Summary
Den STA-PUT-metoden gjør det mulig for separasjon av forskjellige populasjoner av spermatogenese celler basert på størrelse og tetthet.
Abstract
Pattedyrspermatogenesen er en kompleks differensiering prosess som skjer i flere etapper i sædkanaler av testiklene. For tiden er det ingen pålitelig cellekultur-system slik at for spermatogenic differensiering in vitro, og de fleste biologiske studier av spermatogenese celler krever vev innhøsting fra forsøksdyr som mus og rotter. Fordi testis inneholder mange celletyper - både ikke-spermatogenic (Leydig, sertoli, myeloide, og epitelceller) og spermatogenese (spermatogonier, spermatocytter, runde spermatider, kondensespermatider og sædceller) - studier av de biologiske mekanismene som er involvert i spermatogenesen krever isolasjon og berikelse av disse forskjellige celletyper. Den STA-PUT-metoden gjør det mulig for separasjon av en heterogen populasjon av celler - i dette tilfelle fra prøvene - gjennom en lineær gradient BSA. Enkelte celletyper sediment med forskjellig sedimente hastighet i henhold til cell størrelse, og fraksjoner beriket for ulike celletyper kan samles inn og brukes i videre analyser. Mens STA-PUT metoden ikke resultere i svært rene fraksjoner av celletyper, for eksempel som kan oppnås med visse celle sortering metoder, gir det en mye høyere avkastning på total celler i hver fraksjon
(~ 1 x 10 8 celler / spermatogenic celletype fra en start befolkning på 7-8 x 10 8 celler). Denne high yield metoden krever bare spesialisert glass og kan utføres i noen kalde rom eller stort kjøleskap, noe som gjør det til et ideelt metode for laboratorier som har begrenset tilgang til spesialisert utstyr som en fluorescens aktivert celle sorter (FACS) eller elutriator.
Introduction
Pattedyrspermatogenesen er en kompleks differensiering prosess som skjer i flere etapper i sædkanaler av testiklene en. Kort, stilk-lignende spermatogonier som bor i nærheten av epitel av seminiferøst tubule splitt og differensiere i spermatocytter, som deretter gjennomgår meiotisk divisjoner. Etter meiosis er fullført, de resulterende haploide celler, eller runde spermatider, gjennomgå spermiogenesen, en differensiering prosess som involverer utgytelsen av cytoplasma og komprimering av kjernen. Spermatider gradvis utvikle en flagellen og gjennomgå tøyelighet og kondensering av kjernen, produsere elongating og deretter kondenserende spermatider, henholdsvis. Sluttproduktene er sædceller, som blir sluppet ut i lumen av seminiferøst tubule og til slutt inn i bitestikkelen hvor de modnes ytterligere.
Fordi prosessen med spermatogenesen er avhengig av spesielle hormonelle og molekylære tilstandertestiklene, en pålitelig in vitro kultur system for hele prosessen med spermatogenesen er ennå ikke utviklet 2,3. Kultur metoder har blitt utviklet for å lage "ur bakterie celle-liknende celler" og haploide, "runde spermatid-lignende celler" fra stamceller, men disse metodene er ikke i stand til å generere et stort antall slike celler, og mislykkes i å produsere senere spermatogenic celle typer 4,5. Heldigvis er den spermatogenesecelletyper signifikant forskjellig i størrelse, noe som gjør det mulig for en enkelt-cellesuspensjon erholdt fra hele testiklene til å bli separert med en væske gradient. STA-PUT metoden, demonstrert her, bruker en lineær BSA gradient og enkle sedimente å skille spermatogenese celler basert på størrelse og masse 6-9.
STA-PUT metoden har flere fordeler i forhold til de to andre mest brukte metodene for å skille spermatogenesecelletyper: FACS og elueringstid 10-13. STA-PUT apparat krever only flere stykker av spesialiserte glass montert i et kaldt rom eller stort kjøleskap. Det er således billigere enn å bruke en cellesorterer eller en elutriator. Den STA-PUT metode gir høyere mengder av celler per celletype og testis enn det som kan bli sortert ved FACS i et sammenlignbart tidsrom, selv om renheten av hver cellepopulasjon ikke er så høye som de som oppnås med FACS 11.. Celle sortering benytte magnetiske kuler (magnetisk aktivert celle sortering, MACS) har nylig blitt ansatt for anrikning av spermatogonier fra en blandet testikkelceller befolkningen, men det er for øyeblikket uegnet for å skille spermatocytter eller spermatider på grunn av mangel på kunnskap om riktig overflate markører 14. En ekstra fordel av STA-PUT metode over FACS eller MACS er evnen til å isolere levedyktige celler egnet for etterfølgende kultur fordi, i motsetning til de fleste FACS protokoller, krever det ikke noe DNA eller andre typer flekker. For studier som krever large Avlingene av spermatogenese celler typer på ~ 90% renhet, er STA-PUT en ideell metode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
STA-PUT protokollen omfatter tre faser: 1) Sett opp av apparatet og reagenser, 2) Utarbeidelse av cellesuspensjonen fra hele testikler, og 3) Cell lasting, sedimentering, og fraksjonssamling. Når utført av et team av to forskere, tar protokollen åtte timer i gjennomsnitt.
En. Sette opp STA-PUT Apparatus (Figur 1)
*** STA-PUT apparater må være plassert i et 4 ° C kjøleskap stort eller et kaldt rom som også kan romme en fraksjonssamler, hvis denne fremgangsmåte for innsamling er foretrukket.
- Natten før (eller i det minste et par timer før) du utfører metoden, vaske alt utstyr (spesielt glass og tubing) og sterilisere med 70% etanol. Let utstyr tørke fullstendig før montering av anordningen, som vist i figur 1.
- Fest de to to L sylindere (Tall 1B og C) og cellen lasting kammer (
- Plasser en liten rørestav i cellen lastekammeret (figur 1A) og en større rørestav i lengst til venstre to L sylinder (figur 1B) som skal inneholde 2% BSA.
- Plasser 2 L sedimente kammer på plattformen (fig. 1D). Plasser metallplaten (fig. 1F) direkte på toppen av åpningen i bunnen av sedimenteringskammeret (fig. 1D). Dette er viktig, da ledeplaten hindrer virvling av væsken og forstyrrelse av celle-gradient i løpet av brøk-samling. Sett lokk på toppen av sedimenteringskammeret.
- Etter påføring av en meget liten mengde av vakuumfett til bakken glass felles av tre-veis stoppekran (fig. 1G), klemme fast stoppekran til bunnen av sedimentation kammer, forbinder bakken glass leddene i vannkranen og sedimentekammeret.
- Koble celle-lastkammer (figur 1A) til høyre uttak av vannkranen med slangen. Steng vannkranen.
- Fest cellefraksjone slangen til venstre uttaket på vannkranen. Denne fraksjone slangen omfatter et stykke av slangen med en glass Pasteur pipette er koblet til den åpne ende. Et stykke av mindre rørdiameter er festet til den smale ende av glass-pipette. Den smale pipette begrenser strømmen av cellesuspensjonen i løpet av brøkdelen innsamling. Klem denne lite rør helt nederst.
- Forbered 2 L Krebs (1x) buffer dagen av forsøket (tabell 1). Deretter forberede 550 ml 2% BSA i 1x Krebs, 550 ml 4% BSA i 1x Krebs, og 50 ml 0,5% BSA i 1x Krebs. Filtrer og kjøle disse løsningene til 4 ° C.
- Hell 4% BSA-løsning i riktig 2 L sylinder (figur 1C), og 2% BSAoppløsning i den venstre sylinder 2 L (figur 1B). Pass på at det ikke er noen store bobler i slangen som forbinder disse sylinderne.
- Hell Krebs buffer inn i cellen lasterommet og fylle slangen kobler dette kammeret med sedimentekammeret, noe som gjør at det ikke er noen store bobler, da disse kan forstyrre gradient. Klemme eller flicking slangen forsiktig bidrar til å fjerne boblene. Kontroller at alt av Krebs-buffer er i røret, og ikke i cellen kammeret.
- Tillater en liten mengde av Krebs-buffer for å strømme inn i sedimenteringskammeret, og deretter tømmes så og si all bufferen inn i cellen fraksjoneringsrøret for å fylle røret og fjerne eventuelle store bobler.
- Plasser fraksjonssamler direkte under sedimenteringskammeret. Sørg for at alle fraksjons rør er på plass og dekket med plastfolie for å hindre forurensning.
2. Isolere spermatogenic Celler fra Whole Testikler
Tre. Cell Lasting og Sedimentasjon
- Kontroller at vannkranen er stengt, men i den stilling som vil tillate væske å strømme fra cellekammeret (figur 1A) inn i sedimenteringskammeret (Fig. 1D).
- Slå både oppsikt bar plater på en lav innstilling (ca. 70 rpm) å tillate oppstuss barer å bevege seg kontinuerlig, men sakte.
- Hell cellesuspensjonen inn i cellen kammeret (figur 1A), og åpner vannkranen, slik at cellene strømme sakte inn i sedimenterings-kammeret med en hastighet på 10 ml / min (fig. 1D). Steng vannkranen. Strømningshastigheten kan bestemmes ved å merke volum intervaller på sedimenteringskammeret.
- Hell 5 ml av 0,5% BSA-løsning inn i cellekammeret og renne inn i sedimenterings-kammeret med en hastighet på 10 ml / min. Steng vannkranen. Dette trinnet vil vaske cellene av cellekammeret. Gjenta 4x.
- Klargjør gradient: åpne klemmene mellom cellekammeret (figur 1A), og de to 2 L sylindre (figur 1B og C), og begynner å tømme væsken inn i sedimenterings-kammeret med en hastighet på 40 ml / min (fig. 1D) umiddelbart. Justere strømningshastigheten slik at det tar omtrent 20 til 30 min for å laste BSA gradient inn i sedimenteringskammeret. Et tynt, uforstyrret lag av celler, liggende oppåBSA gradient skal være synlig. Når det meste av BSA er lastet, lukke vannkranen og slå den til posisjonen som gjør at væsken renne fra sedimente kammeret inn i fraksjone tube.
- Slå av oppstuss plater.
- Tillate cellene å sedimentere i en time og 45 minutter. Forstyrr ikke APPARATUS løpet av denne tiden. Enhver mekanisk agitasjon kan forstyrre gradient.
4. Fraksjonering og analyse av fraksjoner
*** Som du utføre følgende trinn, være forsiktig for ikke å forstyrre gradient. Hvis BSA gradient blir forstyrret, vil prosedyren ikke fungerer!
- Når cellene har sedimentert, sakte renne 50 ml fra sedimenteringskammeret inn i et 50 ml konisk rør og satt til side. Denne fraksjonen inneholder vanligvis uønskede klumper av celler og rusk.
- Fest fraksjon røret til fraksjonssamler. *** Det er også mulig å samle fraksjonene med hånden om en brøkdel collector er ikke tilgjengelig.
- Samle fraksjoner: Juster vannmengden med stoppekran slik at 10 ml (fylle en samling rør) blir samlet inn hver 45 sek.
- Cap de brøkdel samling rør og spinne for 5 min ved 450 RCF ved 4 ° C. Hell av supernatanten forsiktig, resuspender celler i gjenværende væske, og holde cellene på is.
- Når alle fraksjonene er oppsamlet, mikroskopisk analyse av fraksjonene for forskjellige cellepopulasjoner. Forskjellige celletyper kan skilles fra hverandre basert på cellestørrelse og morfologi atom 8,15. Figur 2 illustrerer "representative resultater" for de tre oppsamlede fraksjoner som er anriket i (a) somatiske og meiotisk celler og spermatogonier, (b) runde spermatider, samt (c) elongating og kondensespermatider.
- Type A spermatogonier er 12-14μm ca. i diameter og har runde kjerner som er homogen i sammensetning kromatin.
- Type B spermatogonier er 8-9μm ca. i diameter og har runde fd atomkjerner som viser mer tett heterochromatin langs atom periferien.
- Pre-leptotene spermatocytter er 7.5-8.2μm ca. i diameter, har mindre cytoplasma enn Type B spermatogonier, og har kjerner som ligner på de i type B spermatogonier.
- Leptotene primære spermatocytter er 8-10 mikrometer ca. i diameter og har kjerner som ligner på de av pre-leptotene spermatocytter, men ser ut til å få mer tett kromatin på kjernemembranen.
- Zygotene primære spermatocytter er 10-12 mikrometer ca. i diameter og har kjerner som ligner på de av leptotene primære spermatocytter.
- Pachytene spermatocytter er alt fra 12-18 mikrometer ca. i diameter og består av en tynn kant av cytoplasma som omgir en stor kjerne. Flere klumper av tett kromatin kan sees i kjernen.
- Runde spermatider er 10 mikrometer ca. i diameter og har en rund kjerne med et tett flekker chromocenter i midten.
- Residualorganer er ~ 6,5 mikrometer i diameter, er runde, og mangler en kjerne.
- Elongating og kondenserende spermatider er like i størrelse å runde spermatider, men har en unik, sigdformet kjerne.
- Begynn med fraksjon 15 og analysere hvert femte fraksjoner opp til 85. Vanligvis vil fraksjoner under 15 være for blandet og klumpete, og fraksjoner over 85 vil inneholde få eller ingen brukbare celler.
- For å analysere en brøk, ta 5 ul av væske fra fraksjonsoppsamling røret (når cellene er blitt suspendert på nytt etter sentrifugering), og legg til 5 ul av 8% formaldehyd i Krebs-buffer. Tillat den faste celler til å sitte ved romtemperatur i fem minutter.
- Til 5 ul av 0,1% Triton og DAPI (5 μ / ml Krebs-buffer) til de faste celler. Tillate cellene å sitte ved værelsetemperatur i 5 min.
- Plasser 10 ul av den resulterende løsning på et lysbilde, dekkes med et dekkglass, og analysere med et fluorescensmikroskop for å bestemme renheten av hver fraksjon.
- Kombiner fraksjoner som er like i størrelse og kjernefysisk morfologi (se "Representant Resultater") for å opprette følgende populasjoner av celler: meiotisk og somatiske diploide celler, runde spermatider, og kondenserings / elongating spermatider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den ideelle resultat fra STA-PUT prosedyre er en ganske merkbar separering av cellene fra prøvene basert på cellestørrelse og tetthet. Mens celler isolert fra prøvene er sedimenter gjennom BSA gradient, kan flere forskjellige band av celler observeres. Eventuelle klumper av celler har en tendens til å synke til bunnen av gradienten og vil ikke forurense de andre fraksjoner. Litt lenger opp gradienten vil være den store somatiske og meiotisk celler. Lenger opp gradient fortsatt vil være mindre runde spermatider. På toppen av gradienten blir kondensert spermatider, sæd og forurensende røde blodlegemer (disse synes å være små, runde celler uten en kjerne).
Fraksjoner kan analyseres raskt ved hjelp av en kombinasjon av lys og fluorescerende mikroskop (figur 2) 15. Meiotisk, spermatogonial og somatiske celler er diploide de største celler som finnes i prøvene, og vil inneholde store kjerner som flekk relativtsvis homogent med DAPI. Runde spermatider er mindre celler med mindre runde kjerner, som regel med en brightly flekker chromocenter. Kondense / elongating spermatider er små celler som ofte ser avlang, som om en liten hale er forming. Disse cellene har mindre, kompakte kjerner som flekker sterkt med DAPI og er formet som en sigd. Når celle-fraksjoner kombineres, kan renheten bli ytterligere bestemt ved western blot-analyse av cellelysatene (figur 3). Vanlige markører for meiotisk celler er de synaptonemal komplekse 1 proteiner Scp1 og Sycp2 16.. Vanlige markører for kondensespermatider er overgangs proteiner (f.eks TP1) eller protamines 17.
Selv om hver STA-PUT løp kan være annerledes, vil vanligvis meiotisk celler, spermatogonier og somatiske diploide celler finnes i fraksjoner ca. 25-40, runde spermatider i fraksjoner ca. 55-65, og kondensering / elongating spermatider i fraksjoner ca.65-75 På grunn av en mindre forskjell i størrelse mellom somatiske / meiotisk celler og runde spermatider, fraksjoner ca. 45-50 har ofte en enda prosent av somatiske / meiotisk celler og runde spermatider. Farging med DAPI vil bidra til å skille disse to populasjoner av celler. Det er mindre overlapping av det runde spermatid og kondense / elongating spermatid fraksjoner på grunn av den større forskjell i størrelse mellom disse to populasjoner av celler. Vanligvis vil fraksjoner under 15 inneholder mange store klumper av celler og fraksjoner over 85 vil inneholde noen få celler og mange rest organer, eller membran-bundet cytoplasma som er utgytt av spermatider.
Vanligvis, når celler fra ~ 22 testiklene er fraksjonert med STA-PUT prosedyre, gir det ca. 10 8 celler / spermatogenic celletype (meiotisk / somatiske diploide celler, runde spermatider, og kondenserende / elongating spermatider). Fraksjoner som er kombinert for å skape det endelige populasjon av celler bør være minst80% rent for den type celle gjelder. Hvis du ikke ser denne graden av renhet eller høyere, kan det være et problem med celle separasjon eller BSA gradient. Likeledes, hvis det er noen celler i de første 20 fraksjoner og en overflod av celler i fraksjoner 80 +, eller hvis det er en overflod av celler i de første 20 fraksjoner og knapt noen i fraksjoner 70 +, må sedimente tid til å bli ytterligere optimalisert. Vennligst se diskusjon om forslag på hvordan å skyte problemer.
Figur 1. Sette opp STA-PUT Apparatus: En skjematisk og faktiske bildet av STA-PUT apparat vises. Alle glass er forbundet med plastslanger, inklusive røret som forbinder anordningen til fraksjonssamler. Piler angir plasseringen av klemmer. A) Cell lasterommet, inneholder oppsikt bar, B) 2 L sylinder for 2% BSA, inneholder oppsikt bar, C) 2 L sylinder for 4% BSA, D) Sedimentekammer; E) Rør platene, F) Baffle;. G) Hane Klikk her for å se større bilde .
Figur 2. Cellepopulasjoner hentet fra STA-PUT: fraksjonene ble samlet i tre separate populasjoner av celler: meiotisk og somatiske celler, runde spermatider, og kondensering og elongating spermatider. Hver befolkningen er farget med DAPI å vise forskjeller i kjernefysisk størrelse og morfologi. Fasekontrast avbildning bringer forskjeller i cellestørrelse og form. Hvit strek representerer 10 mikrometer. Klikk her for å se større bilde .
Figur 3. Markører av forskjellige cellepopulasjoner oppnådd fra STA-PUT: Hele celleekstrakter ble fremstilt av hver cellepopulasjon er vist i figur 1 og western blot-analyse ble utført for å vise protein expression forskjeller for hver populasjon.. Synaptonemal kompleks protein 1 (Scp1) er et protein uttrykt utelukkende under meiose og er funnet anriket i meiotisk fraksjoner, mens kondense spermatid brøkdel er beriket for overgangen protein 1 (TP1), et protein uttrykt sent i spermiogenesen. Klikk her for å se større versjon image .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De som studerer spermatogenesen er avhengige av dyremodeller for spermatogenesecelleprøver, som en pålitelig cellekultur systemet ennå ikke eksisterer for å generere alle spermatogenesecelletyper tre. Selv spermatogenese celler er lett samles fra hele testikler, resulterer bare en blandet befolkning. Dette utgjør et problem for de som ønsker å studere bestemte undergrupper av disse cellene, for eksempel meiotisk celler, runde spermatider, og kondenseringsspermatider. Tre ulike metoder brukes i dag til å skille disse undergrupper av spermatogenese celler: STA-PUT, FACS, og elueringstid 6-13. De to sistnevnte metoder krever tilgang til dyre apparater: en cellesorterer og en elutriator hhv. Selv om FACS metode gir meget rene populasjoner av forskjellige spermatogenesecelletyper, tar prosessen seks timer, og gir bare 0,5 til 2,0 x 10 6 celler pr celletype pr 2-3 testikler 11. Elueringstid, som STA-PUT method, skiller celler basert på størrelse og tetthet, men krever tilgang til en elutriator, som er dyrere enn den STA-PUT apparat.
STA-PUT prosedyren bruker en enkel BSA gradient å skille spermatogenese celler av ulik størrelse med en ganske høy yield (~ 10 8 celler / befolkningen per ~ 22 testiklene). I forhold til FACS metoder, gir den STA-PUT prosedyren flere celler / testis og tar mye mindre tid å skille celletyper. Sammenlignet med FACS og elueringstid er STA-PUT fremgangsmåte forholdsvis enkel og billig. STA-PUT krever bare et kaldt rom eller stort kjøleskap og et sett av spesialiserte glass, noe som gjør det til et ideelt metode for laboratorier uten tilgang til en celle sorter eller elutriator. Når utført riktig, kan det STA-PUT gi en ca 90% ren bestand av runde spermatider og kondenseringsspermatider.
STA-PUT metoden er svært nyttig, men krever optimalisering på flere ulike trinn, spesielt sedimentation. Sub-optimal separasjon av celletyper kan være forårsaket av flere ulike problemer, de fleste knyttet til BSA gradient. For å gjøre en skikkelig gradient, slå på oppstuss barer i cellen lasterommet og to L sylinder holder 2% BSA mens du oppretter graderingen. Fjerner også alle rør av bobler og sette baffel på plass i sedimentekammeret før du legger cellene. Reduksjon av strømningshastigheten av den BSA inn i eller ut av sedimenteringskammeret, kan hjelpe. Viktigst, bør STA-PUT apparat ikke bli forstyrret under opprettelsen av graderingen, sedimentering, eller fraksjonssamling.
Sub-optimal celleutbytte kan være et resultat av utilstrekkelig antall / størrelse på testiklene, utilstrekkelig celleseparasjon under collage / trypsin behandling, og celle klumper. Hvis man ikke er i stand til å få riktig antall celler for STA-PUT protokollen på grunn av bruk av neonatale mus eller genotyper som produserer små mengder spermatogenic cells, kan det være nødvendig å bruke flere dyr per STA-PUT eller for å bestille en STA-PUT glass kit optimalisert for mindre volum og celle tall (tilgjengelig fra ProScience) 18. For å få et optimalt antall celler (700-800 millioner), bruker minst 11 hannmus i reproduktiv alder, helst minst 8-9 uker gamle. Imidlertid bør ikke mer enn 800 millioner celler lastes inn i en STA-PUT. Dersom cellene ikke er dissosiert til en enkelt cellesuspensjon etter trypsin-behandling, kan den DNAse konsentrasjonen økes opp til 1 mg / 5 ml oppløsning. DNAse er følsom for gjenta sykluser med frysing / tining, og ved hjelp av frisk DNAse hver tid vil resultere i en mer effektiv dispersjon av tubuli i en enkelt cellesuspensjon. Man kan bruke et bredt boring pipette for å bidra til å bryte fra hverandre celle klumper før filtrering gjennom mesh.
Et aspekt av STA-PUT metode som vil kreve optimalisering er den mengde tid cellene tillatt å sedimentere gjennom BSA gradient. En timeog 45 min fungerer som regel bra, men denne gangen kan variere fra laboratorium til laboratorium. Vanligvis kan forskjellige lag av celler ses visuelt gjennom BSA gradient. Hvis det er noen celler i de første 20 fraksjoner samles og en overflod av celler i fraksjoner 80 +, kan sedimente tid må utvides. Hvis det er for mange celler i de første 20 fraksjoner samles, og det er utilstrekkelig separering av celletyper, kan sedimente tid må senkes.
Cellene ervervet med STA-PUT prosedyre kan benyttes for mange forskjellige typer eksperimenter. STA-PUT gir rikelig materiale for western blot analyse, immunfluorescens, og RNA-analyse, selv om store biokjemi eksperimenter kan kreve å kombinere materiale fra flere forskjellige STA-put går. Når atskilt fra andre celletyper, kan haploide spermatider dyrkes og utsatt for in vitro molekylær manipulasjon for opptil tre dager, noe som kan være lettere enn
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser. Denne protokollen blir demonstrert innebærer bruk av laboratoriet mus og ble henrettet i samsvar med alle relevante retningslinjer, forskrifter og tilsynsorganer. Dyr som brukes i denne protokollen er opprettholdt under veiledning og godkjenning av University of Pennsylvania Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC protokollen # 804284).
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av NIH tilskudd GM055360 til SLB og U54HD068157 til RGM. JMB ble støttet av T32 Genetics Training Grant ved University of Pennsylvania (GM008216).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Affymetrix/USB | 10857 100MG | Alternate can be used. |
| 0.5%, 2%, and 4% BSA solutions | Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively). | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| KREBS (10x) | 3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20 | Autoclave/filter and store at 4 °C for several months. | |
| KREBS (1x) | Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20. | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| Collagenase | Sigma | C9891-1G | |
| DNAse | Sigma | DNEP-5MG | |
| Trypsin | Sigma | T9201-1G | |
| DAPI | Preference of researcher | ||
| Triton-X100 | Preference of researcher | ||
| Formaldehyde (~37%) | Preference of researcher | ||
| TABLE 2: EQUIPMENT | |||
| Equipment | Company | Catalog # | Comments |
| Complete STA-PUT apparatus | ProScience Glass Shop | STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500) | Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers. |
| 10 μm mesh filter | Fisherbrand | 22363549 | |
| Mouse dissection tools | Preference of researcher | ||
| 14 ml round bottom fraction collection tubes with caps | Preference of researcher | ||
| Need approximately 100 tubes | |||
| Fraction collector | GE Healthcare Life Sciences | Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40 | Alternate can be used. |
| Microscope slides, cover glass | Preference of researcher | ||
| Light/Fluorescent Microscope | Preference of researcher |
References
- Wistuba, J., Stukenborg, J., Luetjens, C. M. Mammalian Spermatogenesis. Funct. Dev. Embryol. 1, 99-117 (2007).
- Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C., Murphy, K. M. Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche. Cell Cycle. 5, 1164-1170 (2006).
- Dores, C., Alpaugh, W., Dobrinski, I. From in vitro culture to in vivo models to study testis development and spermatogenesis. Cell Tissue Res. 349, 691-702 (2012).
- Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell. 146, 519-532 (2011).
- Easley, C. A., et al. Direct differentiation of human pluripotent stem cells into haploid spermatogenic cells. Cell Rep. 2, 440-446 (2012).
- Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization. Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).
- Miller, R. G., Phillips, R. A. Separation of cells by velocity sedimentation. J. Cell Physiol. 73, 191-201 (1969).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65, 40-49 (2005).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. (50), e2602- (2011).
- Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity. J. Cell Physiol. 86, 177-189 (1975).
- Meistrich, M. L., Trostle, P. K. Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients. Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).
- Gassei, K., Ehmcke, J., Schlatt, S. Efficient enrichment of undifferentiated GFR alpha 1+ spermatogonia from immature rat testis by magnetic activated cell sorting. Cell Tissue Res. 337, 177-183 (2009).
- Bellve, A. R., et al. Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization. J. Cell Biol. 74, 68-85 (1977).
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat. Rev. Genet. 11, 124-136 (2010).
- Zhao, M., Shirley, C. R., Mounsey, S., Meistrich, M. L. Nucleoprotein transitions during spermiogenesis in mice with transition nuclear protein Tnp1 and Tnp2 mutations. Biol. Reprod. 71, 1016-1025 (2004).
- Manku, G., Mazer, M., Culty, M. Neonatal testicular gonocytes isolation and processing for immunocytochemical analysis. Methods Mol. Biol. 825, 17-29 (2012).
- Dehnugara, T., Dhar, S., Rao, M. R. An in vitro, short-term culture method for mammalian haploid round spermatids amenable for molecular manipulation. Mol. Reprod. Dev. 79, 19-30 (1002).
