Summary
Konfokal mikroskopi taraması, canlı bir hayvanda perfüze kalp ya da iskelet kaslarında bir mitokondriyal etkinlik görüntülenmesi için uygulanır. Süperoksit basması ve membran potansiyel dalgalanmalar gibi tek mitokondriyal süreçlerinin gerçek zamanlı izleme fizyolojik ilgili bir bağlamda ve patolojik tedirginlikler sırasında mitokondrial fonksiyon değerlendirilmesini sağlar.
Abstract
Mitokondri ökaryotik sistemlerde enerji üretimi ve hücre içi sinyal sorumlu kritik bir hücre içi organel. Mitokondriyal işlev bozukluğu, genellikle eşlik eden ve insan hastalığına neden olur. Mitokondriyal işlev bozukluğu ve değerlendirmek için geliştirilmiştir yaklaşımlar çoğunluğu in vitro ya da ex vivo ölçümler dayanmaktadır. Bu deneylerden elde edilen sonuçlar, in vivo olarak mitokondriyal fonksiyonu belirlenmesinde yeteneği sınırlıdır. Burada, in vivo olarak, gerçek zamanlı bir şekilde, tek bir mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesine olanak tanır, canlı aminaller sağlam dokuların görüntülenmesi için, konfokal tarama mikroskobu kullanan yeni bir yaklaşımı tarif eder. İlk olarak, mitokondriyal hedeflenen süperoksit göstergesi, dairesel sırası değiştirilmiş sarı floresan proteini (mt-cpYFP) ifade eden transjenik fareler üretir. Anestezi mt-cpYFP fare ısmarlama bir sahne adaptörü ve zaman atlamalı görüntüler f alınır sabittirhindlimb açıkta kalan iskelet kasları rom. Fare daha sonra kurban edilir ve kalp 37 ° C'de fizyolojik çözümleri ile Langendorff perfüzyon için ayarlanmış Perfüze kalp konfokal mikroskop sahnede özel bir odasında konumlandırılmış ve hafif basınç kalp hareketsiz ve kalp atışını kaynaklı hareket yapaylığı bastırmak için uygulanır. Süperoksit yanıp saniyede bir çerçeve frekansında gerçek zamanlı 2D konfokal görüntüleme ile tespit edilir. Perfüzyon çözüm farklı alt tabakaların solunum ya da diğer floresan göstergeleri ihtiva edecek şekilde modifiye edilebilir. Perfüzyon, aynı zamanda, iskemi ve reperfüzyon gibi hastalık modeller üretmek için ayarlanabilir. Bu teknik, sağlam dokularda ve in vivo olarak bir mitokondri fonksiyonunu belirlemek için benzersiz bir yaklaşımdır.
Introduction
Mitokondri hücre Bioenerji merkezi rol, serbest radikal sinyalizasyon, redoks hemostazını, iyon düzenlenmesi ve hücre kaderinin belirlenmesi 1,2 oynamaktadır. Mitokondri disfonksiyon sıklıkla eşlik eder ve hastalık 3-6 patogenezi yatmaktadır. Özellikle bu kalp ve iskelet kasları gibi kas sistemlerinde, mitokondriyal solunum hücre içi kalsiyum ve sağlam, güç geliştirme 7,8 zamanında düzenleme desteklemek için ATP çoğunluğu içerir. Bu kaslar, genellikle, toplam hücre hacmi% 20-40 kadar işgal myofilaments 2 arasında "sabit" olan mitokondri içinde çok sayıda sahiptirler.
Çok sayıda araştırmaya rağmen, özellikle in vivo ve fizyolojik ilgili koşullar altında mitokondriyal fonksiyon yönetmelik, anlayışımız, sınırlıdır. Bunun nedenlerinden biri, mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için geliştirilmiş yöntemlerin çoğunluğu vitr olarak itimato ya da eski tür yapay substratlar ile takviye izole mitokondri oksijen tüketimi ve morfoloji yoluyla mitokondriyal fonksiyonun belirlenmesi dolaylı (örneğin elektron mikroskopisi), enzim aktivitesi (örneğin akonitaz aktivite) ya da hücre içi ATP seviyeleri 9-11 izlenmesi gibi vivo yaklaşımlar, .
Son zamanlarda, göreceli mitokondriyal zenginleştirme ile küçük molekül floresan göstergeler sağlam hücrelerde zar potansiyeli, kalsiyum ve reaktif oksijen türlerinin (ROS), dahil olmak üzere 11-13 mitokondriyal sinyallerin bir belirti sağlamak için uygulanmıştır. Ayrıca, çok sayıda yeşil floresan protein (GFP) redoks bazlı ve ROS göstergeleri bölümlere hücre içi redoks veya ROS 14-16 sinyal daha özel bir değerlendirme elde etmek için geliştirilmiştir. Bu arasında, bir genetik olarak kodlanmış süperoksit göstergesi, dairesel sırası değiştirilmiş sarı floresan protein ve targete gelişmişmitokondri (mt-cpYFP) 17 içine d o. mt-cpYFP 515 nm 'de iki emisyon tepe ile 405 ya da 488 nm'de uyarıldığında edilebilir. 488 nm eksitasyon emisyon in vitro ve in vivo kalibrasyon 17,18 önceki ile gösterildiği gibi, süperoksit özellikle duyarlıdır. 405 nm uyarma emisyon (çeşitli koşullar altında mt-cpYFP emisyon ve uyarma spektrumları hakkında detaylı bilgi için Ref 17 Şekil 1'e bakınız), iç kontrol olarak kullanılmıştır. Time-lapse konfokal görüntüleme ile bu gösterge sağlam hücreler tek mitokondrilerinde süperoksit yanıp adlı süperoksit üretimi olayları, patlama algılar. Süperoksit flaş mitokondrial solunum, ekli geçici mitokondriyal membran depolarizasyon ve ROS üretiminin 17-20 bir bileşik fonksiyonu olarak hizmet vermektedir. Son zamanlarda, biz pUC'den CAGGS-mt-cpYFP vektör C57/BL6 arka planda 17,19 kullanarak pan-doku mt-cpYFP transgenik fareler üretilen ve güçlü Expres doğruladıktankalp, iskelet kasları ve diğer dokularda (Şekil 2) Bu göstergenin sion. Transgenik fareler istek ve Washington Üniversitesi tarafından MTA onayıyla ilgilenen akademik araştırmacılar için geçerli olacak.
Bu çalışmada, in situ Langendorff perfüze kalp süperoksit basmaları görüntüleme gibi anestezi uygulanmış mt-cpYFP transgenik farelerin 17,19 iskelet kaslarında flaş etkinlikleri in vivo görüntüleme açıklar. Bu teknoloji fizyolojik ilgili bir durum veya in vivo 21,22 tek mitokondriyal ROS üretim olayları gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak verir. Böyle uygun floresan gösterge ile membran potansiyeli ve kalsiyum gibi diğer tek mitokondriyal parametrelerini izlemek için sistemi kullanmak da mümkündür. Hücre içi olaylar (örn. kalsiyum geçici) veya kalp fonksiyonu (mitokondriyal fonksiyonu daha fazla, aynı anda ya da paralel değerlendirme örn.. Ejeksiyon fraksiyonu) elde edilebilir. Böyle iskemi reperfüzyon gibi patolojik tedirginlikler, sağlam miyokardiyumda tek mitokondriyal fonksiyonu üzerindeki stresin etkisini değerlendirmek için perfüze kalp uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Deney Hazırlama
- 140 mM NaCI, 5 mM KCI, 2.5 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, in vivo görüntüleme için iskelet kası (pH 7.2) ihtiva eden izotonik bir dengelenmiş tuz çözeltisi (50 ml) hazırlayın.
- 118 mM NaCI, 5.3 mM KCI, 1.2 mM MgSO 4, 0.5 mM EDTA ve 25 mM NaHCO 3: içeren Krebs-Henseleit tamponu (KHB) 1 L hazırlayın.
- Kabarcık gaz ihtiva eden% 95 O 5/2 önceden 2 mM CaCl2 eklenmesinden 10-15 dakika boyunca% CO2 ile KHB. Metabolik substratlar (örn., 10 mM glükoz ve 0.5 mM piruvat) eklenir.
- % 70 etanol içinde kelepçe, makas ve forseps sterilize edilmesi ve daha sonra steril GKD 2 O. durulama ile cerrahi aletler hazırlanması
- , Kalp perfüzyon sistemine açın su banyosu ve sirkülasyon üzerinde sıcaklığını ayarlamak, 6 ml / dak peristaltik pompanın hızını ayarlamak.
- % 95 O 2 ile kabarcık KHB/% 5 CO2 gaz ve çıkış maddesi akış oranı ve (a fiber optik sıcaklık probu ile 37 ° C,) sıcaklığını izlemek. Sistem, gaz ve ısı dengelenmesi için yaklaşık 20 dakika gerektirir.
2. In Vivo İskelet Kaslar konfokal Görüntüleme
- Pentobarbital (80 mg / kg, ip) ile fare anestezisi. Hayvan, 10-15 dakika içinde cerrahi anestezi (ayak tutam hiçbir yanıt) ulaşmak ve iskelet kaslarının in vivo görüntüleme için yeterli 1-1.5 saat, bu durum kalır.
- Arka ayaklarında biri tüyleri ve% 70 etanol ile cilt sterilize.
- Gastroknemius kasları ortaya çıkarmak için kolun dış kenarı boyunca deride bir kesi olun.
- Keskin bir forseps ile yavaşça epimysium pick up ve makas ile ile bir kesi yapmak. Dahası epimysium kaldırmak ve onun altındaki kas lifleri maruz teşrih.
- Iskelet içine TMRM bölgesinin in vivo olarak yüklenmesi içinkas, 30 dakika boyunca kas sokmak ve daha sonra gösterge içermeyen çözeltisi ile yıkamak için izotonik dengeli tuz çözeltisi içinde TMRM (500 nM) içerir.
- Konfokal mikroskop (Zeiss LSM 510) aşaması ile ilgili yan fare koyun ve açıkta kalan iskelet kası, odacığın alt kısmını oluşturan lamel karşı karşıya olan bir pozisyonda, arka uzuv kısıtlamaktadır. Lamel kas dokusu ve ters objektif (40X yağ) arasında yer almaktadır.
- Doku ve lamel arasında sıkı bir temas sağlamak için hafifçe aşağı bacak basın. Izotonik dengeli tuz çözeltisi içinde açıkta kalan kaslar bırakın.
- Kare başına bir saniye bir örnekleme hızında kayıt iki boyutlu (2B, xy) konfokal görüntüler. Her pikselin şiddeti 8-bit derinliği dijitalize edilir. Genellikle, bir seri tarama 100 kare içerir.
- > 505 nm de ilk 405 nm'de heyecanlı ve toplayarak ardışık görüntüleri toplayın sonra 488 nm'de çift dalgaboyu excitatio için> 505 nm toplanırkenmt-cpYFP n görüntüleme. Mt-cpYFP ve TMRM üçlü dalga boyu uyarım görüntüleme için, sırasıyla 405, 488 ve 543 nm sıralı uyarma kullanın, ve, 505-545 de 505-545 emisyon toplamak, ve> 560 nm.
3. Perfüze Fare Kalp Eşodaklı Görüntüleme
- Hemen iskelet kaslarının in vivo görüntüleme ile, heparin (ip) 200 birim ile fare enjekte edilir. On dakika sonra, torakotomi fare euthanize ve hızlı bir şekilde ona bağlı akciğerler ve timus ile kalp kaldırmak.
- Hızla buz gibi soğuk tampon maddesi içinde akciğer çıkarın. Timus lobları belirlenmesi ve yavaşça çıkan aort maruz geri soyma.
- Timus çıkarın ve dikkatle herhangi bir çevre doku kaldırarak aorta izole.
- Aort arkın ilk dalı öncesinde çıkan aorta üst ucunda bir kesim olun.
- Lümen maruz iki mikro dikiş forseps ile yavaşça aort duvarı tutun ve dikkatle ca üzerine aorta yerleştirinnnula (PE50 tüp). Dikiş hızla aort etrafında bağlı ise aorta bir mikro damar kelepçe ile yerinde tutulur.
- Kanül ucu aort kökü üzerinde olduğundan emin olmak için forseps ile kanül dikkatle kontrol edin, kelepçesini sökün. Ek bağları yerine kalp tutmak için gerektiğinde eklenir.
- Peristaltik pompa açın ve 1 ml / dk da kalp serpmek. Kalp perfüzyon üzerine yenerek devam edecektir.
- Perfüzyon sistemi konumunu ayarlayın ve mikroskop sahnede kalp koydu. Sahne kalbi tutan odasının ısıtılmasını sağlayan bir adaptörü vardır.
- Kısmen kalp daldırın odası içinde KHB perfüzyon çözeltisi 1 ml ilave edilir. 37 ° C de, bölmenin sıcaklığını izlemek Peristaltik bir pompa kullanılarak odasından çıkış maddesinin çıkarın.
- Giderek kalp için yeterli akımı (yaklaşık olarak 2 ml / dak) elde etmek için peristaltik bir pompa hızını artırmaktır.
- Stabilizasyon 10 dakika sonra hea perfüze10 uM Blebbistatin ve 100-500 nM TMRM ile oda sıcaklığı. Kalp atışı 10 dakika sonra yavaşlar.
- Bölmenin altındaki lamel ile kalbin sıkı bir temas sağlamak için ve ayrıca kalp atışı bastırmak için kalp üzerine hafif bir basınç uygulanır.
- Yukarıda adım 2.8 'de açıklandığı gibi sağlam miyokardiyumun konfokal görüntüleme için aynı prosedürü uygulayın. Dikkatle mümkün net bir görüntü ortaya odak düzlemi ayarlayın.
4. Görüntü İşleme ve Veri Analizi
- Tek mitokondriyal yanıp söner ve membran potansiyeli değişiklikleri analiz etmek konfokal yazılımın "Fizyolojik Analizi" modülü tarafından sağlanan araçlarını kullanın. Bu modül, genellikle konfokal sistemin görüntü edinme yazılım dahil ve görüntüde belli alanların belirlenmesi hem de zaman etiketleri ile floresan yoğunluğunun çıkış izin verir.
- Veritabanı ve analiz edilecek daha sonra seri 2D görüntü dosyasını açın.
- "Bölge tıklayınFaiz (ROI) ortalama İB'nin "geçmek için" anlamına ortalamaları İB'nin "modunda" geçmek için "Region of Interest (ROI) demek" modunda. tıklayınız. "
- Yanıp seçmek için cpYFP 488 nm kanal hariç diğer kanalların ekranını kapatın.
- Görüntü ve manuel zoom seri 2D görüntüleri oynatmak için kaydırma çubuğunu hareket ettirin.
- Nerede floresan sinyal artar geçici siteyi bularak tek mitokondriyal süperoksit yanıp tanımlayın. Yanıp işaretlemek için uygun ROI aracını kullanın. Her ROI zaman bağımlı floresan değişimi gösteren iz görüntünün yanında görünecektir.
- Tüm yanıp seçtikten sonra, diğer kanalların ekranda açın. Arka sinyal çıkarma için hücre dışında görüntü üzerinde bir ROI seçin. Birlikte zaman etiketleri ile çıkış her ROI ortalama floresan.
- Tarama zaman ve alan ile birlikte seri tarama görüntü dosyasının her basması sayısını kaydedinHücre. Excel kullanın 100 sn / 1,000 mikron 2 hücre alanının başına yanıp sayısı olarak flaş frekansı hesaplamak için.
- Her flaş (genlik, zirve için zaman ve çürüme zaman) parametrelerini hesaplamak için Interactive Data Language (IDL, ResearchSystems) yazılı geliştirilmiş özel bir program kullanın. IDL yazılım ticari olarak mevcuttur ve flaş parametre analizi için özel olarak geliştirilen program, istek üzerine yazar elde edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokole göre, tek mitokondriyal olayların in vivo görüntüleme anestezi farelerin iskelet kaslarında yapılabilir perfüze kalp yerinde görüntüleme (Şekil 1) izledi. Görüntüleme koşulları optimum ayarı bozulmamış kas dokularının net görüntüler sağlamak ve tek mitokondri çözünürlük (Şekil 2) ile olacaktır. TMRM genellikle mt-cpYFP konumunu kontrol etmek için kullanılır ve mt-cpYFP sinyali ile tam bir üst üste desen (Şekil 2) göstermelidir. TMRM sağlam hücreler 23 mitokondriyal membran potansiyeli ölçmek için bir ticari olarak temin edilebilir bir göstergesidir. Bu spektrumları cpYFP bu ayırt edilebilir. Ayrıca, sıralı uyarma yöntemi kullanılarak, TMRM ve mt-cpYFP emisyon sinyalleri birbiriyle 17 engel olmaz. Şekil 3'te gösterilmiştir Temsilcisi görüntüleri göstermektedir ki tek mitokondriyal süperoksit flaş accomembran depolarizasyon mpanied, iskelet kas dokusunda arka plan sinyalleri üzerinde geçici bir floresan artışı ve miyokard (Şekil 3) ile seri 2D tarama görüntüleri tespit edilebilir. Yüksek çözünürlük yanı sıra, yeterli floresan yoğunluğu da gereklidir. Bu lazer yoğunluğu ve toplama kanalları kazanç modüle edilmesi ile elde edilebilir. Genel olarak, hücre bazal floresans sinyali kanalın azami yoğunluğu dörtte biri üçte biri ayarlanır. Mt-cpYFP ve TMRM yüklenmesi ekspresyon seviyesi hayvanlar arasında değişebilir olduğundan, görüntüleme koşulları ince ayar, her bir deney için yapılmalıdır. Bu tür metabolik maddelerin 17,19, elektriksel stimülasyon (Şekil 4) 20, iskemik-reperfüzyon 17 gibi her ikisi de fizyolojik ve patolojik bozulmalar, bu süperoksit flaş aktivitesi hücresel metabolik durumundaki değişikliklere tepki göstermek için kullanılmıştır. 
Şekil 1. Iskelet kasları ve Langendorff perfüze kalp konfokal görüntüleme şematik gösterimi. Mt-cpYFP sentezleyen transgenik fare anestezi edilir ve arka ayaklarında birinde iskelet kasları confocal görüntüleme için maruz bırakılır. Bundan sonra, kalp modunda Langendorff perfüze ve konfokal görüntü yapılır. Görüntü işleme ve veri analizi konfokal yazılımı ve özel geliştirilmiş bir program kullanılır.
Şekil 2. Perfüze kalp in vivo ve miyokardiyumda iskelet kas liflerinin konfokal görüntüleme. A. Temsilcisi nontransgen (NTG) ve iskelet kasları gösteren görüntüler ve mt-cpYFP transgenik mitokondrial membran potansiyeli göstergesi yüklü (mt-cpYFP) fare, myo gösteren TMRM. B. Temsilcisi görüntüleriLangendorff'a içinde NTG kard ve mt-cpYFP fareler kalp perfüze. Örnek: Uyarma dalga boyu. mt-cpYFP sırasıyla 505-530 nm (mavi) ve 505-530 nm (yeşil), toplanan emisyon ile 405 ve 488 nm de heyecanlı. TMRM> 560 nm (kırmızı) toplanan emisyon ile 543 nm de heyecanlı. Ölçek çubukları 50 um =.
Şekil 3,. Tek mitokondriyal süperoksit yanıp in vivo ve perfüze kalp iskelet kaslarında tespit. A. Temsilcisi görüntüleri (üst panel) ve genişlemiş turuncu oklar tarafından vurgulanan bir tek mitokondriyal süperoksit flaş (gösteren zaman-bağımlı (405 at mt-cpYFP ve 543 nm uyarma 488 nm uyarma ve TMRM, alt panel) floresan değişimi izleri iskelet kas lifleri görüntülerin kısım). TMRM sinyal azalması ile (488 nm uyarma) artan mt-cpYFP sinyali Not eşlik ediyor. B. Örnek iMages (üst panel) ve perfüze olmuş miyokardiyumda bir tek mitokondriyal süperoksit flaş sırasında zamana bağımlı floresans değişimi (alt panel) izleri. Ölçek bar = 50 mikron. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 4. . Elektriksel stimülasyon ile perfüze kalp süperoksit flaş sıklaştırdı kalp elektriksel 2 dakika boyunca (4 V ve 2 Hz pacing) uyarıldı. Veriler ortalama ± SEM, n = 8 hücreleri. *:. P <Dinlenme karşı 0.05 büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Canlı hayvan veya perfüze organ tek mitokondriyal olayları görüntüleme mitokondrial fonksiyon değerlendirme 17,19,21,22,24,25 için geleneksel yöntemlere göre önemli bir avantaja sahiptir. Burada anlatılan teknik, hücre içi çözünürlükte gerçek bir fizyolojik duruma mitokondriyal fonksiyon in situ tespiti gerçek zaman elde edilebilir. Sistemik olarak, in vivo olarak belirli bir organ veya hücre tipinde normal fonksiyonu, mitokondri rolünü incelemek için, diğer ölçümler ile birlikte, bu, özellikle yararlıdır. Bu, çeşitli parametrelerin kontrolü ile konfokal mikroskopi ve sofistike perfüzyon sistemine karmaşık bir araya getiren bir tekniktir. Bununla birlikte, bu tekniğin kas mitokondriyal fonksiyonu 17,19,20 ile tüm vücut glikoz metabolizmasını bağlamak için kullanılır olmuştur ve şu anda kalp hastalığı mitokondriyal disfonksiyon öğrenmek için bizimle tarafından istihdam edilmektedir.
Kalp Langendorff perfusion sistem sol ventrikül basıncı izleme ve her atışı sırasında hücre içi Ca 2 + transientleri görüntüleme ile kardiyak fonksiyon değerlendirme uyumludur. Alternatif olarak, bu MitoSOX veya DCF gibi diğer floresan göstergeler miyokardiyumda kararlı durum ROS seviyelerinin in situ görüntülenmesinde kolaylaştırmak için perfüze edilebilir. Langendorff perfüze kalp yaygın fizyolojik (dobutamin ile örneğin β-adrenerjik stimülasyon) veya patolojik (örn. iskemi reperfüzyon) tedirginlikler 26-28 kalbe yanıtı değerlendirmek için kullanılır olmuştur. Bu tür tedaviler streslere cevap olarak bir mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için eş odaklı görüntüleme sistemi içine dahil edilebilir.
Bu yöntemin sınırlamaları canlı hayvan görüntüleme için uygun olan dokular / organların seçimini içerir. Gibi kas iskelet, deri altı yapıları ve yüzeysel sinirler gibi yüzeysel dokularda canlı ani konfokal görüntüleme için idealdirMal. Organı teşhir ederken iç organlar nedeniyle fare büyük hasar canlı hayvan görüntüleme için teknik olarak uygun değildir. Ancak iç organların fizyolojik bir taklitçi ortam muhafaza edilebilir, bu tür Langendorff perfüze kalp veya beyin dilim kültür olarak, organ perfüzyon / kültür için ayarlanabilir. Buna ek olarak, konfokal mikroskop organ yüzeyinin altında hücrelerin birkaç tabakalarının görüntüleme sağlar: 30-50 um, etkili bir görüntüleme derinliğe sahiptir. Bu sistem (1 mm 'ye kadar gibi) çok daha yüksek bir nüfuz etme derinliğine sahip olan bir çoklu foton mikroskopu ile kombine edilebilir ve sağlam kalp 29 mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için kullanılmıştır mümkündür. Hareket eser düşünülmelidir başka önemli konudur. Iskelet kasları ve miyositlerindeki mitokondri tarama sırasında minimal bir hareket gösterdi. Ayrıca, kalp-indüklenen hareket yapaylığı Blebbistatin a ile perfüzyon tarafından bastırılmış ya da elimine edilebilirnd kalp üzerine hafif basınç uygulaması. Bu nöronlar ve fibroblastlar gibi hücre tiplerinde, olarak, mitokondri sabit ve etkili bir hareketleri tabi olabilir. Görüntüleme işleme ve analiz sırasında, hareket artefaktından nedeniyle herhangi bir sinyal değişiklikleri dikkatle tespit ve ekarte edilmelidir.
Bu tekniğin ek zorluklar deney boyunca, uygun durum, pozitif kontrol ve veri yorumlama muhafaza içerir. Anestezi uygulanmış farelerde iskelet kası görüntüleme için, açıktaki kas yüzeyi her zaman fizyolojik tamponlarda daldırılmalıdır. Örneğin nefes gibi fare Hayati işaretler, deney boyunca izlenmelidir. Perfüze kalp çalışmalar için, uygun oksijenasyon, sıcaklık kontrolü ve substrat besleme gereklidir. Pozitif kontroller, dokuların ve yanıt verme durumunu kontrol etmek için önerilmektedir. Bunu yapmak için, fareler, ya da glikoz ve insülin perfüze kalpleri ile enjekte edilebilir elektrik uyarıcı olabilir,yonunun veya isoproterenol ile perfüze. Artan süperoksit yanıp Bu tedavilerin (Şekil 4) 19,20 sonra dikkate alınmalıdır. Hareket yapaylığı nedeniyle azalmış iş yükü alt-fizyolojik koşulları oluşturur inhibe kalp atışı yoluyla bastırılır Buna ek olarak, zaman atlamalı görüntüler alınır. Bu nedenle, perfüze kalp deney in vivo duruma yakın bir mimetik olarak kabul edilmelidir.
Son olarak, bu teknik, bir Zeiss konfokal (LSM 510) kullanılarak geliştirilmiştir. Diğer konfokal sistemi (örneğin Nikon, Olympus ve Leica) sistemi aşağıdaki gereksinimleri karşılaması durumunda kullanılabilir: (1) time-lapse çerçevesi tarama modu vardır, (2) 1 sn / kare bir örnekleme oranı, ve (3) tek mitokondri çözünürlük (örn. 1 mikron x 2 mikron) ulaşabilir. Bir konfokal sistemin yazılım genellikle veriyor gibi t ROI'ler ve floresan yoğunluğu çıkışı tanımlayan basit görüntü işleme ve analiz,etiketleri ime. Alternatif olarak, Görüntü J yazılım görüntü analizi ve flash parametre hesaplanmasında her ikisi için de kullanılabilir.
Özet olarak, bu gibi in vivo veya perfüze kalp, iskelet kaslarında, süperoksit basması gibi bir mitokondriyal olayların görüntüleme mitokondriyal fonksiyonun gerçek zamanlı saptanması için eşsiz bir yaklaşımdır. Bu teknik, geleneksel in vitro ölçümleri üzerinde önemli bir gelişme olduğunu ve mitokondriyal fonksiyonu ve fizyolojik koşullar altında gerçek hücresel süreçleri / fonksiyonları ile ilişkisi hakkında daha doğru bir değerlendirme sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar Dr teşekkür etmek istiyorum. Heping Cheng, onların yararlı yorumlarından ve bu yöntemi geliştirerek teknik destek için Huiliang Zhang ve Stephen Kolwicz. Bu çalışma NIH hibe ve Amerikan Kalp Derneği WW Scientist Kalkınma Grant tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Blebbistatin | Toronto Research Chemicals | B592500 | |
| CaCl2 | Acros Organics | AC34961-5000 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006-500 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1 | |
| MgCl2•6H2O | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | M1880-1 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282-500 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014-1 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256-25 | |
| TMRM | Invitrogen | T-668 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including "Physiological Analysis" module. | |||
References
- Brookes, P. S., Yoon, Y., Robotham, J. L., Anders, M. W., Calcium Sheu, S. S. Calcium, ATP, and ROS: a mitochondrial love-hate triangle. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, 817-833 (2004).
- Scheffler, I. E. Mitochondria. , 2nd, J. Wiley and Sons, Inc. (2008).
- Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondria in heart failure. Cardiovasc. Res. 88, 40-50 (2010).
- Griffiths, E. J. Mitochondria and heart disease. Adv. Exp. Med. Biol. 942, 249-267 (2012).
- Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).
- Pieczenik, S. R., Neustadt, J. Mitochondrial dysfunction and molecular pathways of disease. Exp. Mol. Pathol. 83, 84-92 (2007).
- Szentesi, P., Zaremba, R., van Mechelen, W., Stienen, G. J. M. ATP utilization for calcium uptake and force production in different types of human skeletal muscle fibres. J. Physiol. 531, 393-403 (2001).
- Lemieux, H., Hoppel, C. L. Mitochondria in the human heart. J. Bioenerg. Biomembr. 41, 99-106 (2009).
- Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. J. Biol. Chem. 217, 409-427 (1955).
- Lambert, A. J., Brand, M. D. Reactive oxygen species production by mitochondria. Methods Mol Biol. 554, 165-181 (2009).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435, 297-312 (2011).
- Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15038-15043 (2006).
- Dickinson, B. C., Srikun, D., Chang, C. J. Mitochondrial-targeted fluorescent probes for reactive oxygen species. Curr. Opin. Chem. Biol. 14, 50-56 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, 22284-22293 (2004).
- Hanson, G. T., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, 13044-13053 (2004).
- Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat. Methods. 3, 281-286 (2006).
- Wang, W., et al. Superoxide Flashes in Single Mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
- Wei-Lapierre, L., et al. Respective Contribution of Mitochondrial Superoxide and pH to Mitochondria-targeted Circularly Permuted Yellow Fluorescent Protein (mt-cpYFP) Flash Activity. J. Biol. Chem. 288, 10567-10577 (2013).
- Fang, H., et al. Imaging superoxide flash and metabolism-coupled mitochondrial permeability transition in living animals. Cell Res. 21, 1295-1304 (2011).
- Wei, L., et al. Mitochondrial superoxide flashes: metabolic biomarkers of skeletal muscle activity and disease. FASEB J. 25, 3068-3078 (2011).
- Sheu, S. S., Wang, W., Cheng, H., Dirksen, R. T. Superoxide flashes: illuminating new insights into cardiac ischemia/reperfusion injury. Future Cardiol. 4, 551-554 (2008).
- Wei, L., Dirksen, R. T. Perspectives on: SGP symposium on mitochondrial physiology and medicine: mitochondrial superoxide flashes: from discovery to new controversies. J. Gen. Physiol. 139, 425-434 (2012).
- Johnson, I., Spence, M. T. Z. Ch. 12.2. The Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , Life Technologies Corp. 510-511 (2013).
- Wang, X., et al. Superoxide flashes: elemental events of mitochondrial ROS signaling in the heart. J. Mol. Cell Cardiol. 52, 940-948 (2012).
- Li, K., et al. Superoxide flashes reveal novel properties of mitochondrial reactive oxygen species excitability in cardiomyocytes. Biophys. J. 102, 1011-1021 (2012).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).
- Pasdois, P., et al. Effect of diazoxide on flavoprotein oxidation and reactive oxygen species generation during ischemia-reperfusion: a study on Langendorff-perfused rat hearts using optic fibers. Am. J. Physiol. 294, H2088-H2097 (2008).
- Granville, D. J., et al. Reduction of ischemia and reperfusion-induced myocardial damage by cytochrome P450 inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1321-1326 (2004).
- Davidson, S. M., Yellon, D. M., Murphy, M. P., Duchen, M. R. Slow calcium waves and redox changes precede mitochondrial permeability transition pore opening in the intact heart during hypoxia and reoxygenation. Cardiovasc. Res. 93, 445-453 (2012).
