכל 1 מיליליטר טריפסין> 2.25 מיליליטר לT25, 3 מיליליטר לT75) בצינור 15 מיליליטר.
  4. לסלק תאים על ידי מקליט את הבקבוק וpipetting למעלה ולמטה ולהעביר לצינור חרוטי עם SBTI.
  5. יש לשטוף את הבקבוק עם HBSS (1 מיליליטר לT25, 2 מיליליטר לT75), מוסיף את HBSS לצינור 15 מיליליטר.
  6. סרכזתלגלולה (4 ° C, 400 XG, 5 דקות), להסיר supernatant בזהירות.
  7. הכן את הצלחות: להחליט כמה צלחות הולכים להיות seeded, לתייג את הצלחות עם דוגמאות קוד ומספר, מספר קטע (כלומר P2) ותאריך. הוסף 700 BEGM + תקשורת μl לתא הבסיסי.
  8. Resuspend התא גלולה ב 1 מיליליטר תקשורת BEGM ALI ידי vortexing הצינור.
  9. ספירת התאים עם hemocytometer (T25 בדרך כלל מייצר כ -4 מיליון תאים; T75 יכול לקבל עד 20 מיליון תאים בהתאם לאיון; להשתמש 1-2 מיליון של תאים לצלחת 12 גם אחד) ולדלל את ההשעיה התא עם תקשורת BEGM ALI לסך הנפח הדרוש לכמות של צלחות שיש זרע (1.2 x 10 6 תאים ב2.5 מיליליטר תקשורת לכל צלחת) (הערה:. אם חלק מהתאים רוצה להיות קפוא, לתייג את הצינור ולהסיר תאים כאן: אנחנו בדרך כלל להקפיא 2 x 10 6 תאים ב2 מיליליטר של הקפאת תקשורת)
  10. הוסף 200 השעיה תא μl לצד הפסגה של כל תא 12well קורנינג ללא ציפויהכנס (> זה יהיה על 80,000-150,000 תאים / הוספה; 12 transwells מ"מ עם 0.4 מיקרומטר פוליאסטר הנקבובית (terephthalate פוליאתילן (PET)) להוסיף קרום); להעביר לתוך חממה בתרבית רקמה.
  11. לאחר 24 שעות, לשנות את תקשורת הפסגה (200 בינוני הרחבת μl).
  12. שמירה על תרביות תאים: שנה את התקשורת (מדיה BEGM ALI; 700 μl basolateral ו200 פסגת μl) בכל יום אחר. מוסיף צריכה להישמר שקוע במים עד התאים ומחוברות לחלוטין (אין חורים בmonolayer נראים לעין). בהתאם למספר תא זה בדרך כלל לוקח בין 2-6 ימים, אם זה לוקח יותר זמן התאים סביר להניח שלא יהיו בת קיימא.

6. להקים אוויר נוזלי ממשק ברגע שהתאים לחלוטין מחוברות (כאשר התאים בTranswells לחלוטין מחוברות)

  1. ברגע שהתאים הם מחוברות לחלוטין להחליף גם תקשורת הפסגה וbasolateral עם תקשורת BEGM ALI בתוספת חומצה רטינואית 500nm ל48 שעות.
  2. 48 שעות לאחר הוספת החומצה הרטינואית בתוספת תקשורת BEGM ALI: הכן PneumaCult-ALI תחזוקה בינונית (הוראות היצרן הבא): חישוב נפח בינוני צורך (לצלחת אחת בדרך כלל 8.5 מיליליטר לתאים הבזליים), להוסיף לכל 1 מיליליטר PneumaCult בסיס בינוני מלא :

    מוסף תחזוקת 100x PneumaCult 10 μl
    2 μl הפרין (של פתרון מניות 2 מ"ג / מיליליטר)
    5 μl הידרוקורטיזון (של פתרון מניות 96 μl / מיליליטר).

  3. הסר את כל התקשורת ולהוסיף 700 μl תקשורת תחזוקת PneumaCult-ALI לצד basolateral בלבד (ללא בינוני בצד הקודקוד).
  4. לשמור על תרביות תאים במשך 4 שבועות בALI:
    1. לשנות את התקשורת בכל יום אחר (יום שני, רביעי ושישי בלוח זמנים עובד היטב עבורנו).
    2. אחרי שבוע אחד בALI, פעם בשבוע (ימי רביעי) משטח הפסגה הוא שטף: להוסיף 200 μl HBSS לצד הפסגה, לשמור אותם ל10 דקות בחממה, לשאוב בזהירותHBSS (השתמש 9 בפיפטה זכוכית מחוברת למלכודת האבק בארון הבטיחות הביולוגית, השתמש 200 טיפים μl על קצה פיפטה כדי לשאוב את HBSS).

הערה: טיפים שינוי בין לוחות, כמו גם לשנות את הטיפים כשהולכים ממשטח הפסגה לעומת basolateral. לאחר כ -2 שבועות בALI, תאים מתחילים להתמיין וcilia מופיע. תרביות תאים להגיע לבידול מלא לאחר כ -4 שבועות בALI.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

NECs תרבית בעקבות הפרוטוקול שתואר כאן מחדש להתמיין לשכבה הטרוגנית של ECs המורכב של תאי ריסי ולא ריסי, המייצגים את המצב vivo (איור 1). חלק מNECs המובחן הוא ריר הפקה (תאים מכתים בכחול באמצעות א.ב. / PAS, איור 1). למרות שהפרוטוקול שהוצג כאן הוא מותאם, בידול יכול להשתנות בכל הקשור להפצה של אוכלוסיות תאים הכוללות (יחסים שונים כלומר תאי ריסי: תאים מייצרי ליחה: תאים שאינם ריסי) או אפילו להניב אפיתל קשקש יותר. וריאציות אלו יכולות להיות ת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ECs הנשימה לספק לא רק מכשול פיזי כדי להגן על גוף האדם מפני גירויים אקסוגניים 20, אלא גם לפעול כמרכזייה ליזום ולווסת את תגובות הגנה חיסונית בדרכי הנשימה 1-3 באמצעות הפרשה של מתווכים מסיסים או תאי תאי אינטראקציות רצפטור ליגנד ישירים. כדי ללמוד עוד יותר את תפקידו של ECs בתגובה החיסונית, לבחון הבדלים אפשריים בין ECs מאוכלוסיות חולות, או כדי לחקור את ההשפעות של לחצים אקסוגניים על ECS, חשוב לסכם את מצב in vivo. דרכי הנשימה האנושית מכילה יותר מ -40 סוגי תאי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים מבקשים להודות לליזה Dailey לתשומות מועילות.

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (ES013611 וHL095163), דיילת מכון מחקר רפואי (FAMRI), והסוכנות להגנת הסביבה (CR83346301) ומצהירה שאין ניגוד העניינים. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות. למרות שהמחקר המתואר במאמר זה כבר מומן בחלקו על ידי המשרד להגנת הסביבה בארה"ב דרך CR83346301 הסכם שיתוף פעולה עם המרכז לרפואה סביבתית, אסטמה וביולוגיה ריאות באוניברסיטת צפון קרוליינה, צ'אפל היל, זה לא היה נתון ל סוכנות עמיתים הנדרשים וביקורת מדיניות, ולכן אינו בהכרח משקף את הדעות של הסוכנות, ואין אישור רשמי צריכה להיות מוסקת. להזכיר oשמות המסחריים f או מוצרים מסחריים אינו מהווים אישור או המלצה לשימוש. לורטה Müller נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע השוויצרי עם מענק אישי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ספקולום האףWelch Allynדגם 220099 מ"מ, פוליפרוילן לשימוש חוזר
אוטוסקופ הפעלהWelch Allynדגם 21700
קובטה של תא בדיקה קרנףארלינגטון סיינטיפיקSY-96-092לכופף את ראש הקובט קצת יותר
צלחות תרבית 12 בארותקורנינג3512
מוסיף תרבית תאי ממברנה טרנסוולקורנינג3460
בקבוק תרבית רקמות 430639ו-430641T25 ו-T75 בקבוק מאוורר
RPMI 1640 מדיה (עם L-גלוטמין)Gibco11875
יישומי תאים בינוניים לצמיחת תאי אפיתל סימפונות/קנה511-500
BEGM סימפונות אפיתל גידול תאיLonzaCC-3170זה מגיע כערכה של בקבוק אחד של מדיום ובקבוקונים עם תוספי מזון.
תמיסת נתרן ביקרבונט 7.5%Gibco25080השתמש כפי שהוא.
NuSerumBD Biosciences355104להשתמש כפי שהוא.
BAMBANKER הקפאת מדיהBAMBANKER302-14681השתמש כפי שהוא.
CoolCell BiocisionHTBCS-136(מיכל הקפאת תאים ללא אלכוהול CryoPrep)
PureColAdvancedBioMatrix5005-Bלדלל 1:100 במים סטריליים (צריך להיות בערך 0.03 מ"ג/מ"ל) השתמש ב-500 μ l/well של צלחת HBSS עם 12 בארות
עם Ca2 ו-Mg2+Gibco14025
DNAse 1SigmaDN25מתמוסס ב-1.5 מ"ג/מ"ל, שהוא תמיסה פי 100, הוסף 10 μ l לכל מ"ל מדיה
טריפסין, 0.25%, 1x, עם פנול אדוםGibco25200-056השתמש בו הוא
מעכב טריפסין פולי סויה (SBTI)SigmaT6522השתמש מומס ב-HBSS בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל
חומצה רטינואיתSigmaR7632להמציא אותו 100 μ תמיסת מלאי M (ראה להלן), מדלל ל-10 μ M עם אלכוהול מוחלט, קח 5 μ l מזה ולהוסיף אותו ל-1 מ"ל מדיה BEGM (פתרון העבודה שלנו).

לרטינול All-trans יש מקדם הכחדה של 52,480 באתנול ב-325 ננומטר. ממיסים 25 מ"ג ב-50 מ"ל אתנול מוחלט. יש לבצע דילולים סדרתיים, לדלל 50 מ"ל מלאי ב -450 מ"ל אתנול מוחלט, לקחת 50 מ"ל מזה, לדלל ב -450 מ"ל אתנול מוחלט, לקחת 50 מ"ל מזה, לדלל ב -450 מ"ל אתנול מוחלט, ושוב לקחת 50 מ"ל מזה, לדלל ב -450 מ"ל אתנול מוחלט, לקחת 100 מ"ל מזה ולדלל ב 900 מ"ל אתנול מוחלט ולקרוא בספקטרופוטומטר ב -325 ננומטר, מספר זה מוכפל לאחר מכן ב- גורם דילול, ואז חלקי מקדם ההכחדה של 52,480, זה ייתן מספר במ"מ. הכינו מלאי של 100 מ"מ (אחסן ב-20 מעלות; C) וממלאי זה מכינים אליקוט של 10 מ"מ, החומצה הרטינואית היומית הדרושה תהיה 5 מ"ל של 10 מ"מ זה במדיה של 995 מ"ל ALI. דוגמה: קריאת 325 ננומטר היא 1.15. 1.15 x 10,000 (גורם דילול) / 52,480 = 0.219 = 219 מ"מ, הכינו מזה מלאי של 100 מ"מ, באתנול מוחלט.
DMEM גלוקוז גבוה (1x), נוזלי, עם L-גלוטמין ונתרן פירובטGibco11995
תמצית יותרת המוח בקרGibco13028-014משמש למדיה BEGM ALI.
ניסטטיןסיגמאN4014-50 מ"גלהרכיב תמיסה של 3.3 מ"ג/מ"ל.
סרום בקר אלבומיןפישר סיינטיפיקBP1600-100להרכיב תמיסה של 10 מ"ג/מ"ל במי milliQ.
PneumaCult-ALI mediaStemCell5001זה מגיע כערכה של בקבוק אחד של מדיום ובקבוקונים עם תוספי מזון. לפרטים ראו בהמשך.
הידרוקורטיזון StemCell7904ממיסים 2.4 מ"ג הידרוקורטיזון ב-1 מ"ל ddH2O (משמש לייצור תמיסת מלאי הידרוקורטיזון 200x)
מלח נתרן הפרין ב-PBS (2 מ"ג/מ"ל)StemCell7980השתמש בו.
צלוחיות סינון (500 מ"ל)קורנינג4310970.22 μ m נקבוביות
גודל צינורות סינון (50 מ"ל)MilliporeSCGP00525Steriflip, 0.22 μ
קצות פיפטה בגודל נקבוביות m - טיפים למחסום ARTביולוגיים מולקולריים2139RI, 2069RI, 2179RI
צינורות חרוטיים, סטריליים, 15 מ"ל ו-50 מ"ל
ddH2O, אתנול מוחלט, קרח
CO2
בטיחות ביולוגיות
(P2, P200, P1000), 9 בכפפות זכוכית
כפפות
מעיל מעבדה עם חפתים הדוקים
<גבול שולחן="1">
מדיה ופתרונות בשימוש: מתכוןמשמש עבור
הערה כללית: יש לחמם תמיד את המדיה לטמפרטורת החדר
BEGM media
  • 500 מ"ל מדיית יישום תאי BEGM עם מנה אחת של חומצה רטינואית
(מערבבים אותם חצי ומסננים)
  • 500 מ"ל מדיית BEGM Lonza עם מנה אחת של תוספי ציטוט בודד
< ul>
  • עיכול של הביופסיה
    • <חזק>BEGM+ מדיה
    • 50 מ"ל מדיה BEGM
    • שמירה על תאים על פלסטיק בצלחות (מעבר 0)
    • 10 μ l חומצה רטינואית (תמיסת עבודה)
    • תאי זריעה בבקבוק (Passage1; חלקית)
    • שומרים על התאים בבקבוק
    BEGM++ media
    • 50 מ"ל Lonza' s מדיה BEGM עם תוספי מזון
    • זריעת תאים טריים בצלחת 12 בארות על פלסטיק
    • 1 מ"ל נתרן BiCarb
    • שמירה על תאים בצלחות על פלסטיק (passage0; רק חלקית)
    • 2.5 מ"ל NuSerum
    • תאי זריעה בבקבוק (Passage1; חלקית)
    BEGM ALI media
    • 250 מ"ל DMEM-H
    • שמירה על תאים על הטרנסוול לפני שהם עוברים ל-ALI
    • 250 מ"ל BEGM כולל תוספי תזונה
    • 2 מ"ל תמצית יותרת המוח מבקר (תמיסה של 12.5 מ"ג/מ"ל)
    • 1 מ"ל ניסטטין (תמיסה של 3.3 מ"ג/מ"ל)
    • 75 μ l BSA (תמיסה של 10 מ"ג/מ"ל)
    <חזק>200X תמיסת מלאי הידרוקורטיזון (96 μ תמיסת ליטר/מ"ל)<>
  • 200 &MU; l הידרוקורטיזון מומס
    • כתוספת למדיום הבסיס השלם PneumaCult-ALI ליום האחרון בבקבוק וכאשר התאים נמצאים על תוספות
    • 4250 μ l נתרן כלורי מומס
    • 540 μ l ddH2O
    • 10 μ l אתנול מוחלט
    תמיסת סינון דרך 0.22 μ מסנן m, תמיסת aliquot ואחסון ב -20 ° ג, הימנע ממחזורי הקפאה/הפשרה נוספים
    PneumaCult-ALI מדיה בסיסית מלאה
    • 450 מ"ל PneumaCult-ALI מדיום בסיסי
    • מדיום בסיס לכל שלושת מדיות PneumaCult-ALI
    • 50 מ"ל תוסף PneumaCult 10x
    • המדיה של PneumaCult רגישה לאור, ולכן שמור אותה תמיד בחושך
    PneumaCult-ALI Maintenance Mediumלכל 1 מ"ל של PneumaCult-ALI Complete Base Medium add:תרבית ALI בתוספות
    • 10 μ l PneumaCult 100x תחזוקה תוספת
    • 2 μ l הפרין (של תמיסת מלאי של 2 מ"ג/מ"ל)
    • 5 μ l הידרוקורטיזון (של 96 μ פתרון מלאי L/ML)
    הנשימה אפיתל בינוני מוצרים צנטריפוגה מקוררת בחממה פיפטות ארון < TD>(זה יציב למשך שבועיים ב-2-8 מעלות; C או עד 6 חודשים ב-20 מעלות; C)

    מקורות

    1. Swamy, M., Jamora, C., Havran, W., Hayday, A. Epithelial decision makers: in search of the 'epimmunome. Nat. Immunol. 11, 656-665 (2010).
    2. Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: soldier in the fight against respiratory viruses. Clin. Microbiol Rev. 24, 210-229 (2011).
    3. Muller, L., Jaspers, I. Epithelial cells, the "switchboard" of respiratory immune defense responses: Effects of air pollutants. Swiss Med. Wkly. , (2012).
    4. Sanders, C. J., Doherty, P. C., Thomas, P. G. Respiratory epithelial cells in innate immunity to influenza virus infection. Cell Tissue Res. 343, 13-21 (2011).
    5. Robertson, M. J. Role of chemokines in the biology of natural killer cells. J. Leukoc. Biol. 71, 173-183 (2002).
    6. Adachi, M., Matsukura, S., Tokunaga, H., Kokubu, F. Expression of cytokines on human bronchial epithelial cells induced by influenza virus. A. Int. Arch. Allergy Immunol. 113, 307-311 (1997).
    7. Borchers, M. T., Harris, N. L., Wesselkamper, S. C., Vitucci, M., Cosman, D. NKG2D ligands are expressed on stressed human airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291, L222-L231 (2006).
    8. Groh, V., et al. Costimulation of CD8alphabeta T cells by NKG2D via engagement by MIC induced on virus-infected cells. Nat. Immunol. 2, 255-260 (2001).
    9. Obeidy, P., Sharland, A. F. NKG2D and its ligands. Int J. Biochem. Cell Biol. 41, 2364-2367 (2009).
    10. Horvath, K. M., Brighton, L. E., Zhang, W., Carson, J. L., Jaspers, I. Epithelial Cells From Smokers Modify Dendritic Cell Responses in the Context of Influenza Infection 1. Am. J. Resp. Cell. , (2010).
    11. Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. Ozone exposed epithelial cells modify co-cultured natural killer cells. AJP Lung. , (2013).
    12. Turi, J. L. Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 791-798 (2002).
    13. Zimmermann, G. S., Neurohr, C., Villena-Hermoza, H., Hatz, R., Behr, J. Anti-inflammatory effects of antibacterials on human Bronchial epithelial cells. Respir. Res. 10, 89(2009).
    14. Lopez-Souza, N., Avila, P. C., Widdicombe, J. H. Polarized cultures of human airway epithelium from nasal scrapings and bronchial brushings. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 266-269 (2003).
    15. Gray, T. E., Guzman, K., Davis, C. W., Abdullah, L. H., Nettesheim, P. Mucociliary differentiation of serially passaged normal human tracheobronchial epithelial cells. Am. J. Respir. Cell Mo.l Biol. 14, 104-112 (1996).
    16. Adler, K. B., Schwarz, J. E., Whitcutt, M. J., Wu, R. A New Chamber System for Maintaining Differentiated Guinea-Pig Respiratory Epithelial-Cells between Air and Liquid-Phases. Biotechniques. 5, 462(1987).
    17. Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. 24, 420-428 (1988).
    18. Jaspers, I. Reduced expression of IRF7 in nasal epithelial cells from smokers after infection with influenza. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 43, 368-375 (2010).
    19. Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. Ozone exposed epithelial cells modify cocultured natural killer cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 304, 332-341 (2013).
    20. Ochs, M., Weibel, E. R. Fishman's Pulmoary Diseases and Disorders. Fishmanetal, A. P., et al. 4, Mc Graw Hill. New York, NY. 23-69 (2008).
    21. Kesic, M. J., Meyer, M., Bauer, R., Jaspers, I. Exposure to Ozone Modulates Human Airway Protease/Antiprotease Balance Contributing to Increased Influenza A Infection. PLoS ONE. 7, e35108(2012).
    22. Jaspers, I. Diesel exhaust enhances influenza virus infections in respiratory epithelial cells. Toxicol. Sci. 85, 990-1002 (2005).
    23. Jaspers, I., Flescher, E., Chen, L. C. Ozone-induced IL-8 expression and transcription factor binding in respiratory epithelial cells. Am. J. Physiol. 272, L504-L511 (1997).
    24. Blume, C., et al. Barrier responses of human bronchial epithelial cells to grass pollen exposure. Eur. Respir. J. , (2012).
    25. Bauer, R. N. Influenza enhances caspase-1 in bronchial epithelial cells from asthmatic volunteers and is associated with pathogenesis. J. Allergy Clin. Immunol. 130, 958-967 (2012).
    26. Ostrowski, L. E., Stewart, D., Hazucha, M. Interferon gamma stimulates accumulation of gas phase nitric oxide in differentiated cultures of normal and cystic fibrosis airway epithelial cells. Lung. 190, 563-571 (2012).
    27. Jardim, M. J., Fry, R. C., Jaspers, I., Dailey, L., Diaz-Sanchez, D. Disruption of microRNA expression in human airway cells by diesel exhaust particles is linked to tumorigenesis-associated pathways. Environ. Health Perspect. 117, 1745-1751 (2009).
    28. Horvath, K. M., Brighton, L. E., Herbst, M., Noah, T. L., Jaspers, I. Live Attenuated Influenza Virus (LAIV) induces different mucosal T cell function in nonsmokers and smokers. Clin. Immunol. 142, 232-236 (2012).
    29. Horvath, K. M. Nasal lavage natural killer cell function is suppressed in smokers after live attenuated influenza virus. Respir. Res. 12, 102(2011).
    30. Noah, T. L. Tobacco smoke exposure and altered nasal responses to live attenuated influenza virus. Environ. Health Perspect. 119, 78-83 (2011).

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    הדפסות חוזרות והרשאות

    גלה מאמרים נוספים

    תרבית ALIתבתי תרבית תאיםצלחות לתרבית רקמהביופסיה של גרד ריריות האףמצע BEGM Plusזריעה ב-Transwellדיפרנציאציה מוקוציליאריתWestern Blotting
    Culturing של אדם תאי אפיתל באף בממשק האוויר הנוזלי
    צרו קשר
    המליצו לספרייה

    פרטיות

    תנאי שימוש

    מדיניות

    זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.