Summary
Denna metod beskriver användningen av klickar kemi för att mäta förändringar i värdcellens transkription efter infektion med Rift Valley-feber-virus (RVFV) stam MP-12. Resultaten kan visualiseras kvalitativt via fluorescensmikroskopi eller erhållas kvantitativt genom flödescytometri. Denna metod kan avpassas för användning med andra virus.
Abstract
Många RNA-virus har utvecklat förmågan att inhibera transkription värdcell som ett sätt att kringgå cellulära försvar. För studiet av dessa virus, är det därför viktigt att ha ett snabbt och tillförlitligt sätt att mäta transkriptionsaktivitet i infekterade celler. Traditionellt har transkription mätts antingen genom inkorporering av radioaktiva nukleosider såsom 3 H-uridin följt av detektering via autoradiografi eller scintillationsräkning, eller inkorporering av halogenerade uridin-analoger, såsom 5-bromouridine (BRU) följt av detektering via immunofärgning. Användningen av radioaktiva isotoper, emellertid, kräver specialiserad utrustning och är inte möjligt i ett antal laboratorie-inställningar, medan detektion av BRU kan vara besvärliga och kan lida av låg känslighet.
Den nyligen utvecklade klicka kemi, vilket innebär en kopparkatalyserad triazol formation från en azid och en alkyn, ger nu en snabb och highly känslig alternativ till dessa två metoder. Klicka kemi är en process i två steg i vilket begynnande RNA först märkas genom inkorporering av uridin analogen 5-etynyluridin (EU), följt av detektion av markören med en fluorescerande azid. Dessa azider finns som flera olika fluoroforer, vilket möjliggör ett brett spektrum av möjligheter för visualisering.
Detta protokoll beskriver en metod för att mäta transkriptionell dämpning i celler infekterade med Rift Valley-feber-virus (RVFV) stam MP-12 med hjälp klicka kemi. Samtidigt är uttrycket av virala proteiner i dessa celler bestämdes genom klassisk intracellulär immunfärgning. Steg 1 till 4 detalj en metod för att visualisera transkriptionell dämpning via fluorescensmikroskopi, medan steg 5 till 8 detalj en metod för att kvantifiera transkriptionell dämpning via flödescytometri. Detta protokoll är lätt att anpassa för användning med andra virus.
Introduction
Traditionellt har transkriptionsaktivitet mätts genom inkorporering av antingen radioaktiv (3 H-uridin) 1 eller halogenerade (BRU) 2 nukleosider i begynnande RNA. Dessa uridine analoger tas upp av celler, omvandlas till uridinproducerande trifosfat (UTP) genom nukleosid bärgning vägen, och därefter införlivas i nysyntetiserad RNA. 3 H-uridin kan detekteras genom autoradiografi, vilket kan vara tidskrävande, eller scintillation räkna, vilket kräver specialiserad utrustning. Dessutom kan användningen av radioaktiva isotoper inte vara praktiskt i ett antal laboratorie-inställningar, inklusive hög inneslutning biosäkerhet laboratorier. BRU kan upptäckas genom immunfärgning med anti-BRU-antikroppar, som kan kräva hårda permeabilization att säkerställa tillgången av antikroppen till kärnan eller partiell denaturering av RNA, som RNA sekundär struktur kan vara en steriskt hinder för antikroppsbindning.
_content "> Protokollet som beskrivs här utnyttjar den nyligen utvecklade klicka kemi 3 för att mäta transkriptionell aktivitet i celler infekterade med den RVFV stammen MP-12. Klicka kemi förlitar sig på ett mycket selektivt och effektivt koppar (I)-katalyserad cykloadditionsreaktion mellan en alkyn och en azid del 4,5. I detta protokoll är begynnande RNA i infekterade celler först märkas genom inkorporering av uridin analog EU. I ett andra steg, är den inbyggda EU upptäcks genom reaktion med en fluorescerande azid. De främsta fördelarna med denna metod är (1) att det inte kräver användning av radioaktiva isotoper och (2) att det inte kräver hårda permeabilisering eller denaturering av RNA. Med en molekylvikt på mindre än 50 Da, åtkomst av fluorescerande azid inte hindras av otillräcklig permeabilisering eller RNA sekundär struktur. Dessutom är forskarna inte begränsade i sitt val av primära antikroppar vid kombination av upptäckten av RNA med en klassiCal immunfärgning för virala proteiner.Två olika metoder beskrivs i detta protokoll: en för att visualisera transkription via fluorescensmikroskopi (steg 1-4), och en för att kvantifiera transkriptionen genom flödescytometri (steg 5-8). Båda dessa metoder kombinerar märkning av begynnande RNA med en intracellulär immunfärgning för virala proteiner, vilket möjliggör en korrelation mellan transkriptionsaktiviteten och virusinfektion på en cell för cell basis.
Författarna har framgångsrikt använt det protokoll som beskrivs här för att fastställa transkriptionell aktivitet i celler infekterade med den RVFV stammen MP-12 6, celler infekterade med olika MP-12-mutanter 7,8, 9, och celler infekterade med Toscana virus (TOSV) 10. Protokollet som beskrivs här kan enkelt anpassas för användning med olika virus och har potential att modifieras till att innefatta immunofluorescensfärgning av specifika virala eller cellulära proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Analys av transkription genom fluorescensmikroskopi
Ett. Infektera celler med MP-12 och Etikett Begynnande RNA med EU
- Placera 12-mm runda täckglas i 12-brunnars vävnadsodlingsplatta, ett täckglas per brunn.
Obs: Om cellerna har problem som ansluter sig till täckglas, belägga med poly-L-lysin (MW ≥ 70.000) innan den placeras i brunnar. I detta syfte submerge täckglas i en steril 0,1 mg / ml lösning i H2O av poly-L-lysin under 5 min. Skölj täckglas med sterilt H2O och lufttorka i minst 2 timmar.
- Till utsäde 293-celler på täckglas, tillsätt 5 x 10 4 celler i 1 ml odlingsmedium (DMEM innehållande 10% fetalt bovint serum, 100 U / ml penicillin och 100 mg / ml streptomycin) per brunn. Inkubera i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% CO 2 O / N.
- Infect celler med MP-12 vid en multiplicitet av infektion (MOI) av 3. Inkludera minst två infekterade brunnar: en av de två brunnar kommer att fungera som den infekterade kontrollen, kommer den andra att behandlas med aktinomycin D (ActD) i steg 1.5 som en kontroll för transkriptionell dämpning. Avlägsna odlingsmediet och späd viruset lager så att den totala volymen sattes till varje brunn är 200 ml. Inkubera under en timme i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
Obs: I stället för att infektera celler, kan cellerna också transfekteras med plasmid-DNA eller in vitro syntetiserat RNA som kodar för ett specifikt viralt protein. I detta syfte transfektera celler med en lämplig kemisk transfektionsreagens enligt tillverkarens instruktioner och fortsätt till steg 1,5 vid 16 h efter transfektion. Det är tillrådligt att optimera transfektion villkor och inkubationstid innan RNA märkning och fixering.
- Avlägsna inokulat och tillsätt 1 ml färskt tillväxtmedium per brunn. Inkubera vid 37 ° C under 15 timmar.
- Vid 15 timmar efter infektion (HPI), byt odlingsmedium med medium innehållande 1 mM EU. Till en av de skeninfekterade brunnar, också lägga till 5 mikrogram / ml ActD. Detta kommer att fungera som källa för transkriptionell dämpning, som ActD hämmar DNA-beroende RNA-syntes. Återgå cellerna till inkubatorn.
- Vid 16 HPI, avlägsna mediet och tvätta täckglasen gång med 1 ml PBS (KCl 0,20 g / L, KH 2 PO 4 0,20 g / L, NaCl 8,00 g / L, Na 2 HPO 4 1,15 g / L, pH 7,4) per brunn. Fix celler genom att tillsätta 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA) per brunn och inkubering under 30 min vid RT.
Obs: För att förbereda 4% PFA fixering lösning: lös 10 g paraformaldehyd i 150 ml H2O värms till 60 ° C på en uppvärmd magnetomrörare. Lägg 500 pl av 1 M NaOH och fortsätt att röra om tills lösningen blir klar. Filtrera PFA lösningen genom ett pappersfilter för att avlägsna partiklar och tillsätt 62,5 ml fosfatbuffert (77 mM NaH 2 PO 4, 287 mM Na-2 HPO 4, pH 7,4). Lägg H2O upp till en total volym av 250 ml. Frys vid -20 ° C i engångsbruk alikvoter.
- Tvätta en gång med 1 ml PBS per brunn. Ingen inkubationstid krävs för detta och alla efterföljande steg tvätta. Gå direkt till steg 2.
Anmärkning: Det är viktigt att omedelbart gå vidare med klick reaktion, som RNA urartar om de hålls i detta skede under längre tidsperioder, en förlust av RNA fluorescenssignalen kan redan observeras om celler hålls under 1 h vid 4 ° C . Likaså om perbildar ett experiment tidsförlopp, se till att märkning, fixa, och färgar alla prover samtidigt.
2. Klicka Reaktion på Detect märkt RNA
- Permeabilisera celler genom att tillsätta 1 ml 0,2% Triton X-100 i PBS. Inkubera i 10 min vid rumstemperatur.
Anmärkning: Alla lösningar som används i steg från 2,1 till 2,3 behöver vara nukleasfritt.
- Tvätta tre gånger med 1 ml PBS per brunn.
- Avlägsna täckglasen från 12-brunnar och överföring i fuktig kammare. Täck varje täckglas mellan 50 - 100 ^ klick färgningslösning (100 mM Tris pH 8,5, 1 mM CUSO4, 20 iM fluorescerande azid [excitation / emission max: 590/617 nm], 100 mM askorbinsyra) vardera. Inkubera under en timme vid RT i mörker.
Obs: För att montera fuktig kammare, linje botten av en cellkultur eller petriskål med 10 cm diameter med plast paraffin film. Klär insidan av kanten av dish med fuktiga pappershanddukar. Placera täckglasen på plasten paraffin filmen.
Obs: Var noga med att inte låta täckglasen torka ut under denna eller någon annan åtgärd i protokollet. Det är bäst att lägga färglösningen till varje täckglas direkt efter att den har placerats i den fuktiga kammaren.
Anmärkning: Bered lösningen klick färgning färska omedelbart före detta steg. Stamlösningar av 1,5 M Tris pH 8,5, 100 mM CUSO4, och 500 mM askorbinsyra kan förvaras vid 4 ° C. Men kasta någon askorbinsyra lösningen sur lager som gulnat.
Obs: Var noga med att välja en fluorofor som matchar filtren till det fluorescerande mikroskopet.
- Avlägsna täckglasen från fuktig kammare och placera i en fräsch 12-brunnar och tvätta tre gånger med 1 ml PBS per brunn.
Obs: Om ingen deskydd av virala proteiner önskas, täckglas kan monteras och avbildas efter detta steg (fortsätt till steg 3.3).
Tre. Immunfluorescens att upptäcka Redovisning av virala proteiner
- Tillsätt 1 ml blockeringsbuffert (3% (vikt / volym) bovint serumalbumin (BSA) i PBS) till varje brunn och inkubera under 30 min vid RT i mörker.
- Avlägsna täckglasen från 12-brunnar, överföring till fuktig kammare och täcker mellan 50 - 100 ^ primär antikropp (anti-RVFV, en slags gåva från Dr RB Tesh, UTMB) spätts i blockerande buffert (1:500). Inkubera under en timme vid RT i mörker.
Obs: Vid anpassning av protokoll för användning med ett annat virus, fastställa den optimala spädningen för din primära antikroppen först.
Anmärkning: Alternativt kan detta steg utföras O / N vid 4 ° C i mörker.
- Avlägsna täckglasen från fuktig kammare och plats tillbaka i 12-brunnar och tvättatre gånger med 1 ml PBS per brunn.
- Avlägsna täckglasen från 12-väl plats, plats i fuktig kammare och lock mellan 50 - 100 ^ sekundär antikropp (anti-mus IgG konjugerad till fluorescerande färgämne [excitation / emission max: 495/519 nm]) spätts i blockerande buffert (1: 500). Inkubera under en timme vid RT i mörker.
Obs: Var noga med att välja en sekundär antikropp som kan känna igen din primära antikroppen och matchar filtren på det fluorescerande mikroskopet.
Obs: Om så önskas kan 200 ng / ml DAPI tillsättas till den sekundära antikroppen utspädning att visualisera kärnor.
- Avlägsna täckglasen från fuktig kammare och placera tillbaka i 12-brunnar och tvätta tre gånger med 1 ml PBS per brunn.
- Montera täckglas genom att placera en droppe (ca. 15 l) av Fluoromount-G på ett objektglas. Doppa täckglas i H2O, avlägsna överflödigt H2O genom att trycka the sidan mot en pappershandduk och plats cell nedåt i droppe Fluoromount-G. Lufttorka under 5 min.
Obs: Om avbildning på ett inverterat mikroskop, tillåta Fluoromount-G stelna vid 4 ° CO / N eller anbringa täckglasen till objektglas genom att försegla kanten med genomskinligt nagellack.
Obs: Objektglas kan avbildas direkt eller förvaras vid 4 ° C i mörker i upp till en vecka.
4. Förvärv av Data
- Bild med ett fluorescerande mikroskop.
Obs: Var noga med att välja lämpliga fluoroforer som kan visualiseras med ditt mikroskop. För referens, följande är fluoroforerna och filter uppsättningar som används för att förvärva de bilder som visas i denna publikation.
DAPI:
Excitationsfilter: BP 330-385
Dichromatic spegel: DM 400
Emission filter: LP 420
Dichromatic spegel: DM 505
Emission filter: LP 510
Fluorofor med en excitation / emission högst 590/617:
Excitationsfilter: BP 545-580
Dichromatic spegel: DM 600
Emission filter: LP 610
Analys av transkription genom flödescytometri
Fem. Infektera celler med MP-12 och Etikett Begynnande RNA med EU
- Seed 293-celler i 6-brunnars vävnadsodlingsplatta i tillväxtmedium (DMEM innehållande 10% fetalt bovint serum, 100 U / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin). Inkubera i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% CO2 tills cellerna nått 80 - 100% konfluens.
- Infect celler med MP-12 med ett MOI på 3. Inkludera minst två infekterade brunnar: en av de två brunnarna kommer att fungera som den infekterade kontrollen, kommer den andra att behandlas med ActD vid steg5.4. Avlägsna odlingsmediet och späd viruset lager så att den totala volymen sattes till varje brunn är 400 | il. Inkubera under en timme i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
- Avlägsna inokulat och tillsätt 2 ml färskt tillväxtmedium per brunn. Inkubera vid 37 ° C under 12 timmar.
Obs: Om att anpassa detta protokoll för användning med ett annat virus, är det lämpligt att utföra ett experiment tidsförloppet för att bestämma den optimala tidpunkten för märkning och skörd. Ställ in detta tidsförlopp så att infektionen gånger är anordnade i sicksack och alla prover kan märkas, skördades och färgades på samma gång.
- Vid 12 HPI, byt odlingsmedium med medium innehållande 0,5 mM EU. Till en av de skeninfekterade brunnar, också lägga till 5 mikrogram / ml ActD. Detta kommer att fungera som källa för transkriptionell dämpning, som ActD hämmar DNA-beroende RNA-syntes. Återgå cellerna till inkubatorn.
- Vid 13 HPI, tvätta cellerna en gång with PBS och skörd genom trypsinisering av celler. Tvätta skördade cellerna tre gånger med PBS innehållande 1 mM EDTA (PBS-EDTA).
Obs: Under detta och efterföljande steg, inte centrifugera celler snabbare än 500 - 1.000 xg för att förhindra cell går sönder. Centrifugera cellerna för 1 - 2 min till sediment.
Obs: Om en yta immunfärgning planeras efter klicket reaktionen, skörd med en gummiskrapa eller disponibel cellskrapa istället.
- Fix celler genom att återsuspendera dem i 1 ml 4% PFA och inkubera i 30 min vid rumstemperatur. Se steg 1.6 för instruktioner om hur man förbereder 4% PFA.
- Tvätta en gång med 1 ml PBS-EDTA per brunn. Gå direkt till steg 6.
Obs: Det är viktigt att omedelbart gå vidare med klick reaktionen, som RNA urartar om de hålls i detta skede under längre tidsperioder. Likaså om du utför en tid course experiment, se till att märka, fixa och färga alla prov på samma gång.
6. Klicka Reaktion på Detect märkt RNA
- Permeabilisera cellerna genom återsuspendering i 0,5 ml 0,2% Triton X-100 i PBS. Inkubera i 10 min vid rumstemperatur.
Anmärkning: Alla lösningar som används i steg från 6,1 till 6,3 behöver vara nukleasfritt.
Obs: Om celler inte sediment ordentligt under detta steg, öka centrifugeringstiden till 5 min. Sedimentering beteende kommer att förbättras när cellerna suspenderas i FACS-buffert (steg 6.4).
- Tvätta en gång med 1 ml PBS.
Obs: Använd inte EDTA i detta steg eftersom detta kommer kelat Cu 2 + joner som behövs för klicket reaktionen.
- Återsuspendera cellerna i 200 | il klick färgningslösning (100 mM Tris, pH 8,5, 1 mM CUSO4, 200 nM azid märkt med fluorescerande färgämne [excitation / emissionsmaximum: 650/665 nm], 100 mM askorbinsyra). Inkubera under en timme vid RT i mörker.
Anmärkning: Bered lösningen klick färgning färska omedelbart före detta steg. Stamlösningar av 1,5 M Tris pH 8,5, 100 mM CUSO4, och 500 mM askorbinsyra kan förvaras vid 4 ° C. Men kasta någon askorbinsyra lösningen sur lager som gulnat.
Obs: Om cellerna klumpar ihop under detta steg, återsuspendera genom att pipettera upp och ned flera gånger.
Obs: Var noga med att välja en fluorofor som kan detekteras genom flödescytometern.
Obs: förbereda Också ett prov av infekterade celler, som inte utsätts för klicket färgningsproceduren, dessa kommer att behövas för kalibrering av flödescytometern. Antingen använder hälften av de infekterade cellerna eller innefatta en ytterligare smittade väl i steg 5.2. Dessa conkontrollaktiviteter celler kommer att immunostained vid steg 7.1.
- Tvätta två gånger med FACS-buffert (PBS innehållande 1 mM EDTA och 0,5% (vikt / volym) BSA).
Obs: Om ingen immunfärgning av virala proteiner önskas kan celler analyseras omedelbart (fortsätt till steg 8).
7. Immunfluorescens att upptäcka Redovisning av virala proteiner
- Återsuspendera cellerna i 200 ^ il av primär antikropp (anti-RVFV) utspätt i FACS-buffert (1:10000) och inkubera under 1 timme vid RT i mörker.
Anmärkning: Alternativt kan detta steg utföras O / N vid 4 ° C i mörker.
Obs: Också förbereda ett prov av infekterade celler som utsattes för klick färgningsprocedur men kommer inte att immunostained, kommer dessa att behövas för kalibrering av flödescytometern. Antingen använder hälften av mock-infekterade celler eller innefatta en ytterligare oinfekterad väl påsteg 5.2.
Obs: Vid anpassning av protokoll för användning med ett annat virus, fastställa den optimala spädningen för din primära antikroppen först.
- Tvätta cellerna två gånger i FACS-buffert.
- Återsuspendera cellerna i 200 | il sekundär antikropp (anti-mus IgG konjugerad till fluorescerande färgämne [excitation / emission maximum: 495/519 nm]) utspädd i FACS-buffert (1:1000) och inkubera under 1 timme vid RT i mörker.
- Tvätta cellerna en gång i FACS-buffert.
Anmärkning: Vid denna punkt, kan celler lagras O / N vid 4 ° C i mörker.
8. Förvärv av Data
- Resuspendera cellerna i 500 | il FACS-buffert, överföring till 5 ml polystyrenrör och analysera med användning av en flödescytometer. Använd MP-12 infekterade celler (ingen klick reaktion, anti-RVFV färgning endast) och skeninfekterade celler (klicka reaktion enbart) för att kalibrera instrumentet.
Intee: Var noga med att välja lämpliga fluoroforer som kan detekteras med ditt instrument. För referens, följande är de laserlinjerna och filter uppsättningar används för att inhämta de uppgifter som anges i denna publikation.
Fluorofor med en excitation / emission spektrum av 495/519:
Laser: 488 nm
Filter: 530/30
Fluorofor med en excitation / emission spektrum av 650/665:
Laser: 640 nm
Filter: 670/20
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den NSs proteinet av RVFV (familj Bunyaviridae, släkte Phlebovirus) 11 inhiberar värdcell allmänna transkription genom två olika mekanismer: (i) genom att binda den p44-subenheten av den basala transkriptionsfaktorn TFIIH 11 och (ii) genom att främja proteasomal nedbrytning av p62 subenheten av TFIIH 6. Den RVFV MP-12 vaccinstam 13 har använts för de experiment som beskrivs i detta protokoll sedan MP-12 stam kan hanteras i en skyddsnivå 2 laboratoriet och är utesluten från utvalda agent regeln i USA, som gäller för andra vilda- skriver RVFV stammar. NSS protein av MP-12 stam är fullt fungerande och bibehåller förmågan att undertrycka värd transkription 6. Viruset rMP12-C13type, som bär en deletion som omfattar 69% av NSs gen 14, har tagits upp som en kontroll virus som saknar alla NSS funktioner, inklusive möjligheten att undertrycka transkription värdcell.
Figur 3A visar kvantitativa data erhållna genom flödescytometri. Informationen representeras som spridningsdiagram med fluorescerande signal för EU-inkorporering i nascent RNA plottas på y-axeln och den för anti-RVFV färgning plottas på x-axeln. Kvadranten grindarna var inställd så att majoriteten av skeninfekterade celler var beläget i den övre vänstra kvadranten, var majoriteten av ActD behandlade celler ligger i den nedre vänstra kvadranten, och majoriteten av infekterade celler var beläget i den högra halvan av handlingen . När celler infekterades med MP-12, visade 81,5% av totala celler, eller 93% av anti-RVFV positiva celler, minskad transkriptionell aktivitet. Däremot when-celler infekterades med rMP12-C13type, visade 91,6% av totala celler, eller 97% av anti-RVFV positiva celler, transkriptionell aktivitet som var jämförbar med den av skeninfekterade celler. Figur 3B visar samma data som figur 3A i form av ett histogram för fluorescens-RNA märkning med EU inkorporering.
Figur 1. Fluorescensmikroskopi av celler infekterade med MP-12 och rMP12-C13type. 293 celler var mock infekterade eller infekterade med antingen MP-12 eller NSs deletionsmutanten RMP-12-C13type. Mellan 15 och 16 hpi märktes celler med 1 mM EU. Som en kontroll för transkriptionell dämpning, var mock-infekterade celler som behandlats med 5 mg / ml ActD samtidigt med EU behandling. Kärnor visualiseras genom DAPI färgning (blå), uttryck av virala proteiner visualiseras genom färgning med anti-RVFV antikroppar (grön), och RNA är visualiserad genom detektering av den införlivade EU med azid märkta med fluorescerande färgämne (excitation / emission max: 590/617 nm) (röd).
Figur 2. Fluorescensmikroskopi av celler transfekterade med in vitro syntetiserade RNA för antingen GFP eller MP-12 NSs. 293 celler var skentransfekterade, eller transfekterade med in vitro syntetiserat RNA som kodar för antingen GFP eller MP-12 NSs. Mellan 15 och 16 h posttransfection märktes celler med 1 mM EU. Som en kontroll för transkriptionell dämpning, var skentransfekterade celler som behandlats med 5 mg / ml ActD samtidigt med EU behandling. Expressionen av GFP är synliga genom färgning med en anti-GFP-antikropp (gi), är ett uttryck för NSs synliga genom färgning med anti-RVFV antikroppar (af, km) följt av anti-mus IgG konjugerad till fluorescerande färgämne (excitation / emission maximum: 495/519 nm) (grön), och RNA är visualiseras genom detektering av den införlivade EU med azid märkta med fluorescerande färgämne (excitation / emission max: 590/617 nm) (röd).
Figur 3. (A) flödescytometri av celler infekterade med MP-12 eller rMP12-C13type. Celler mock infekterade eller infekterade med antingen MP-12 eller rMP12-C13type. Mellan 12 och 13 hpi märktes celler med 0,5 mM EU. Som en kontroll för transkriptionell dämpning, var skentransfekterade celler behandlades med 5 ng / ml ActD samtidigt med EU behandling. Uttryck av virala proteiner visualiseras genom färgning med anti-RVFV antikroppar följt av en sekundär antikropp märkt med fluorescerande färgämne (excitation / emission max: 495/519 nm) (anti-RVFV) och RNA är visualiseras genom detektering av den införlivade EU med azid märkta med fluorescerande färgämne (excitation / emission max: 650/665 nm) (RNA). DATa representeras som ett spridningsdiagram. (B) Representation av samma data som visas i A som ett histogram. Fluorescensintensitet för EU inkorporering plottas på x-axeln, är celltal plottas på y-axeln. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den medföljande protokoll beskriver en metod för att mäta effekten av virusinfektion på värdcellens transkription via inkorporering av uridin analog EU till begynnande RNA. Denna metod har flera fördelar jämfört med tidigare metoder: den är snabb, känslig, och det behöver inte förlita sig på användningen av radioaktiva isotoper. Vidare kan förfarandet anpassas för att ge kvalitativa data genom fluorescensmikroskopi eller kvantitativa data via flödescytometri med användning av i huvudsak samma reagens. I kombination med immunofluorescens färgning för virala antigener, ger denna metod även forskaren att skilja smittas från infekterade celler.
Det är viktigt att notera att denna metod också märker nysyntetiserade viralt RNA i samma takt som det märker värd transkript, en nackdel som delas med andra metoder som bygger på 3 H-uridin eller bru inkorporering. Åtminstone när det gäller RVFV MP-12 infektion, har vi dock funnit att amount av värd transkriptioner genom långt överväger mängden av virala transkript, och därmed påverkan av viralt RNA på total-RNA mätt genom denna analys är försumbar. Vid anpassning av protokoll för användning med ett annat virus, kan forskarna vill identifiera virala transkript antingen genom sin lokalisering, genom behandling av infekterade celler med ActD, eller om fluorescent in situ hybridisering (FISH) 15. Om viruset replikerar i cytoplasman, såsom MP-12, sedan viralt RNA kan lätt skiljas från cellulärt RNA, som fortfarande är mestadels begränsade i kärnan efter 1 h av märkningen. Infekterade celler kan också behandlas med ActD att undertrycka transkription värdcell medan viral RNA-syntes oberörd. ActD funktioner genom att binda till dubbelsträngat DNA 16 och hämmar därför endast DNA-beroende transkription men har ingen effekt på virus-RNA-beroende RNA-polymeraser.
När du utför detta protokoll, är det viktigt att undvikakontaminering med nukleaser mellan permeabilization och klicka märkning reaktionen, som EU märkta RNA fortfarande känsligt för nedbrytning av RNaser 3. Vidare bör forskare genast fortsätta till klick märkningsreaktionen, såsom längre inkubationstider mellan fixering och klicka märkning reaktion, även vid 4 ° C, leder till nedbrytning av RNA och slutligen resultera i en förlust av RNA fluorescenssignalen. Detta är av särskilt intresse när de utför tidsförlopp experiment, forskare bör utforma sina experiment så att alla celler kan märkas, fixeras och färgas samtidigt. Lyckligtvis förblir RNA fluorescenssignalen stabil efter klicket märkningsreaktionen, så protokollet kan lätt stoppas efter detta steg.
Slutligen, forskare måste hålla i minnet att det cytopatisk effekt (CPE) som orsakas av många virus negativt påverkar cellulära RNA-syntes även i avsaknad av någon specifik transkription förtryck. Denär därför viktigt att mäta transkriptionell aktivitet vid en tidpunkt efter infektion när celler fortfarande är livskraftiga. Om ett mutant virus är tillgängliga som saknar förmågan att undertrycka transkription, såsom rMP-12-C13type (figurerna 1 och 3), kan detta vara ett utmärkt verktyg för att fastställa den optimala tidpunkten för mätning av transkription.
När man planerar ett stort antal försök, kanske forskare vill överväga direkt märkning av deras primära antikroppen med en fluorokrom 17, varigenom man eliminerar behovet av en sekundär antikropp och minska den tid som krävs för detektion av virala antigener.
Sammanfattningsvis tillhandahåller detta protokoll ett snabbt och tillförlitligt sätt att mäta effekten av virusinfektion på värdcell transkription. Det kan enkelt anpassas för användning med olika virus och har potential att modifieras för att inkludera immunostainings för specifika virala eller cellulära proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar RB Tesh för att ge musen polyklonala anti-RVFV antiserum och M. Griffin av UTMB flödescytometri Core Facility för hjälp med flödescytometri. Detta arbete stöddes av 5 U54 AI057156 genom Västra Regional Center of Excellence, NIH R01 AI08764301, och finansiering från Sealy Centrum för utvecklingen av vaccin vid UTMB.BK stöddes av James W. McLaughlin Fellowship Fund at UTMB.OL stöddes av en Maurice R. Hilleman början av karriären karriär Investigator Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ethynyl-uridine | Berry Associates | PY 7563 | dissolve in DMSO for 100 mM stock |
| 12-mm round coverslips | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| 5 ml polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Actinomycin D (ActD) | Sigma | 9415 | dissolve in DMSO for 10 mM stock |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A-11029 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz | sc-2323 | |
| CuSO4 | Sigma | C-8027 | dissolve in H2O for 100 mM stock |
| DAPI | Sigma | D-9542 | dissolve in H2O for 5 mg/ml stock |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled) | Invitrogen | A10270 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled) | Invitrogen | A10277 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A-5960 | dissolve in H2O for 500 mM |
| paper filter | VWRbrand | 28333-087 | |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| poly-L-lysine (MW ≥ 70000) | Sigma | P1274 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Trizma base | Sigma | T-1503 | dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| Fluorescence Microscope | e.g. Olympus IX71 | ||
| Flow Cytometer | e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa |
References
- Fakan, S. Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus. Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).
- Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine labelling and bromodeoxyuridine antibodies. Cytometry. 14, 455-458 (1993).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15779-15784 (2008).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 41, 2596-2599 (2002).
- Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).
- Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs protein of rift valley fever virus promotes posttranslational downregulation of the TFIIH subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
- Kalveram, B., et al. Rift Valley fever virus NSs inhibits host transcription independently of the degradation of dsRNA-dependent protein kinase PKR. Virology. , (2012).
- Head, J. A., Kalveram, B., Ikegami, T. Functional analysis of Rift Valley fever virus NSs encoding a partial truncation. PLoS One. 7, e45730 (2012).
- Lihoradova, O. A., et al. Characterization of Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain Encoding NSs of Punta Toro Virus or Sandfly Fever Sicilian Virus. PLoS Negl Trop Dis. 7, e2181 (2013).
- Kalveram, B., Ikegami, T. Toscana Virus NSs Protein Promotes Degradation of Double-Stranded RNA-Dependent Protein Kinase. J. Virol. , (2013).
- Schmaljohn, C., Nichol, S. In Fields Virology. Knipe, D. M., et al. , Lippincott Williams and Wilkins. 1741-1789 (2007).
- Le May, N., et al. TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
- Caplen, H., Peters, C. J., Bishop, D. H. Mutagen-directed attenuation of Rift Valley fever virus as a method for vaccine development. J. Gen. Virol. 66, 2271-2277 (1985).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious Rift Valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
- Vyboh, K., Ajamian, L., Mouland, A. J. Detection of viral RNA by fluorescence in situ hybridization (FISH). J. Vis. Exp. , e4002 (2012).
- Reich, E., Goldberg, I. H. Actinomycin and nucleic acid function. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 3, 183-234 (1964).
- Holmes, K. L., Lantz, L. M., Russ, W. Conjugation of fluorochromes to monoclonal antibodies. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 4 (Unit 4 2), (2001).
