Summary
Vi beskriver en metode til opstilling af en effektiv immobilisering af BMP-2 på overflader. Vores tilgang er baseret på dannelsen af en selvstændig samlet monolag for at opnå den kovalente binding af BMP-2 via dets frie aminrester. Denne metode er et nyttigt værktøj til at studere signalering på cellemembranen.
Abstract
Knoglemorfogenetisk protein 2 (BMP-2) er en vækstfaktor, indlejret i den ekstracellulære matrix af knoglevæv. BMP-2 virker som udløser af mesenkymal celledifferentiering til osteoblaster og dermed stimulere heling og de novo knogledannelse. Den kliniske anvendelse af rekombinant human BMP-2 (rhBMP-2), sammenholdt med stilladser har rejst de seneste kontroverser, baseret på tilstanden af præsentation og det beløb, der skal leveres. Protokollen præsenteres her giver en enkel og effektiv måde at levere BMP-2 for in vitro-undersøgelser på celler. Vi beskriver, hvordan der dannes en selv-samlet monolag bestående af en heterobifunktionel linker, og vise efterfølgende binding trin for at opnå kovalent immobilisering af rhBMP-2. Med denne fremgangsmåde er det muligt at opnå en holdbar præsentation af BMP-2, samtidig med at den biologiske aktivitet af proteinet. Faktisk overfladen immobilisering af BMP-2 giver målrettede undersøgelser ved at forhindre uspecifikke annoncerorption og samtidig reducere mængden af vækstfaktor, og især, at hindre ukontrolleret udslip fra overfladen. Både på kort og lang sigt signaleringsbegivenheder udløst af BMP-2 finder sted, når cellerne udsættes for overflader præsenterer kovalent immobiliseret rhBMP-2, hvilket gør denne metode egnet til in vitro-undersøgelser på celle respons på BMP-2 stimulation.
Introduction
Knoglemorfogenetisk protein 2 (BMP-2) er et medlem af den transformerende vækstfaktor (TGF-β)-familien og fungerer som inducer af de novo knogledannelse såvel som regulator af adskillige væv under fosterudviklingen og voksen homeostase 1-3. Hver monomer af det biologisk aktive homodimere BMP-2-protein indeholder et "cysteinknude" motiv, som er stærkt konserveret i alle BMP'er 4. Seks af de syv cysteinrester danner intramolekylære disulfidbindinger, som stabiliserer hver monomer, mens den syvende cystein er involveret i dimerisation, danner en intermolekylær binding mellem de to monomerer 5,6. Dette stærkt konserverede cysteinknude definerer den tredimensionale struktur af BMP-2-protein og bestemmer dets unikke egenskaber, såsom modstandsdygtighed over for varme, denatureringsmidler og sur pH 7-9. BMP-2 binder til serin / threonin kinase transmembrane receptorer, for derved at inducere signaltransduktion
I knogler, BMP-2 inducerer differentiering af mesenkymale stamceller til osteoblaster og dermed stimulere den helbredende og de novo dannelsen af knogle. I øjeblikket rekombinant udtrykt BMP-2 anvendes klinisk til at øge helingen af brækkede sites. En almindelig strategi i knoglevæv teknik er brugen af injicerbare vækstfaktorer, hvilket er mindre invasiv sammenlignet med lokale afgivelsessystemer. Imidlertid har in vivo-undersøgelser og kliniske anvendelser vist, at den korte biologiske halveringstid, uspecifik localt andet lige og hurtig lokal clearance af BMP-2, kan føre til flere lokale, ektopiske og systemiske problemer 15. Derfor, for at opnå en effektiv præsentation, klemning eller immobilisering af BMP-2 inden for eller på materialer er nødvendigt for dens lokale og vedvarende levering på target site. Vedvarende levering kan opnås med ikke-kovalente tilbageholdelse tilgange, såsom fysisk entrapment, adsorption eller ion kompleksdannelse 16. Imidlertid er det kendt, at uspecifik adsorption af proteiner til overflader kan resulterer i denaturering af molekylerne 17. Til den covalente binding af vækstfaktorer har forskellige typer af understøtninger blevet udviklet i løbet af det sidste årti. Brugen af bifunktionelle forbinder molekyler, der er målrettet amino-eller carboxylgrupper af proteinet for eksempel, er en type af tilgang, der ikke nødvendigvis kræver protein modifikation at nå sit immobilisering. I virkeligheden, mens protein modifikation har den fordel, at kontrollere protein orientering,indførelsen af kunstige domæner, peptid tags og stedspecifikke kæder kan ændre den biologiske aktivitet af vækstfaktorer 17. Således at omgå denaturering på grund af interaktion med det understøttende materiale overflader kan funktionaliseres på forhånd, for eksempel med en selv-samlet monolag (SAM) af et linkermolekyle, efterfulgt af kobling af den ønskede faktor 18. Vi har brugt en SAM tilgang til kovalent immobilisere BMP-2 på en overflade ved at målrette sine frie aminrester og har vist, at det immobiliserede protein bevarer både den korte og langsigtede biologiske aktivitet 19. Denne protokol giver en enkel og effektiv måde at levere BMP-2 til celler til in vitro-undersøgelser på de mekanismer, der opstår ved cellemembranen og regulerer intracellulær signalering ansvarlig for osteogenisk signalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Syntese af 11-Mercaptoundecanoyl-N-hydroxysuccinimidester (MU-NHS)
- Tilsæt dråbevis en opløsning af 500 mg N-hydroxysuccinimid og 30 mg 4 - (dimethylamino) pyridin i 10 ml acetone (pa) til 1 g 11-mercaptoundecanoic syre i 40 ml dichlormethan (pa) ved stuetemperatur (RT).
- Reaktionen til 0 ° C, afkøles og tilsættes dråbevis 1,1 g N, N '-dicyclohexylcarbodiimid i 10 ml dichlormethan (under nitrogenatmosfære). Reaktionen ved lav temperatur i 1 time Hold og derefter omrøres ved stuetemperatur natten over.
- Filtrer bundfaldet og tørres under reduceret tryk. Produktet renses ved flash-kromatografi med råolie benzen og ethylacetat (pa) i et forhold på 1:1.
2. Udarbejdelse af homogene Guld Lag
- Rene dækglas med præcision klude og sonikeres dem i 5 minutter i en opløsning indeholdende en 1:1 blanding af ethylacetat (pa) og methanol (pa). Rinse substrater med methanol og tørre ud under nitrogen flow.
- Anbring de rene substrater i katodeforstøvningscoatingssystem enhed. Evakuere kammeret. Fjern det øverste chromoxid lag chrom mål ved katodeforstøvning i 60 sek. Anbring prøverne under metalbjælke og belægge dem med et 10 nm chromlag, efterfulgt af overtrækning med en 40 nm guld lag.
3. Overflade Immobilisering af BMP-2
- Opløs MU-NHS i N, N-dimethlyformamide (DMF) til en endelig koncentration på cirka 1 mM og inkuberes guld substrater MU-NHS opløsning ved stuetemperatur i 4 timer under nitrogenatmosfære.
- Sonikatet overflader i DMF i 2 minutter, skylles med DMF og MeOH og tørre under en nitrogenstrøm.
- Forbered en stamopløsning af rhBMP-2 i steril 4 mM HCl med en koncentration på 100 mg / ml (STORE portioner ved -80 ° C). Til arbejde fortyndinger (3,5 mg / ml), fortyndes stamopløsningen i PBS / NaCl (PBS indeholdende 1 M NaCl) og etdjust til pH 8,5 umiddelbart før brug.
- Inkuber overflader funktionaliserede MU-NHS i rhBMP-2-bearbejdning opløsning ved 4 ° C natten over. Fjern inkubation supernatant. Sonikatet overflader i PBS / NaCl i 2 minutter og vask 3 gange med sterilt PBS / NaCl.
4.. Overflade karakterisering
- At blokere uspecifik adsorption af antistof, inkuberes overflader med en 5% BSA (w / v) i PBS-opløsning i 1 time ved stuetemperatur, efterfulgt af inkubation med et anti-BMP-2-antistof (1:100 i 1% (w / v ) BSA / PBS-opløsning) i 1 time ved stuetemperatur. Vask overflader to gange med PBS og sonikeres i 30 sek.
- Inkuber substrater med HRP-konjugeret sekundært antistof (1:1000 i 1% (w / v) BSA / PBS-opløsning) i 30 minutter ved stuetemperatur, og derefter vaskes to gange med PBS.
- Brug Ampliflu Red assay til måling af HRP enzymatisk aktivitet ved 570 nm med en pladelæser.
5.. Analyse af biologisk aktivitet
- Seed 1 x 10 5 mus C2C12 myoblaster per brønd i 6-godt plates i vækstmedium, der består af en høj glucose DMEM indeholdende pyruvat suppleret med 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin og inkubere dem i 24 timer ved 37 ° C / 5% CO2.
- Sulte cellerne i serumfrit DMEM i 3-5 timer forud for podning på overfladerne dekoreret med immobiliseret BMP-2.
- Til undersøgelse af kortsigtet signalering induktion, erstatte mediet med 200 pi frisk serum-frit DMEM og placere de immobiliserede BMP-2 flader over cellerne. Overfladen bør håndteres med fin spids pincet for at undgå ridser.
- Fjern forsigtigt overflader opsuges mediet med en pipette, vaskes cellerne to gange med PBS. Fortsæt til analyse af celle-responser.
- Til analyse af langsigtede biologisk aktivitet, plade celler på overflader og kultur dem ved 37 ° C / 5% CO2 i lave serum betingelser (2% FBS) i seks dage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vores setup, var guld valgt som hjælpestof, da det giver en biologisk uspecifik men kemisk tunable system. Endvidere kan anvendelsen af selvsamlende monolag indebærer mange fordele: SAM spontant adsorberer via deres "hoved-grupper" på metaller og danner monolag med få fejl, mens deres funktionelle endelige grupper kan modificeres yderligere. Således giver de en platform for at skræddersy egenskaberne for grænsefladen i et kontrolleret endnu meget fleksible måde 20.
Til immobilisering af BMP-2 på guld overflader, brugte vi en fremgangsmåde i to trin: 1) bindende MU-NHS linker til guldlaget, og derefter 2) at omsætte linkeren med proteinet (se figur 1). For at bevise binding af rhBMP-2, vi anvendte et enzymimmunoassay. I dette assay overflader præsenterer immobiliseret rhBMP-2, blev inkuberet med et BMP-2-specifikt antistof og et sekundært antistof konjugeret med HRP. Binding af sidstnævnte kan determined hjælp af en Ampliflu Red-opløsning. I nærvær af hydrogenperoxid HRP katalyserer omdannelsen af den farveløse Ampliflu Rød (10-acetyl-3 ,7-dihydroxyphenoxazine) i fluorescerende forbindelse resorufin. Vi har registreret overflade immobiliseret rhBMP-2 (iBMP-2) før og efter nærmer adhærente celler fra oven med funktionaliserede overflader. Bemærk venligst, at påvisning af rhBMP med Ampliflu Red analysen, prøverne er genstand for flere inkubationstrinnene og behandlinger. Derfor er det ikke muligt at undersøge den samme overflade før og efter cellestimulering. Figur 2A viser den vellykkede binding af rhBMP-2 på overfladen i en konformation anerkendt af anti-BMP-2-IgG. Figur 2B viser en iBMP- 2 overflade, der blev anvendt til at stimulere cellerne i 30 minutter forud for HRP immunoassay. Selv efter cellestimulering proteinet detekteres på overfladen.
Cell reaktioner på overflader præsenterer immobiliseret rhBMP-2 blev evalueret og sammenlignet med effekten af ikke-behandlede guld substrater (negativ kontrol). For at minimere indflydelsen af vedhæftningen processen på en analyse af den kortsigtede signaler, blev en særlig opsætning udviklet til cellestimulering. Her blev C2C12-celler stimuleret i 30 minutter med rhBMP-2 funktionaliserede overflader, der nærmer sig fra toppen. Musen myoblastcellelinjen C2C12 er pluripotente mesenkym precursor cellelinje, som er almindeligt anvendt som et modelsystem til at studere den tidlige fase af osteogen differentiering i knogledannelse i muskelvæv. I denne model, BMP-2 inhiberer differentiering af celler i flerkernede myorør og inducerer osteoblast Fænotypers 21. Aktiveringen af Smad 1/5/8, som er nedstrøms reportere af BMP-2-signalvejen, analyseres ved western blotting. Som vist i figur 3A observeres Smad phosphorylering efter 30 minutter stimulering med iBMP-2, mens ingen phosphorylering af Smad 1/5/8 opståri celler udsat for ubehandlede guld prøver. Dette resultat indikerer, immobiliseringsprocessen ikke ændrer BMP-2 kortsigtet aktivitet og udløser tidlige trin i Smad signalering.
For at bestemme om iBMP-2 påvirker langsigtet osteogen differentiering, ekspressionsniveauet af alkalisk phosphatase (ALP), et osteogent markering, blev undersøgt ved en kolorimetrisk assay. ALP aktivitet af C2C12-celler blev målt efter inkubation af cellerne i 6 dage på almindeligt guld (kontrol) og iBMP-2 overflader. ALP-aktivitet i lysater af celler dyrket på iBMP-2 overflader viser en signifikant højere absorption i sammenligning med kontrollen (figur 3B). Dette resultat viser, at iBMP-2 inducerer ekspressionen af den osteogene markør ALP i C2C12-celler. Denne cellelinje er kendt for at differentiere efter at have nået sammenflydning under lavt serum tilstand, hvorved der dannes myorør og udtrykke karakteristiske myogene proteiner. Men behandling med BMP-2, bevirker en ændring idifferentiering vej fra myoblastic til osteoblastisk derfor undertrykke dannelsen af myorør. For at undersøge effekten af iBMP-2 på myogenese blev C2C12 celler udpladet direkte på guld (kontrol) eller funktionaliserede overflader og dyrkes under differentiering (lavt serum) betingelser. Efter 6 dage blev farvning af myosin tung kæde (MHC) udføres. Som vist i figur 3C, C2C12 celler ikke danne MHC positive myorør i nærvær af iBMP-2, men ikke på guld substrater.
Figur 1. Ordning af immobiliseringsprocessen af rhBMP-2 på guld overflader. Er Dækglas belagt med en guld lag og efterfølgende inkuberet med en heterobifunktionel linker (MU-NHS) resulterer i en NHS-funktionaliserede selv-samlet monolag (SAM). Primære aminer af BMP-2 reagerer med linkeren fører til covalently immobiliserede protein på underlaget. Klik her for at se større figur .
Figur 2. Overfladebundet rhBMP-2 kan påvises ved enzymatisk immunassay før (A) og efter (B) cellestimulering forsøg. Immobiliserede rhBMP-2 blev kvantificeret ved hjælp af Ampliflu Red kolorimetrisk assay. Absorptionen blev målt ved 570 nm, og data blev normaliseret til at styre (ikke-behandlede guld overflader) værdier. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen fra middelværdien n> 3.
Figur 3. Immobilized rhBMP-2 forbliver biologisk aktive og inducerer kortvarig somsåvel som langsigtede signalering begivenheder. (A) C2C12 celler blev stimuleret i 30 min ved udsættelse for guld overflader (kontrol) og overflader med kovalent immobiliseret rhBMP-2 (iBMP-2) nærmer sig fra toppen. Efter cellelyse blev prøver immunblottet for p-Smad1/5/8 og β-actin. (B) Den enzymatiske aktivitet af alkalisk phosphatase (ALP) angiver osteogen differentiering af C2C12-celler og blev målt fra cellelysater efter en 6 dages inkubation periode på kontrol eller iBMP-2 overflader, hhv. ALP-aktivitet blev målt som absorbansen ved 405 nm. Søjlediagram viser data erhvervet efter en 60-min reaktion. Fejlsøjlerne angiver standardafvigelse, n = 3, * p <0.01. (C) C2C12-celler blev podet på angivne overflader og dyrket i 6 dage under lave serum betingelser at tillade myogenese. Billederne viser myosin tung kæde (MHC) farvning af flerkernede myorør (grøn) og DAPI kerner farvning (blå). Billede forstørrelse 20x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol beskriver vi forberedelse af overflader funktionaliserede med bioaktive rhBMP-2. Denne fremgangsmåde består af to trin: 1) den indledende dannelsen af en selvsamlende monolag (SAM) i en bifunktionel linker på guld overflade, 2) kovalent immobilisering af rhBMP-2 protein. I tidligere arbejde har vi valideret effektiv binding af den bifunktionelle linker og vækstfaktoren, og viste, at overflade-immobiliserede rhBMP-2 bevarer sin biologiske aktivitet 19. Bioaktiviteten af vækstfaktorer præsenteres i en immobiliseret form er også blevet vist i andre undersøgelser, der viser, at frigivelsen af proteiner og deres efterfølgende internalisering er ikke væsentlige for cellestimulering 24,25. Faktisk kovalent immobilisering af vækstfaktorer tillader vedvarende stimulering af målcellerne og samtidig opretholde en effektiv dosis på grund af forøget belægningsgrad forskellige typer af receptorer på cellemembranen 22,23,26-28.
Til fremstilling af overflader præsenterer immobiliseret rhBMP-2, der bør udvises ved håndtering overfladerne under hele proceduren og i forberedelsen af rhBMP-2-løsning. De dækglas skal være rene og tørre, og ingen tegn på fejl eller urenheder skal være synlig. Ridse overfladen med en pincet og pipetter bør undgås. På overfladen funktionalisering trin ved hjælp af rhBMP-2, er det vigtigt at anvende en bærerfri rekombinant protein, dvs uden tilsat bovint serumalbumin i præparatet, for at undgå uønsket immobilisering af bæreren på overfladen. RhBMP-2-lager (100 ug / ml) opløst i 4 mM HCI. Når overflader inkuberet med rhBMP-2-opløsning, skal pH justeres til neutral til let alkalisk pH for at forbedre omsætningen af aminogruppen i proteinet med NHS gruppe med overfladebundet linker. Hvis pH-værdien er for lav, kan NHS-gruppen hydrolyseres før det kan reagere with aminogrupperne i proteinet. Vi bruger PBS indeholdende 1 M NaCl 29 og tilføje rhBMP-2 fra lager og derefter justere pH med KOH (10 mM).
Med denne protokol har vi opnået en vellykket immobilisering af bioaktive rhBMP-2 på overflader, fordi: 1) vi etableret en to-trins metode, 2) brugte vi en passende linker til afstand opnå fra overfladen og til at binde proteinet uden større interferens på sit interaktion med receptoren. Den amin-reaktive alkanthiol, 11-mercaptoundecanoyl-N-hydroxysuccinimidester (MU-NHS) blev bundet til guld substrat i det første trin. Som alkanthioler selvsamle på metaller som guld, der danner en meget ordnet monolag, fremmer udsmykningen af overflader med en række linkermolekyler 30-32. SAM beskytter biomolekyler fra direkte kontakt med fast overflade og dermed minimere risikoen for denaturering 32. Endvidere er længden af linkeren bestemmer også REActivity af SAM. NHS-grupper af linkere bestående af mindst elleve carbonatomer, såsom MU-NHS, er mere tilgængelige, hvilket resulterer i øget protein immobilisering i forhold til binding til kortere linkere 34. Immobilisering af rhBMP-2 sker ved forskydning af NHS-gruppen af lysinrester i proteinet 34. Overvejer blot steriske miljø, reaktionen fra overfladeimmobiliseret NHS grupperne sandsynligvis finder sted på de fleksible N-terminale rester 35. Men som vist for andre ligander, kan længden og fleksibiliteten i linker muliggøre interaktion med ellers sterisk hindrede bindingssteder, og dermed kompensere for ugunstige orientering 36,37. I upubliceret arbejde sammenlignet vi ét trin med en to-trins immobilisering strategi. Sammenligningen mellem anvendelse af en opløsning indeholdende både protein og linkere, og den sekventielle overflade binding af linkeren og protein, viste, at kun de to-trin strategi resulterede i bioaktive ligand immobilisering. Dette kan være på grund af en afskærmning virkning af SAM, hvilket hindrer proteindenaturering, som ellers kunne finde sted på guld. Da linker allerede er forankret til overfladen, er cross-kobling mellem proteiner gennem enden grupper af linkeren og deraf følgende inaktivering omgået 38..
For forsøgene med celler stimuleret med overfladeimmobiliseret rhBMP-2, er det afgørende at afgøre på forhånd, at C2C12 ikke danne myorør i kulturen kolben før såning dem på underlaget. Derfor har celler, der skal opbevares subconfluent i kultur. Det parti oksefosterserum bruges til dyrkning og til forsøgene skal testes for at sikre, at ingen osteogene stimuli er til stede. Dette udføres ved anvendelse af Quantikine-assay til påvisning af knoglemorfogenetiske proteiner, og ved at teste celler for osteogene differentiering markører, fx Alkal ine phosphatase udtryk. Ved håndtering af substrater for stimulation fra toppen af kulturer, er det igen vigtigt at undgå ridser med pincetten. Tørring af den kultur og klemning af cellerne bør undgås i alle tilfælde, ellers celle forvrængning og død vil have en negativ indflydelse på respons på BMP-2 stimulation. Vi anbefaler pipettering cirka 100 ul DMEM i hver brønd af en 6-brønds plade, hvor cellerne dyrkes før påføring af substratet på cellerne. Cellerne bør observeres under mikroskop for at sikre at ingen morfologiske ændringer er udløst af tilstedeværelsen af overfladerne på toppen af kulturerne. Endelig, når fjernelse af substraterne, den ene side løftes forsigtigt med pincet og substratet forsigtigt skrællet. En umiddelbar check for enhver celleskader med en lys felt mikroskop skal udføres, samt en kontrol af de substrater for at afgøre, om nogen celle bindsler eller større urenheder er til stede.
_content "> Afslutningsvis præsenterede to-trins procedure giver et nyttigt værktøj til at immobilisere rhBMP-2 på substrater via sine aminrester at studere dens indvirkning på cellulære reaktioner. Den beskrevne strategi kombinerer mange fordele. På den ene side, er det ikke begrænset til BMP-2, men den kan også anvendes på andre vækstfaktorer af BMP familien, da de udgør en særdeles konserveret aminosyre struktur. På den anden side, ved at forhindre uspecifik adsorption, denne fremgangsmåde muliggør målrettet undersøgelse af BMP-2 og samtidig reducere mængden af vækstfaktor, og især, hindre ukontrolleret udslip fra overfladen.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Prof. JP Spatz (Institut for Biofysisk kemi, University of Heidelberg og Institut for nye materialer og Biosystems, Max Planck Instituttet for Intelligent Systems, Stuttgart) for hans venlige støtte. Den finansielle støtte fra Max-Planck-Gesellschaft og Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB/TR79 til ØK-A.), Er også i høj grad anerkendt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 4-(dimethylamino)pyridin | Sigma-Aldrich | 522805 | |
| Acetone | AppliChem | A2282 | |
| 11-mercaptoundecanoic acid | Sigma-Aldrich | 674427 | |
| Dichlormethane | Merck | 106050 | |
| N,N'-dicyclohexylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | |
| Petroleum benzene | Merck | ||
| Glass coverslips | Carl Roth | M 875 | |
| Ethylacetate | AppliChem | A3550 | |
| Methanol | Carl Roth | 4627 | |
| N,N-dimethylformamide | Carl Roth | T921 | |
| rhBMP-2 | R&D Systems | 355-BM | Carrier-free; expressed in E.coli |
| PBS | PAA | H15-002 | |
| NaCl | Carl Roth | HN00.2 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS) | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Anti-rhBMP-2 | Sigma | B9553 | |
| Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Secondary antibody |
| Ampliflu Red assay | Sigma | 90101 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid | Gibco | 41966 | High glucose |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | Sterile filtered, cell culture tested |
| Pen/Strep | Gibco | 15140 | |
| Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na | Gibco | 25300 | |
| Glycine (0.1 M) | Riedel-de Haën | 33226 | |
| IGEPAL CA-630 (1%) | Sigma | I8896 | Lysis buffer (ALP assay)19 |
| Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM) | Carl Roth | HNO3.2 | |
| Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM) | Carl Roth | 3533.1 | |
| p-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | S0942 | Phosphatase substrate |
| Anti-mysin heavy chain (MHC) | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | MF20 | Monoclonal antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A11001 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Equipment | |||
| Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz | BANDELIN electronic GmbH Co. KG | ||
| MED 020 Sputtercoating system | BAL-TEC AG | Coating conditions Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec |
|
| Tecan Infinite M200 Plate reader | Tecan | ||
References
- Helm, G., Andersson, D., et al. Summary statement: Bone morphogenetic proteins: Basic science. Spine. 27 (16S), S9 (2002).
- Hogan, B. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10 (13), 1580-1594 (1996).
- Reddi, A. BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins. Cytokine Growth Factor Rev. 16, 249-250 (2005).
- Rengachary, S. Bone morphogenetic proteins: basic concepts. Neurosurg Focus. 13 (6), 1-6 (2002).
- Schlunegger, M., Grütter, M. An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 Å; resolution of human transforming growth factor-β2. Nature. 358, 430-434 (1992).
- Scheufler, C., Sebald, W., Hülsmeyer, M. Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 Å resolution. J. Mol. Biol. 287 (1), 103-115 (1999).
- Nimni, M. Polypeptide growth factors: targeted delivery systems. Biomaterials. 18 (18), 1201-1225 (1997).
- Wozney, J., Rosen, V. Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin. Orthop. Related Res. 346, 26 (1998).
- Rosen, V. BMP and BMP inhibitors in bone. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 19-25 (2006).
- Kirsch, T., Sebald, W., Dreyer, M. K. Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex. Nat. Struct. Biol. 7 (6), 492-496 (2000).
- Keller, S., Nickel, J., et al. Molecular recognition of BMP-2 and BMP receptor IA. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (5), 481-488 (2004).
- Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. BMP receptor signaling: transcriptional targets, regulation of signals, and signaling cross-talk. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (3), 251-263 (2005).
- Nohe, A., Hassel, S., et al. The mode of bone morphogenetic protein (BMP) receptor oligomerization determines different BMP-2 signaling pathways. J. Biol. Chem. 277 (7), 5330-5338 (2002).
- Sieber, C., Kopf, J., et al. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 343-355 (2009).
- Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
- Luginbuehl, V., Meinel, L., et al. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).
- Nakaji-Hirabayashi, T., Kato, K., et al. Oriented immobilization of epidermal growth factor onto culture substrates for the selective expansion of neural stem cells. Biomaterials. 28 (24), 3517-3529 (2007).
- Gonçalves, R., Martins, M., et al. Bioactivity of immobilized EGF on self-assembled monolayers: Optimization of the immobilization process. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 94A. 2 (2), 576-585 (2010).
- Pohl, T. L. M., Boergermann, J. H., et al. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).
- Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).
- Katagiri, T., Yamaguchi, A., et al. Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage. J. Cell Biol. 127 (6), 1755-1766 (1994).
- Whitaker, M. J., Quirk, R. A., et al. Growth factor release from tissue engineering scaffolds. J. Pharm. Pharmacol. 53 (11), 1427-1437 (2001).
- Uludag, H., D'Augusta, D., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: a correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J. Biomed. Mater. Res. 50 (2), 227-238 (2000).
- Kashiwagi, K., Tsuji, T., et al. Directional BMP-2 for functionalization of titanium surfaces. Biomaterials. 30 (6), 1166-1175 (2008).
- Karageorgiou, V., Meinel, V. L., et al. Bone morphogenetic protein-2 decorated silk fibroin films induce osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells. J. Biomed. Mater. Res. 71 (3), 528-573 (2004).
- Rose, F. R. A. J., Hou, Q., et al. Delivery systems for bone growth factors - the new players in skeletal regeneration. J. Pharm. Pharmacol. 56 (4), 415-427 (2004).
- Masters, K. S. Covalent growth factor immobilization strategies for tissue repair and regeneration. Macromol. Biosci. 11 (9), 1149-1163 (2011).
- Crouzier, T., Fourel, L., et al. Presentation of BMP-2 from a soft biopolymeric film unveils its activity on cell adhesion and migration. Adv. Mater. 23 (12), H111-H118 (2011).
- Ruppert, R., Hoffmann, E., et al. Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity. European Journal of Biochemistry. 237 (1), 295-302 (1996).
- Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).
- Kato, K., Sato, H., Iwata, H. Immobilization of histidine-tagged recombinant proteins onto micropatterned surfaces for cell-based functional assays. Langmuir. 21 (16), 7071-7075 (2005).
- Martins, M., Curtin, S., et al. Molecularly designed surfaces for blood deheparinization using an immobilized heparin-binding peptide. J. Biomed. Mater. Res. 88 (1), 162-173 (2009).
- Limbut, W., Kanatharana, P., et al. A comparative study of capacitive immunosensors based on self-assembled monolayers formed from thiourea, thioctic acid, and 3- mercaptopropionic acid. Biosens. Bioelectron. 22 (2), 233-240 (2006).
- Patel, N., Davies, M., et al. Immobilization of protein molecules onto homogeneous and mixed carboxylate-terminated self-assembled monolayers. Langmuir. 13 (24), 6485-6490 (1997).
- Hu, J., Duppatla, V., et al. Site-specific PEGylation of bone morphogenetic protein-2 cysteine analogues. Bioconjug. Chem. 21 (10), 1762-1772 (2010).
- Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).
- Cao, T., Wang, A., et al. Investigation of spacer length effect on immobilized Escherichia coli pili-antibody molecular recognition by AFM. Biotechnol. Bioeng. 98 (6), 1109-1122 (2007).
- Puleo, D., Kissling, R., Sheu, M. A technique to immobilize bioactive proteins, including bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), on titanium alloy. Biomaterials. 23 (9), 2079-2087 (2002).
