Elektron Probe X-ışını Mikroanaliz tarafından Nöronlar Toplam Kalsiyum Ölçümü

Summary

Bu kağıt fizyolojik tanımlanan biyolojik numunelerde subselüler çözünürlükte toplam kalsiyum içeriği ve dağılımı kantitatif ölçümüne cryoanalytical elektron mikroskobu uygulamasını açıklar.

Abstract

Bu yazıda Electron Probe Micro (EPMA) olarak bilinen teknik kullanılarak araçlar, teknikler ve hücre içi element içeriği nicel ölçümü için uygun bir alet açıklanmaktadır. Intramitokondriyal kalsiyum nedeniyle mitokondriyal kalsiyum aşırı nörodejeneratif hastalıklarda oynadığı kritik rolü belli bir odak noktasıdır. Yöntem, X-ışınları analizi örnek ile bir elektron ışını etkileşimi ile bir elektron mikroskobu (EM) oluşturulur dayanmaktadır. Elektron mikroskobu örneklerinde yayılabilir elemanlarının yerel bir dağılımının muhafaza edilmesi için, ultra ince EPMA cryosections hazırlanması ve ardından doku "cryofixation" gerektirir. Kültürlenmiş hücreler ya da Organotipik dilim kültürlerinin hızlı dondurma sırasıyla soğuk metal bloğun karşı sıvı etan veya çarpma dondurma ile dondurma dalma ile gerçekleştirilir. Kriyokesitler nominal kalınlığında 80 nm ca bir elmas bıçakla kuru kesilir. -16076, C, karbon / pioloform kaplı bakır ızgaralar üzerine monte edilmiş ve özel bir cryospecimen tutucu kullanarak cryo-EM içine cryotransferred. C ve düşük elektron doz ≤ ° -160 görsel ve diğer yer haritalama sonra, dondurulmuş hidratlanmış cryosections dondurularak kurutuldu, ~ 30 dakika boyunca 100 ° C altındadır. Kuru cryosections of organel düzey görsel yavaş tarama CCD kamera ve analiz için seçilen ilgi hücre içi bölgeleri ile, aynı zamanda, düşük bir dozda, kaydedilir. Bir sabit, odaklanmış, yüksek yoğunluklu elektron probu ile ROI yayılan X-ışınları, bir enerji dağıtıcı X-ray (EDX) ilişkili elektroniği tarafından işlenir spektrometresi, ve bir X-ışını spektrumu olarak sunulan toplanır, yani, bir enerji vs X-ışını yoğunluğu arsa. Ek yazılım kolaylaştırır: onların "karakteristik" pik enerjileri ve parmak izi ile elemental bileşenlerin 1) kimlik ve pik alanları / arka plan çıkarma 2) kantitatif analizi. Bu kağıt tipik gösteren iki örnek ile sona eriyorMitokondriyal kalsiyum analizi iskemi direncinin temelini ortaya eksitotoksik yaralanmalara ve diğerinin mekanizmaları önemli bir fikir temin edilen bir hangi EPMA uygulamaları.

Introduction

Kalsiyum iyonları sinaptik iletimi ve gen ifadesi olarak çeşitli normal süreçlerde önemli bir rol oynuyor, belki biyolojideki en önemli ve çok yönlü hücre sinyal varlık vardır. Öte yandan, kalsiyum hücre ölümünde de eşit derecede önemlidir. Özellikle, kalsiyum serbestleşme inme nöronal yaralanmaya önemli bir faktördür, Parkinson hastalığı, Alzheimer ve diğer nörodejeneratif hastalıklar ^3,5. Böylece, kalsiyum hücre içinde nasıl dağıtıldığı kantitatif anlamak için son derece önemlidir ve nasıl bu fizyolojik veya patofizyolojik uyaranlara aşağıdaki değiştirir. Çözelti içinde serbest veya bir substrata bağlanmış - - ve hücresel kalsiyum konsantrasyonları stimülasyon bir sonucu olarak, birkaç büyüklük içinde değişebilir, bu amaç, kalsiyum dinamik olarak iki fiziksel durumlar arasında dağıtılır gerçeği ile karmaşıktır.

Fr analizi için çeşitli yöntemler gelişmiş olsa da,hücre içi kalsiyum ee, tanımlanmış hücre içi bölümlerinde toplam kalsiyum konsantrasyonları belirlenmesi gerçekçi bir yaklaşımda, yani elektron probu mikroanaliz (EPMA) ile sınırlıdır. EPMA bu çiftler, bir transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile bir X-ışını spektrometresi bir tekniktir. TEM elektron tabancası ilgi ve elektron bombardımanı sonucunda yayılan eleman özgü X-ışınları bir alt hücresel bölgede sabit, Mikronaltı elektron prob odaklanır (ayrıntılı teknik değerlendirmeleri için başvurular ^{7, 4'e} bakın) toplanır ve analiz edilir. EPMA Avantajları tek organel düzeyinde çözünürlüğe ve submillimolar hassasiyet vardır. Ancak uygulamada, EPMA numune hazırlanması ve analizi için özel cryotechniques ve aletleri gerektirir. Burada, araçlar, teknikler ve EPMA kullanılarak hücre içi kalsiyum ölçümleri için uygun araçlar açıklanmıştır. Intramitokondriyal kalsiyum özel i olankritik rol nedeniyle nterest bu nörodejeneratif hastalıklarda mitokondriyal kalsiyum aşırı çalış.

Protocol

Burada açıklanan yaklaşım özel araçlar, araçlar ve yazılımlar kullanarak geliştirilmiştir. Laboratuvarları, aynı deney düzeneği kullanarak olmayacak çünkü yaklaşım mümkün jeneralize.

1.. Hızlı Dondurma

Bu dondurma anda canlı hücrelerde olduğu gibi nicel yayılabilir doku bileşenleri ve kimyasal elementlerin dağılımını koruyan bir şekilde hücreler ya da dokuların 1) "cryofixation": tarif edilecek olan analitik yöntem için kriyojenik yaklaşımlar kesinlikle bağlıdır ve 2) ultra ince hazırlanması bir TEM görüntüleme ve analiz için uygun cryosections. Bu teknikler kısaca burada açıklanan, ancak diğer laboratuvarlarda bu prosedürleri yeniden üretimi için gerekli ayrıntıları bu yazının kapsamı dışındadır vardır. İlgilenen okuyucular mükemmel yeni makaleler ^9,14 adlandırılır.

Dikkat: Bu bölüm, Sıvı sabun kullanımını tarif ederson derece yanıcı ve potansiyel olarak patlayıcı olan efied etan; uygun önlemler alınmalıdır. Operatör ayrıca sıvı azot aşina olması gerekir (LN ₂₎ koruyucu laboratuvar önlüğü, gözlük ve eldiven gibi cryoresistant güvenlik önlemleri. Not: Burada ve genelinde, tüm aletleri (forseps, vb) dondurulmuş örnekler yanlışlıkla çözülme önlemek için kullanmadan önce LN ₂ precooled olmalıdır işlemek için kullanılır.

Lamelleri kültürlü hücrelerin

1. LN _{2-soğutmalı} orta kuyuda -160 ° C'de gaz etan yoğunlaştırarak bir dalma dondurma cihazını hazırlayın. Işaretine kadar doldurun ve dönebilen alüminyum kapak kullanılmadığı ile kuyu kapağı.
2. Ince bir sulu film deneysel olarak uygun koşullar altında hücrelerin kültüre plastik lamelleri leke filtre kağıdı kama, kullanma. Doku dokunmamak şekilde kenarından Blot, deneme-yanılma ile belirlenen ideal kalan film, mümkün olduğu kadar ince ama çok th değildoku yüzeyinin kurumasını buharlaşması ve izin verecek şekilde de.
3. Sıkma forseps ile kenarından lamel tutarak, hızlı bir şekilde elle veya yerçekimi çalışan pistonu kullanarak, sıvı etan batırmayın.
4. Uzun süreli saklama kapları içine lamelleri istenilen sayıda işlemek için yeterince büyük LN ₂ yakındaki bir strafor kase, donmuş lamel yerleştirin. LN ₂ altında kaçırmamak yok alüminyum vidalı kapaklı kutu tavsiye edilir.

Kültürlü beyin dilimleri hızlı dondurma

5. Diseksiyon mikroskop, görünüm ve şark rahatsız ve hala kültür membran eklemek bağlı bir organotipik hipokampal dilim altında. Siyah Sharpie-tipi kalem ve fotoğraf ile dilimin kenarına yakın membran fiducial işaretlerini yerleştirin.
6. Hala mikroskop altında, yaklaşık kesip. Karelere merkezli bireysel dilimleri ile 5 x 5 mm zar kareler. Dilim dokunarak veya zarı eğilmemesie.
7. (Aşağıda açıklanan) bir cryoultramicrotome uygun yapılan bir özel tasarlanmış alüminyum disk üzerinde çap agar yastığa ¼ tarafından yastıklı bir membran destekli dilim, montaj. Hızla pnömatik özelleştirilmiş bir "slam dondurma" cihaz vasıtasıyla bir LN _{2-soğutmalı} safir bloğuna karşı iten tarafından dilim dondurma.
8. Kültürlenmiş hücreler için tarif edildiği gibi depolama taşı.

2. Cryosectioning

CAVEAT: basit ve mantıklı, eğitim, sabır ve önemli pratik gerektirir iken Başarıyla ultra ince kesitlerin kuru kesim kurdeleler üreten.

1. -135 ° C'ye bir cryoattachment ve serin ile donatılmış bir cryoultramicrotome dışarı pişirin
2. Yaklaşık içine donmuş lamelleri kesin. Keskin, soğutulmuş neşter kullanılarak 3 x 3 mm kareler. Kültürler Standart 3 üzerinde, bir viskoz sıvı "cryoglue" in (bir etanol 01:06 karışımı ve 2-propanol ¹¹⁾ yukarı bakacak parçaları gömmikrotom numune aynasını uyacak şekilde tasarlanmış mm çaplı alüminyum pimleri. Kültür yüzeye cryoglue sızıntı kaçının. -160 ° C ≤ için cryobox sıcaklığını düşürerek cryoglue katılaşmaya
   • Dondurulmuş beyin dilimleri için, güvenli bir vida yaka vasıtasıyla bir ısmarlama numune aynada doğrudan diskler takın.
3. Bir yakl - dilim lamel parçaları veya belirlenen alanlarda örneğin hücre açısından zengin alanlar - dondurulmuş örneklerin seçili alanlarını kesin. Bir elmas kesme aracı kullanarak 250 x 250 mikron blok yüz ve ~ 100 mikron derinlik.
4. Ca ince kesit Kuru kesilmiş şeritler. 35 ° elmas cryoknife kullanılarak -160 ° C, Referencs ^{4, 9} anlatıldığı esas olarak. Kesme hızı ve bıçak boşluk açısı ampirik olarak belirlenir; iyi bir başlangıç ​​noktası 9 ° 0.4-0.6 mm / sn 'dir. Hidratlı bölümlerin anma kalınlığı, yani numune avans, ibölümler esas olarak, sıkıştırma nedeniyle, aslında 1.5-2.0x daha kalın olmakla birlikte, tipik olarak 80 nm s. Tatmin edici kesit, bir antistatik cihaz gereklidir. Bıçak kenarından aygıt 0.5-1 cm'lik iyonize ucu yerleştirin ve bölme tatmin edici şeritleri üretilir kadar çıkış gücü ayarlamak.
5. Ahşap aplikatör sopalarla (epoksi) kirpik yapıştırma tarafından kirpik sondaları hazırlayın. Böyle bir sonda kullanılarak, pick up ve bıçak arkasından transfer kısımlarına 100-örgü katlama bakır döküm ızgaralar üzerinde parlayan taburcu, karbon kaplı pioloform destek filmleri üzerine ve arkasında bir çalışma rafta yarım katlanmış indiyum folyo zarfın üzerine oturtulmuş bıçak. Soğuk presleme aracı ile ızgara ve zarfın üst yarısını, basın üzerinde katlayın.
6. Bir alüminyum uygun bir ızgara kutusu ve mağaza transfer sarılı ızgaralar gibi adım 1.4 'de tarif edebilirsiniz.

3. Elektron Mikroskop için Örneklerinin Cryotransfer

EPMA için temel araçBu laboratuarda 120 kV işletilen ve kriyomikroskopisi için donanımlı, yani temiz bir vakum, numune alan anticontaminator, bir 2k x 2k yüksek hassasiyetli dijital kamera ve cryotransfer numune tutucu ile tasarlanmış analitik bir elektron mikroskobu. Hem de düşük ve yüksek büyütme modlarında mikroskop uyum ve çalışma koşullarını önceden kontrol ve ideal ≤ 10 ^-7 Torr, tatmin edici bir sütun vakum onaylayın. Gerekli ayar kadar.

1. Cryoholder bir Dewar bileşeninin vakum yalıtım tatminkar olduğunu doğrulayın. Gerektiğinde Pompa.
2. Kendi kontrol kutusuna tutucu bağlantı kablosunu ayırmak, mikroskop aşamasının içinde yüksek vakum altında ise, minimum sıcaklık, en az -160 ° C, cryoholder soğutun. Operatör ve mikroskop yüzeylere dökülüp LN ₂ en aza indirmek için yuvasından çıkarmadan önce açıölçer 45 ° saat yönünde eğin.
3. İntegral izole soğutma benchtop cryoworkstation hazırlayın160 ° C ≤ d cup
4. Transferi (quickly!) mikroskop soğutmalı cryoholder iş istasyonu kriyo için. Sahibinin don kalkanını geri çekin.
5. LN ₂ cryoworkstation çalışma masanın üzerinde depolama ve yerden bir ızgara sandviç altında almak. Sahibinin örnek kuyu için bir tutma halkası da masaya yerleştirilir.
6. Indiyum zarfı açın ve cryoholder bir örnek çukuruna kapalı katlama ızgara taşıyın. Anahtar aracı sağlanan ve don kalkan kapatmak kullanarak tespit halkasını ile ızgara sabitleyin.
7. Çabuk cryoworkstation gelen cryoholder çıkarın ve mikroskop hava kilidi takın ve mümkün olduğunca çabuk pompalama dizisi geçmesi. Ekleme, sütun vakum minimum bozulma olmalıdır.
8. 0 ° eğim açıölçer dönün. Bağlayın ve kontrol kutusu reenergize ve numune sıcaklığı 150 ° C'yi ≤ olduğunu teyit
9. Bir Dewar dolduruntutucu numune ve vakum ve sıcaklık tamamen kurtarmak için izin verir.

4. Bölümler Görsel Anketi

1. Örnek ortaya çıkarmak ve elektron ışın açmak için sahibinin don kalkanını geri çekin.
2. Görme düşük büyütme, tipik 250X ve düşük aydınlatmada örneği değerlendirmek. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, bölümler, ince ve pürüzsüz, katlanmamış veya üst üste gelen, düz ve iyi destek filminin bağlanmış olabilir ve genellikle ızgara çubukları tarafından gizlenmiş olmamalıdır.
3. İsteğe bağlı olarak seçilen bölümleri fotoğraflamak. (NOT: dondurulmuş sulu bölümler ışın kaynaklı hasarlara karşı çok duyarlı olduğundan, ışın maruziyeti en aza indirin.) Seçilmiş bölümlerin koordinatlarını saklamak için otomatik dijital açıölçer sahne kullanın.

5. Bölümler dondurarak kurutma

1. Dondurarak-kurutma bölümleri için ca tutucu sıcaklığının artırılması ile. ~ 30 dakika boyunca 100 ° C.
2. Aşağıda -160 ° C veya tutucu recool.

6. Hücreler ve Organellerin görüntüleme

Dondurularak kurutulmuş bölümlerin yapısal görüntüleri ca elde edilir. -160 ° C gibi düşük doz, uygun yazılımı tarafından kontrol 2k x 2k yavaş tarama CCD kamera kullanarak dijital kaydedilen sıfır kayıp görüntüler.

1. Hi-mag modunda EM etkinleştirin.
2. Seç ve görüntü ~ 2,000 X de (TIFF olarak, bakınız Şekil 2) Seçilen hücreler ve yerleri önceden kaydedilmiş depolanmıştır yüksek kaliteli bölümlerinde ilgi hücre içi alanları. (NOT: kurutulmuş bölümleri artık önemli ölçüde daha az kırılgan ve elektron ışın hasar daha az duyarlıdır.
3. X-ışını analizi için ilgi alanları (ROI) seçmek için görüntüleri değerlendirin. Bu adım, isteğe göre off-line bir şekilde ifa, EM açık olabilir ve bu durumda olabilirkapalı ve oda sıcaklığına kadar ısınmaya bırakıldı numune.

7. X-ray Spectra kazanılması

X-ışını spektrumları herhangi biri kullanılarak kaydedilebilir birkaç ticari veya özel tasarlanmış X-ışını minimal bir enerji dağılımlı X-ışını (EDX) dedektörü, ilişkili darbe işlemcili elektronik ve uyumlu edinimi ve görüntüleme yazılımının oluşan analiz sistemleri. (Bu laboratuvarda kullanılan sistem, Tablo 1 'de tarif edilmektedir.)

1. , Sütunun (gerekirse) içine EDX detektörü sokulması amacı diyafram çekilmesi ve herhangi bir kaçak radyasyon deliklere sokulması ve merkezleme ile X-ışını edinimi için EM yapılandırma. Numunenin donma kirlenmesi önlenir olan en düşük sıcaklığa cryoholder ayarlayın, ancak en az -100 ° C altında
2. Sahibine dedektörün doğru 20 ° eğin.
3. Geniş alan görüntüleme koşulları altında ve bir bir individua matrisini analiz niyetinde varsayarakl mitokondri, analiz için mitokondriden seçtiğiniz alanın merkezine doğru hareket ettirin ve odaklanır.
4. (Bazı mikroskoplar sadece ikinci kondansatör odağını kullanarak ışın yakınsama) nokta moduna gidin ve 100 nm noktaya (bir Faraday fincan veya benzeri ile ölçüldüğü gibi). 3 nA ca ışın akımını arttırmak.
5. Spektrum toplama yazılımı başlatın ve ekran monitör üzerinde canlı zaman izlenebilir 100 sn satın almalar, başlar. Kaydedilen spektrumu (Şekil 2) kaydedin. Endüstri standardı EMSA biçimi tercih edilmektedir.
6. EM kapatın ve (çevrimdışı) analizi iş istasyonu birden spektrumları dosya (lar) aktarmak.

8. X-ray Spectra Analizi

Kalitatif analiz

Bir EDX spektrumu (Şekil 2, ek), esas olarak, enerji vs X-ışını yoğunluğunun bir xy grafiğidir. Spectra t elementel kompozisyon ilgili niceliksel ve niteliksel bilgileri içerirBir tepe "karakteristik" enerji yoğunluğu o elementin miktarını yansıtır ederken zirveye sebebiyet veren elemanını tanımlayan o, hacim analiz. Karakteristik tepe noktaları, yavaş değişen bir arka plan, "süreklilik" üstüne binmek. (Şekil 2 'ye gösterge ayrıca EDX spektrumu belirgin bilgilerini ele almaktadır.) Tüm periyodik tablonun için zirve manifoldların enerji elemanlarının iyi bilinen elektronik yapısı, otomatik bileşenlerini tanıtan bir veritabanına böylece tüm EDX yazılım bağlantıları ile tanımlanır Bir analit. Fizyolojik bağlamda, EDX analizi için de uygundur genel ilgi elemanları Na (1.04 keV da K _α), P (2.01 keV), K (3.31 keV) ve Ca (3.69 keV) içerir.

1. Spektrasındaki önemli unsurları tanımlamak için mevcut yazılım veritabanı ve zirve eşleşen rutinleri yararlanın. Biyolojik bir örnekte Na, Mg, P, S, Cl, K, ve Ca için zirveleri bulmak için bekliyoruz. (DİKKAT:Son iki unsur örtüşüyor!)

Kantitatif analiz

EDX spektrumlarının kantitatif analiz ile piklerin entegre alanını ekstre edilmesi ve bir konsantrasyona kadar, bu değer dönüştürme oluşur. Biyolojik analiz için, kurulu bir yaklaşım (yukarıda ve Şekil 2'de tanımlanan) süreklilik yoğunluğu analiz hacminin kuru kütlesine bağlı olarak orantılı olduğu gerçeğinden yararlanır Hall tepe / sürekli yöntem ^4,7,10, olup . Bilinen bileşimin standartları spektrumları aynı oran ile karşılaştırıldığında Böylece, pik alanı / sürekli alanının oranı, hedeflenen hücre bölmesine konsantrasyonunu belirtir. Bu yaklaşım, genellikle mmol / kg kuru ağırlığı olarak ifade edilen ağırlık başına mol birimlerinde konsantrasyonlarını içerir unutmayın. Bu birim, sıra dışı ve yorumlanması için EL tarif edildiği gibi, örneğin, mmol / L veya ıslak ağırlık mmol / mg protein, ek dönüştürme gerektirebilir^4,10 sewhere.

2. Z = 10-20 arasında biyolojik elemanları (0,5-4,0 keV) 'in doruk alanlarının (ve hata tahminleri) ekstrakte örneğin, Na, Mg, P, S, Cl, K, Ca, analiz yerleşik fitingin rutinleri birini kullanarak yazılım (özellikle 4 dipnot, Tablo 1). Bu laboratuvar Simplex veya çok az kareler uydurma kullanır. Bu uydurma K ve Ca zirveleri arasındaki örtüşme (bkz. Şekil 2) çözümünde dikkat gerektirdiğini unutmayın.
3. 1,45-1,61 keV arasındaki süreklilik içinde kaynaştıran. Alternatif parazitsiz bölgeleri kullanılabilir.
4. Standartlara kıyasla daha sonra pik / süreklilik oranları ve konsantrasyonları hesaplayın. Analiz boyunca hataları yaymak.
5. Biyolojik farklılıkları yansıtmaktadır ortalamalarını tahmin standart istatistiksel yazılım ve formülleri kullanın.

Representative Results

Beyin hücreleri tipik olarak işemik koşulları altında ortaya çıkar ve patolojik sinir-iletici salıverilmesinde bir sonucu olarak eksitotoksik incinme. EPMA kalsiyum büyük miktarda ayırmak için nöronal mitokondri yeteneği yaralanma mekanizmasının temelini nasıl keşfetmek için kritik oldu. Şekil 3'teki elektron mikrografı hızlı bir eksitotoksik uyarıcı (100 uM NMDA) ile 30 dakika maruz kaldıktan sonra dondurulabilir kültürlenmiş hipokampal nöronlar dondurularak kurutulmuş cryosections mitokondri görünümünü göstermektedir. Onlar çok şişmiş ve küçük, koyu inclusions (kırmızı oklar) içerdiği gibi en mitokondri, yapısal zarar görmüş gibi. Mitokondriyal inklüzyonlar (Şekil 3, kırmızı ve mavi spektrumları, sırasıyla) içinde ve ("matris") olarak özel element analizini yapmak için yeterli çözünürlüğe sahip EPMA, inklüzyonlar büyük ölçüde kalsiyum ve fosforun oluştuğunu ortaya çıkarmıştır. Son derece yüksek kalsiyum conBu inklüzyonlar çadır - ~ 1.300 mmol / kg kuru ağırlık, oysa <1 mmol / kg mitokondri dinlenme tipik - olağanüstü kalsiyum-tamponlama kapasitesini açıklar ve neden ezici bu tamponlama mekanizması kalsiyum aşırı tetiklenen hücre ölümü ¹¹ yol açar.

Hipokampus, öğrenme ve bellek için kritik beynin bir bölge, iskemi sonrası yaralanma önemli bir sitesidir. İlginçtir, ve terapötik önemli, CA3 adlı fonksiyonel olarak farklı bölge daha az hassas iskemik yaralanma bitişik, synaptically bağlı CA1 bölgesidir daha. EMPA analizi - in situ yapısı ve fonksiyonu (Şekil 4, mikrograf) korumak hipokampal dilimler ait özel bölgelerin yer cryosections ile bağlantılı olarak - toksik uyaranlara (dirençli bitişik CA3 nöron daha hassas CA1 nöronlarda çok daha büyük bir kalsiyum yükseltiler neden olduğunu göstermek için kullanılmıştır Şekil 4, çubuk grafik). Sonuç olarak, CA1 mitokondriyal Dria Ca ^{2 +-aşırı-mitokondriyal} disfonksiyon CA1 nöronları ¹³ seçici açığı belirleyici bir faktör olduğunu belirten, geniş yaralanma ve fonksiyon bozukluğu gösterirler.

Şekil 1. Bir pioloform film desteklenen dondurulmuş sulu cryosections iki şeritler düşük büyütme elektron mikroskobu. İyi bir hazırlık özellikleri düz, sıra bağlı, minimal parçalanmış bölümler de dahil olmak üzere, gösterilmiştir. Film elektron ışını altında daha fazla gözyaşı gibi destek filmde akıntılar ile Izgara kareler, kaçınılmalıdır. Tam analiz için uygun iki kareler yıldız işaretiyle belirtilmiştir. = 100 mikron ölçekli bar.

"Fo: src =" / files/ftp_upload/50807/50807fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50807/50807fig2.jpg "/>
Şekil 2. EPMA organel ile elementel kompozisyon. Düşük doz kantitatif analiz, hızlı bir şekilde dondurulmuş kontrol ganglion hazırlanan bir liyofilize cryosection sempatik nöronun dijital tarama transmisyon elektron mikrografı Bu örneklerin de elde ayrıntı göstermektedir. Keskin plazma zarı, endoplazmik retikulum ve bol mitokondri iyi korunmuş yığınları Not Ankastre -. Kırmızı nokta ile gösterildiği gibi, mitokondriyal matris tipik bir alanda kaydedilen EDX spektrumu. K büyük kabuk X-ışını zirveleri için tekabül eden unsurlar, tanımlanır, potasyum ve kalsiyum durumunda, alternatif bir elektronik geçişleri kaynaklanan iki K-kabuk hatları çözümlenir, _α K ve K olarak gösterilen _β standart spektroskopik gösterim göre değişir. Spectrum canlı nöronlar önemli elementlerin tipik dağılımını göstermektedir. Bu hücre bölmesinin kütlesi yoğunluğunu gösterir, örneğin 1,5-1,8 veya 2,8-3,1 keV arasında yavaş yavaş sürekli değişen radyasyon, dikkat edin. Sağlıklı hücreleri kalsiyum kantitatif analizi tepe _α potasyum K _β ve kalsiyum K üst üste sebebiyet verir potasyum (150 mM, yaklaşık eşdeğer ca. 500 mmol / kg, kuru ağırlık), nispeten yüksek seviyelerinin mevcudiyeti ile karmaşık EDX spektrumu. Bu örtüşme dekonvolüsyonuna için standart algoritmaları vardır. Ölçek bar 1 mikron temsil eder.

Şekil 3,. Eksitotoksik uyarılması ayrı mitokondri içinde, değişken ve lokalize kalsiyum birikmesini uyarmaktadır. Dondurularak kurutulmuş cryosection Dijital transmisyon elektron mikrografıdır hazırlanabilir Sabitlenmemiş, hızlı bir şekilde dondurulmuş hipokampal hücre kültürü glutamat reseptörleri (30 dakika boyunca 100 uM NMDA) NMDA alt-tipinin eksitotoksik uyarılmasından sonra küçük, doğal olarak elektron yoğun, noktalı kusurları (kırmızı oklar) içeren çok sayıda mitokondri gösterir. Karşılık gelen X-ışını spektrumu, artan Na tepe gösterdiği ve dahil içermeyen mitokondrial matris (mavi oklar ve spektrum) K tepe azaldığı toksik uyarım, iyon homeostazının kaybına neden olduğunu göstermektedir. Tayfta büyük Ca tepe ayrıca fosfor ve büyük miktarda oksijen içeren karakteristik dahil olanlar, lokalize güçlü mitokondriyal kalsiyum birikimi yansıtır. Kapanım ve matrislerdeki ortalama Ca konsantrasyonu sırasıyla ~ 1.300 ve ~ 60 mmol / kg kuru ağırlık oldu. Ölçek çubuğu 500 nm temsil eder.

7fig4.jpg "/>
Şekil 4. Mitokondriyal kalsiyum aşırı hipokampal CA1 nöronlar selektif iskemik açığı sorumludur sol paneli -. Hızla iskemi-taklit koşulları (100 mcM NMDA) altında donmuş bir organotipik hipokampal dilim kültür, CA3 ve CA1 bölgelerinde hücre gövdeleri cryosections Elektron mikroskobu. sağ panel - EPMA mitokondriyal kalsiyum içeriği analizleri kimyasal iskemi (* p <NMDA maruz CA1 0.05 göre) bitişik olarak, iskemi dayanıklı CA3 nöron daha hassas CA1 nöronlarının mitokondrilerinde çok daha büyük bir kalsiyum yükseltiler uyardığını göstermektedir. NMDA kaynaklı kalsiyum aşırı NMDAR antagonisti MK-801 tarafından kaldırıldı. Ölçek çubuğu 2 mikron temsil eder.

Discussion

Elektron mikroskobu tabanlı bir analitik yöntem, burada sunulan saptama, tanımlama ve Na, K, P, Ca ve özellikle de dahil olmak üzere biyolojik ilgi çeşitli elemanları, miktar tayini için olanak sağlar. Bu analizler, hücre içi de gerçekleştirilebilir, yani, intra-organel, hızlı bir şekilde dondurulmuş numuneler hazırlanmış kriyo seksiyonlarda yüksek kaliteli görüntüler ilgi yapıları bulmak ve tespit etmek yeteneği sayesinde çözünürlük. Boyanma dokusu elemanlarının yer nicel olarak korunur bile, geleneksel olarak sabit, plastik gömülü preparatlar yapısal kalitesine benzer elektron görüntü kaydetmek için gerekli olduğunu not edin.

Yapısal anket görüntüleri uygulanan düşük elektron dozda kaydedilir rağmen, çok daha yüksek dozlarda iyi istatistikler elde etmek için yeterli saymak fiyatla X-ışını emisyonu ortaya çıkarmak için gereklidir. Bu nedenle, EMPA için faydalı olan bir mikroskop, bir yüksek akım odaklanmış probu oluşturmak için mümkün olması gerekir; 2-5 nA25-50 nm içine ER sisternala veya sinaptik kesecikler gibi organellere kapsayan için uygun, kabul edilebilir. Bu minimal bir yüksek parlaklık lantan heksaborattan elektron tabancası gerektirir. Bu etkili koşullar altında, 1-10 mmol / kg kuru ağırlığı tipik doku konsantrasyonlarda kalsiyum nicel ~ 100 sn canlı olarak ± 0.1 mmol / kg 'lik bir standart hata ile analiz edilebilir. Bir küçük potasyum hattı ile önemli kalsiyum x-ray hattının talihsiz örtüşme olmasa kalsiyum analizinin duyarlılığı büyük ölçüde geliştirilmiş olacak, deconvolution hangi önemli belirsizlik (Şekil 1 efsane görmek kalsiyum sinyal entegrasyon ekler detaylar). Fizyolojik ve özellikle patolojik, mitokondriyal kalsiyum birikimi (Şekil 2-3) sırasında oluşur gibi yerel kalsiyum konsantrasyonları, alışılmadık derecede yüksek olduğunda açıklanan sınır koşulları büyük ölçüde rahat olduğunu unutmayın.

Çok sayıda successf rağmenul uygulamaları, bu EPMA özellikle etkili bir yöntem değildir, bu nedenle veri aktarımını geliştirmek için çok teşvik var olduğu açıktır. Üç umut verici caddeleri burada bahsedilecektir: yerine EDX 1) elektron enerji kaybı spektroskopisi (EELS); 2) 2D eleman yerine nokta sondaları haritalar ve 3) yeni, state-of-the-art enstrümantasyon. Aksine yayılan X-ışınları toplama daha EELS elektron / atom çarpışmadan sonra enerji karakteristik, eleman belli miktarlarda kaybetmiş olay elektronları kayıt bağlıdır. İstatistiksel olarak, EELS EDX daha doğal ~ 4x daha iyidir, donanım ve yazılım artık neredeyse biyologlar için olgun edilir müren. (Biyoloji EELS uygulamalar değerlendirmeleri için başvurular ^{6, 2).}

Geliştirilmiş duyarlılık EELS tarafından sunulan - ve aynı zamanda yeni yüksek verimli Si-sürüklenme EDX dedektörleri tarafından, aşağıya bakınız - veriyor kısa analiz başına bekleme zamanlarını, örneğin milisaniye yerine hsaniye undreds ve bu nedenle uygun zamanlarda bazı alanların dijital harita üretmek için yeteneği. Bir örnek olarak, bir 128 x 128 kalsiyum harita ~ 1 saat ^{1 'de} kaydedilebilir. "Spektrum görüntüleme" ^6,2 olarak bilinen bu yaklaşım, her pikselde bir tam EELS spektrum sağlar, böylece çeşitli unsurları hakkında bilgi kaydedilen "veri küpüne" gömülü olduğunu unutmayın (x vs.. Vs E y).

Son olarak, Protokol bölümünde açıklandığı gibi, 20 yıl önce geliştirilen, mevcut sistem beri alet teknolojisi ve performans maddi gelişmeler olmuştur. State-of-the-art, bugün kurulum olmanın bir EMPA laboratuarında rigueur olacağını teknolojisi içerir: subnanometer büyüklüğünde noktalar halinde mevcut birkaç nanoamps (nA) pompalamak 1) yüksek parlaklık alan emisyon tabanca; 2 ) geniş bir alanı silikon-sürüklenme kaplamış X-ışını toplama verimi ve verim ⁸ dedektör ve 3) modern yazılımspektral edinimi, analizi ve sayısallaştırılması için üstün esneklik ve performans sunar. Bu tür yazılım paketleri en üreticilerin ticari olarak satılmaktadır; alternatif DTSA yazılım, DTSA II, güncelleştirilmiş ve geliştirilmiş versiyonu (Tablo 1, bakınız dipnot 4) NIST hiçbir maliyet mevcuttur. Sadece anlatılan özellikleri baz elektron mikroskobu bulunan herhangi bir otomasyon ve / veya robotik üstünde bulunmaktadır.

Olarak tarif EMPA protokol nörodejenerasyonda hücresel mekanizmalarını ortaya çıkarmak için, örneğin, yardım, nörologlar ilgilendiren çeşitli konularda atak için kendisini son derece yararlı olduğunu kanıtlamıştır. Sadece önerilen gelişmeler göz önüne alındığında, EMPA gelecekteki araştırmalar için sağlam bir katkı olmaya devam etmelidir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS/MATERIALS
Thermanox plastic coverslips	Thermo Fischer Scientific	72280
Culture inserts	BD Falcon	353090	For 6-well plates
Cryopins	Leica Microsystems	16701952	Grooved
Wood applicators	EM Sciences	72300
Folding EM grids	Ted Pella	4GC100/100	100 mesh
Indium foil	Alfa Aesar	13982	0.25 mm thick
EQUIPMENT
Plunge freezing device	Leica Microsystems	KF-80
Slam freezing device	LifeCell	CF-100
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC6
Cryoattachment for microtome	Leica Microsystems	FC6
Diamond cryotrimming tool	Diatome	Cryotrim 45
Diamond cryoknife	Diatome	Cryo 35
Antistatic device	Diatome	Hauf Static Line
Cryo electron microscope	Carl Zeiss Microscopy	EM912 Omega
EM cryo specimen holder	Gatan	CT3500
Slow-scan CCD camera, 2k x 2k	Troendle (TRS)	Sharpeye
Image acquisition software	Olympus SIS	iTEM suite
ED x-ray detector	Oxford Instruments	Linksystem Pentafet
Pulse Processor	Oxford Instruments	XP-3
PCI backplane card	4pi Systems	Spectral Engine II
Desktop computer	Apple	Any OS9-compatible model
X-ray analysis software	NIST	DTSA, DTSA II
Spreadsheet software	Microsoft	Excel
The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line. A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online. The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)