İnsan Progeroid WRN Eksonükleazının Ortologu DmWRNexo'yu Karakterize Etmek için Floresan Bazlı Bir Eksonükleaz Testi ve Diğer Nükleazlara Uygulanması

Özet

Eksonükleazlar, genom stabilitesinin sağlanmasında kritik roller oynar. WRN eksonükleaz fonksiyonunun kaybı erken yaşlanmaya neden olur. Nükleazın substratlarını ve diğer gereksinimlerini in vitro olarak incelemek, in vivo rolünü aydınlatmaya yardımcı olabilir. Burada, nükleaz aktivitesini ölçmek için hızlı ve tekrarlanabilir floresan bazlı bir test gösteriyoruz.

Özet

WRN eksonükleaz, DNA replikasyonu sırasında veya endojen veya eksojen genotoksinlere maruz kaldıktan sonra meydana gelen DNA hasarının çözülmesinde rol oynar. Aksi takdirde, WRN'den yoksun hiper-rekombinant bir hücre fenotipi ile tutarlı olarak, geçici olarak durmuş replikasyon çatallarında birikecek olan recombinojenik ara ürünlerin birikimini önlemede bir rol oynaması muhtemeldir. İnsanlarda, eksonükleaz alanı, DNA ve protein etkileşimi için önemli olan ek bölgelerle birlikte, aynı zamanda helikaz aktivitesine sahip olan çok daha büyük bir proteinin N-terminal bölümünü içerir. Buna karşılık, Drosophila'da, WRN'nin (DmWRNexo) eksonükleaz aktivitesi, varsayımsal helikazdan farklı bir genetik lokus tarafından kodlanır ve genom stabilite mekanizmalarında eksonükleaz aktivitesinin rolünün biyokimyasal (ve genetik) diseksiyonuna izin verir. Burada, saflaştırılmış rekombinant DmWRNexo ve uç etiketli floresan oligonükleotidler kullanarak WRN eksonükleaz aktivitesini belirlemek için bir floresan yöntemi gösteriyoruz. Bu sistem, substrat oligonükleotidleri aylarca stabil kaldığından radyoaktif tahlillerden daha fazla tekrarlanabilirliğe izin verir ve nükleaz polaritesinin, işlenmişliğinin ve substrat tercihlerinin belirlenmesine izin vererek nükleaz aktivitesinin ayrıntılı analizi için daha güvenli ve nispeten hızlı bir yöntem sağlar.

Giriş

Nukleazlar, hücrelerde hasarlı DNA'nın uzaklaştırılmasında, Holliday bağlantıları gibi çift yönlü olmayan yapıların çözülmesinde ve DNA replikasyonu sırasında hem DNA polimerazların içinde içsel hem de onlara dışsal olarak prova okuma kapasitesi sağlamada hayati bir rol oynar¹. Nükleazlar, DNA'yı serbest uçlardan (eksonükleazlar) sırayla parçalayarak veya daha uzun bir DNA molekülü (endonükleazlar) içindeki iç fosfodiester bağlarını parçalayarak etki edebilir. Nükleaz aktivitesinin kaybı, oldukça spesifik genom kararsızlık fenotiplerine neden olabilir. RecQ helikaz ailesi üyesi BLM'nin mutasyonu, aşırı yüksek kardeş kromatid değişim oranlarına ve küresel ol....

Protokol

1. Substrat Oligonükleotidlerinin Hazırlanması

1. Özel oligonükleotidleri sentezleyin.
   1. 5'-konjuge floresein molekülü ile tek sarmallı bir oligonükleotid tasarlayın; Bu, her substrat için omurga olacaktır. (Bunun 3'-5' eksonükleaz için olduğunu unutmayın; 5'-3' polariteye sahip eksonükleaz için 3'-konjuge bir omurga ipliği kullanın). Polarite bilinmiyorsa, hem 3' hem de 5' test edilmelidir.
   2. Floresan etiketli oligonükleotid tavlandığında, tercih edilen dubleks substrat(lar) oluşacak şekilde tamamlayıcı iplikler tasarlayın. Tamamlayıcı ipliğin bir floroforla konjuge olmadığına dikkat edin. Sipariş verirken PAGE-saflaştırma....

Sonuçlar

Ekzonükleaz aktivitesinin in vitro analizinin gerçekleştirilmesi, asıl analize ek olarak bir dizi hazırlık adımı gerektirir. Prosedürlerin genel bir özeti Şekil 1'de gösterilmiştir.

Floresans tabanlı ekzonükleaz analizleri yürütülmeden önce, uygun bir floresans görüntüleme sistemi kullanılarak üre-akrilamid jellerinde ayrıştırma sonrası floresan işaretli oligonükleotid substratın saptamasını optimize etmek kritik öneme sahiptir. Filtre seçimi, analizin genel hassasiye.......

Tartışma

Saflaştırılmış proteinlerin eksonükleaz aktivitesinin belirlenmesi, DNA bölünme ürünlerinin analizini gerektirir. DNA'nın eksonükleazlar tarafından sıralı bölünmesi, akrilamid jeller üzerinde etiketli bölünme ürünlerinin ayrılmasıyla görselleştirilebilir. Tarihsel olarak bu, DNA substratının bir radyoetiketle (örneğin ³²P veya ³⁵S) son etiketlenmesini içeriyordu, ancak radyoetiket kullanımının doğasında var olan dezavantajlar (maliyet, güvenlik sorunları ve zaman içinde istikrarsızlık) vard.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reagent/Material
Custom oligonükleotidler	Eurogentec		Bunların PAGE saflaştırması ile yüksek saflıkta örn. elde edilmesi gerekir.
		5'FLO	fluoresescein-5' GAACTATGGCTCTC GAGTGCTAGGACATGTCTGA CTACGTACAAGTCACC - 3'kabarcık
			5'- GGTGACTTGTACGT AGTCAGACATGTCCTAGCAC TCGAGAGCCATAGTTC-3'40
% 19:1 Akrilamid çözeltisi	Severn Biotech	20-2400-05	DİKKAT: güçlü nörotoksin bu nedenle her zaman
eldiven giyilmelidirHis-Trap sütunları (1 ml)	GE Healthcare	17-5247-01
Diğer tüm reaktifler	herhangi bir saygın tedarikçi		Moleküler biyoloji sınıfı gereklidir (DNaz içermez); mikrofüj tüpleri benzer şekilde DNaz ve RNaz içermemelidir
Equipment
Hoefer SE400 jel aparatı	Hoefer	SE400-15-1.5
FLA-3000 (fosfor ve floresan görüntüleyici)	Fuji
Görüntü Okuyucu V2.02	FujiFilm
Görüntü Göstergesi V3.3	FujiFilm