Summary
En standardiserad musmodell av subaraknoidalblödning genom intraluminal Circle of Willis perforering beskrivs. Vessel perforering och subarachnoid blödning övervakas av intrakraniell tryckövervakning. Dessutom olika vitala parametrar registreras och kontrolleras för att upprätthålla fysiologiska förhållanden.
Abstract
I den här videon publikation en standardiserad musmodell av subaraknoidalblödning (SAH) presenteras. Blödning induceras genom endovaskulär Circle of Willis perforering (CWP) och beprövade av intrakraniellt tryck (ICP) övervakning. Därmed en homogen fördelning blod i subarachnoid utrymmen som omger den arteriella cirkulationen och cerebellär sprickor uppnås. Djurfysiologi underhålls av intubation, mekanisk ventilation, och kontinuerlig on-line övervakning av olika fysiologiska och kardiovaskulära parametrar: kroppstemperatur, systemisk blodtryck, hjärtfrekvens, och hemoglobinmättnad. Därigenom cerebral perfusionstryck kan tätt övervakas vilket resulterar i en mindre variabel volym av extravaserade blod. Detta möjliggör en bättre standardisering av endovaskulär glöd perforering i möss och gör hela modellen mycket reproducerbar. Därför är det lätt tillgänglig för farmakologiska och patofysiologiska studier i vildtyp och genetiskaly förändrade möss.
Introduction
SAH är slag subtypen med den minst gynnsamma resultatet för patienterna: 40% av patienterna dör inom en månad efter det att blödningen 1 och överlevande har sällan ett kliniskt positivt resultat.
Det stora flertalet av spontana SAHS (80%) orsakas av bristning av intrakraniella aneurysm som oftast är belägna längs den främre och bakre kommunicera artär, den basilaris artär, och mellersta cerebral artär (MCA) 2.
Sådana aneurysmer är svåra att modellera i djur, och därför djurmodeller av SAH är antingen utföras genom injektion av blod i subaraknoidalrummet / cerebrala ventriklar eller genom endovaskulär perforering av en subaraknoidal kärlet.
Autologt blod injektion i cisterna magna är lätt att utföra och reproducerbar som blodvolymen kan styras direkt 3. Tyvärr har vissa aspekter av SAH patofysiologi, t.ex. denkärlskada, inte kan modelleras med denna procedur. En annan teknisk metod för induktion av SAH är öppnandet av en intracisternal ven 4.
Dock verkar det intraluminala CWP vid MCA grenen att vara det förfarande som modellerna patofysiologin hos människor närmast 5. Metoden utvecklades och först beskrivs i råttor genom Bederson och kollegor och på samma gång genom Veelken och kollegor 6,7. Senare intraluminala perforering modellen anpassades till möss 8,9. En tråd är införd i den yttre halsartären (ECA) och förs fram till skallbasen via det interna karotidartären (ICA). Vid förgreningspunkten av MCA filamentet perforerar kärlet och inducerar en blödning i subaraknoidalrummet på skallbasen. Blodet fördelar sedan i det återstående subaraknoidalrummet längs sprickor och blodkärl. Blödning stoppas av proppbildning vid platsen för perforering, men rebleedings, WHich är ofta skadliga för patienter 10, kan förekomma. Således blev det endovaskulära glödmodellen en allmänt använd SAH modellen under de senaste åren. De som oftast nämns nackdelen av glödtråden perforering modellen är att blöda volymen inte kan styras direkt och kan därför variera. Denna variation kan minskas betydligt genom strikt kontroll av djurfysiologi och efter hemorragisk ICP.
Möss har den stora fördelen att ett stort antal av genetiskt modifierade stammar är tillgängliga. Men på grund av sin ringa storlek kirurgiska ingrepp tenderar att vara mer komplex än i större arter, t.ex. råttor eller kaniner. Därför nedskalning av tekniker som utvecklats för råttor till möss ofta inte leder till önskat resultat, t.ex. som möss har en mycket begränsad kroppsvikt och blodvolym icke-invasiv teknik för blodtryck och gasanalys blod samt för hemoglobinmättnad och pulsmätningmåste tillämpas när det är möjligt. Följaktligen är syftet med den aktuella publikationen för att beskriva fila perforering modell för SAH i möss, och för att visa hur denna modell kan utföras på ett standardiserat och mycket reproducerbart sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla kirurgiska ingrepp utsattes för etisk granskning och godkänts av regeringen i Oberbayern (referensnummer: 55.2-1-54-2532.3-13-13 och -2532-136-11). Djur är male C57BL / 6 möss med en kroppsvikt av cirka 25 g.
1. Djurpreparering
- Inducera anestesi genom att placera musen i en kammare. Spola kammare med 5% isofluran tills djuret förlorar medvetandet.
- Injicera förblandade anestetika intraperitonealt: fentanyl (0,05 mg / kg), midazolam (5 mg / kg) och medetomidin (0,5 mg / kg). Kontrollera reflexer före och regelbundet under förfarandet. Återinjicera en tredjedel av den ursprungliga mängden per timme för att upprätthålla anestesi.
- Intubation orotracheally med ett rör gjort av en 20 G venkateter 11. För intubation fixera djuret på en lutande plattform (30 °), dra tungan med böjda pincett, visualisera stämbanden under en operation mikroskop och för in slangen i luftstrupenunder inandning.
- Placera musen i liggande läge och kontrollera den korrekta placeringen av röret med en bit bomull eller en microcapnograph.
- Anslut intubation röret till respiratorn. Ventilera mus med rumsluft kompletterat med 25% syre med en frekvens av 180 till 220 andetag / min och en slagvolym av 200 till 250 | il.
- Anslut intubation röret till microcapnograph. Bibehåll slutexpiratoriskt pCO 2 vid 30 mm Hg genom att justera ventilationsfrekvensen.
- Sätt i en rektal temperatursond och placera djuret på en värmedyna för att bibehålla 37 ° C kroppstemperatur.
- Applicera den ringformiga pulsoximeter sensorn på den högra baktassen.
- Öppna huden ovanför skalle med en sax. Snittet bör vara ca 0,5 cm lång och mellan öra och öga.
- Dissekera vänster temporal muskeln med en skalpell från tinningbenet.
- Limma laser Doppler flödesmätare (LDF) sond påden vänstra tinningbenet. Hålla sonden i ett fixerat läge tills limmet härdar.
- Borra ett hål på ca 1,5 mm i diameter med en tandläkarborr i den vänstra tinningbenet. Kyl av benet med saltlösning för att förhindra värmeskador.
- För in ICP sond in i hjärnskålen. Tryck framåt så dorsalt som möjligt för att förhindra hjärnvävnadsskada och blödning.
- Om sonden är i rätt läge, fixa, och försegla den med cement. Låt cementen torka i 5 min.
- Vänd musen försiktigt till en liggande position.
- För kontinuerlig blodtrycksövervakning, kateterisera den vänstra lårbensartären.
- Anslut den femorala katetern till blodtrycksövervakningsanordningen.
2. SAH Induktion
- Öppna huden med en sax från bröstbenet till hakan (2 cm). Dissekera bindväv rakt på sak och push spottkörtlarna åt sidan.
- Exponera den vänstra gemensamma halspulsådern (CCA) och mobilisera den. Bevaravagusnerven, som löper i samma bindvävshinnan som CCA. Flytta kranial och exponera och mobilisera ICA och revisionsrätten med samma teknik.
- Ligera ECA så långt cranially som möjligt.
- Avtala två ligeringar för glödtråden runt ECA.
- Täppa till CCA och ICA tillfälligt med microclips. Placera microclips med microclip applikator. Se klippen tillämpas korrekt genom att dra tillbaka dem.
- Skär ut ett hål för de lind insättning i ECA med ett kärl sax.
- Sätt i en Prolene 5-0 filament med 12 mm längd i ECA.
- Stäng insättningsstället med en förutbestämd ligation.
- Ta bort microclips med en microclip applikator från CCA och ICA.
- Advance glödtråden med en tång in i ICA tills ICP stiger. En plötslig ökning av ICP indikerar blödning induktion.
- Dra tråden omedelbart och ligate ECA genom att stänga både prearranged ligeringar i följd. Detta förhindrar att blöda ut ur införingsstället.
- Sutur hudsår.
- Övervaka fysiologiska parametrar hos djuret för en annan 20 min.
- Ta ICP och LDF sonder och sutur hudsår.
3. End of Experiment
- BEGJUTA djuret transkardiellt med 20 ml saltlösning (rumstemperatur), följt av 20 ml av 4% PFA i PBS (4 ° C).
- Dissekera hjärnan ur skallen. Skär skallen i mittlinjen och mellan orbital hålrum. Sedan skal benet från hjärnan.
- Beräkna fördelningen blod i subaraknoidalrummet.
4. Överväganden i mål av Survival Surgery (visas i videon)
- Injicera Karprofen (4 mg / kg subkutant) för postoperativ smärtlindring direkt efter anestesi induktion. Under den postoperativa observationsperioden Karprofen (4 mg / kg subkutant) injicerades varje 24 timmar. Istället för invasiv blodtrycksmätning gör användningen av en icke-invasiv systemet blodtrycksövervakning.
- Vid uppsägning av anestesi injicera antagonizing medel subkutant: naloxon (1,2 mg / kg), flumazenil (0,5 mg / kg) och atipamezol (2,5 mg / kg).
- Extubera djuret.
- Efter att ha återupprättat av reflexer sätta djuret i en förvärmd kammare. Håll djuret vid approximativt 32 ° C under 24 timmar.
- Djuren kontrolleras regelbundet för spontan andning och deras allmänna tillstånd under de första timmarna efter operationen. Om hjärnstammen påverkas djur har andningsproblem och bör avlivas.
- Djuren kontrolleras dagligen för deras allmäntillstånd och kroppsvikt samt neurologiska och sensoriska underskott 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dödlighet
När operationen tekniken behärskar proceduren inte framkallar någon intraoperativ dödlighet. Också blödning kan uppnås i praktiskt taget alla djur. Postoperativ dödlighet är 30-40% med de flesta djur dör på dag 1 efter operation (Figur 5).
ICP-värden efter SAH
ICP innan blödningen är cirka 4 mm Hg. Blödning resulterar i en kraftig ökning av ICP upp till 120 mmHg. ICP-värden sedan stabiliseras inom 5 minuter vid ca 30 mm Hg (Figur 1). Vid 24 timmar efter avblodning ICP är fortfarande något förhöjd till 10 mmHg 5.
Blodtryck efter SAH
Blodtrycket stiger direkt efter avblodning induktion (Figur 2). Detta beror på det Cushing reflex, som initieras genom förhöjd ICP.
Cerebral perfusion efter SAH
After blödning induktion en dramatisk minskning av cerebral perfusion kan övervakas. Reperfusion till en individuellt annan nivå sker inom 5 min efter förolämpning (Figur 3).
Blod distribuerar längs hjärn levererar artärer och cerebellära sprickor
Vi perfusion djur 3 timmar efter SAH transcardially med 20 ml koksaltlösning, följt av 20 ml kyld 4% PFA. Hjärnan avlägsnades försiktigt och distribution blod i subaraknoidalrummet iakttogs. Blod distribuerar längs perivaskulär rymden av hjärn levererar artärer mot rygg cortex. I samtliga fall extravaserat blodet täckte MCA fram till andra förgrening. Den sida ipsilateralt om blödning var täckt med mer blod än den kontralaterala hemisfären (Figur 4).
Distributions Blod inte korrelerar med ICP stiger
I fem djur sökte vi om uppkomsten av ICP d nder SAH påverkar distributions blod i subaraknoidalrummet. En hypotes var att djur som visar endast en måttlig ICP stiga under SAH kan uppvisa mindre extravaserats blod, som då inte dela ut till de dorsala delar av hjärnbarken. Vi fann att endast storleken på hematom vid skallbasen tycks korrelera med ICP stiga. Distributions Blod längs hjärnan levererar artärerna skiljde sig inte mellan djur med olika ICP toppvärden.
Figur 1. ICP värde efter SAH. Representant ICP värden på 5 djur efter SAH. Klicka här för att visa en större bild .
pload/50845/50845fig2.jpg "width =" 600px "/>
Figur 2. Blodtryck efter SAH. Representativa blodtrycksvärden på 5 djur efter SAH. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Cerebral perfusion efter SAH. Representativa laser Doppler flödesmätare värden på 5 djur efter SAH. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Distributions Blod längs hjärn levererar artärer. Representant blod distribution av 5 djur efter SAH. Röda linjer visar fördelningen blod längs hjärn levererar artärer. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 5. Överlevnadskurva efter SAH. Överlevnadskurva efter SAH i 49 manliga C57BL / 6 möss. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Behandlingsalternativ efter SAH är knappa och mestadels VERKNINGSLÖS. Patofysiologin av post-hemorragisk hjärnskador måste därför förstås ytterligare för att identifiera nya terapeutiska mål och utveckla nya behandlingsmetoder. Standardiserade och väl reproducerbara djurmodeller i genetiskt modifierade djur, dvs möss, är avgörande för sådana undersökningar. Den CWP modell har blivit en allmänt använd modell för SAH som den liknar patofysiologin hos människa tätt, dock är dess användning i möss hämmas av låg reproducerbarhet och ett högt mänsklig variabilitet. Variationer av modellen orsakas av olika anestesiprotokoll, vilka förändrar fysiologiska betingelser. Mängden blödning varierar mellan djur på grund av att kärlet reaktivitet, blodtryck och koagulerings skillnader 12. Därför är det viktigt att övervaka fysiologiska förhållanden under hela förfarandet och att införa kirurgiska och övervakningsprotokoll som minskar variability av denna modell.
Distributions Blod efter SAH kan skilja mellan arter. I råttmodellen blodet verkar vara jämnt fördelad över båda hjärnhalvorna 6. Som mänskliga hjärnor visar en gyrencephalic arkitektur blodet sannolikt främst fördelas längs hjärnans sulci och inte i första hand längs fartyg. Å andra sidan, hjärnan levererar artärer löper i dessa sulci t.ex. MCA i den laterala sulcus. Således fartygs patologier kan vara liknande i gnagare djurmodeller och den mänskliga hjärnan.
I vårt laboratorium använder vi en kombination av fentanyl, medetomidin och midazolam såsom beskrivits ovan för kirurgisk anestesi. Denna kombination har en relativt liten effekt på blodtrycket och kärl reaktivitet 11. Däremot isofluran, ett vanligt bedövningsmedel i SAH forskning, leder till perifer vasodilatation, gravt nedsatt cerebral auto 13, och lågt blodtryck omedelbart akteruter SAH 12, fynd som inte regelbundet i samband med den tidiga patofysiologi av SAH i människor. Därför är användningen av en narkos protokoll som inte stör post hemorragisk patofysiologi en viktig förutsättning för en giltig experimentell SAH modell.
Mängden blödning beror på båtens lesionen och varierar därför med filamentstorlek 14. Ett annat viktigt steg i modellen är ett tillbakadragande av glödtråden efter fartyget perforering. Blodflödet i ICA störs av glödtråden och en fördröjd uttag kan resultera i mindre blödningar. Därför är det viktigt att standardisera tiden mellan fartyget perforering och filament tillbakadragande. Detta är naturligtvis bara möjligt om tidpunkt för fartygets perforering kan bestämmas med hög tidsmässig precision. I vår inställning detta uppnås genom kontinuerlig mätning av ICP. En kraftig ökning av ICP indikerar lyckad kärl perforering och tillåter därmed standardization av glödtrådstillbakadragande och därmed blödande intensitet. Dessutom förhindrar ICP styrda fartyg perforering att filamentet förs fram för långt för att därigenom förhindra hjärnvävnadsskada. Därför är kontinuerlig ICP mätning en utmärkt teknik för att minimera variationer i murina SAH modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Den aktuella forskningen finansieras av Solorz-Zak Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| operation microscope | Leica | KL2500 | |
| isoflurane vaporizer | Harvard Instruments | Continuous Flow Vaporizer | |
| respirator | Hugo Sachs | Minivent 845 | |
| microcapnograph | Hugo Sachs | Type 340 | |
| temperature controller | FHC | DC Temperature Controller | |
| dental drill | Paggen | Labset- N | |
| ICP monitor | Codman | ICP monitor | |
| blood pressure monitor | AD Instruments | Bridge Amp FE221 | |
| syringe pump | World Precision Instruments | SP101IZ | |
| pulsoximeter | Kent Scientific | MouseSTAT | |
| LDF | Perimed | Periflux 5000 | |
| analog data monitor | AD Instruments | Power Lab 16/35 | |
| Material | |||
| cement for ICP probe fixation | Speiko | Carboxylate cement | |
| glue for LDF probe fixation | Bob Smith Industries | Cyanoacrylate glue (Maxi Cure and Insta Set) | |
| venous catheter | Johnson Johnson | Jelco winged i.v. catheter; REF 4076 | modified intubation tube |
| tubing for femoral catheter | Smiths Medical | Fine Bore Polythene Tubing; ID 0.28 mm OD 0.61 mm; REF 800/100/100 | cut to 30 cm length |
| filament for vessel perforation | Ethicon | Prolene 5-0 | cut to 12 mm length |
| surgical equipment | Fine Scientific Instruments | forceps medical #5, vessel scissors 8 cm, microclip 4 mm jaw | |
References
- Cahill, J., Zhang, J. H. Subarachnoid hemorrhage: is it time for a new direction. Stroke. 40, 86-87 (2009).
- van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J. Subarachnoid haemorrhage. Lancet. 369, 306-318 (2007).
- Lin, C. L., et al. A murine model of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm. J. Neurosci. Methods. 123, 89-97 (2003).
- Altay, T., et al. A novel method for subarachnoid hemorrhage to induce vasospasm in mice. J. Neurosci. Methods. 183, 136-140 (2009).
- Feiler, S., Friedrich, B., Scholler, K., Thal, S. C., Plesnila, N. Standardized induction of subarachnoid hemorrhage in mice by intracranial pressure monitoring. J. Neurosci. Methods. 190, 164-170 (2010).
- Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26, 1086-1091 (1995).
- Veelken, J. A., Laing, R. J., Jakubowski, J. The Sheffield model of subarachnoid hemorrhage in rats. Stroke. 26, 1279-1283 (1995).
- Kamii, H., et al. Amelioration of vasospasm after subarachnoid hemorrhage in transgenic mice overexpressing CuZn-superoxide dismutase. Stroke. 30, 867-871 (1999).
- Parra, A., et al. Mouse model of subarachnoid hemorrhage associated cerebral vasospasm: methodological analysis. Neurol. Res. 24, 510-516 (2002).
- Broderick, J. P., Brott, T. G., Duldner, J. E., Tomsick, T., Leach, A. Initial and recurrent bleeding are the major causes of death following subarachnoid hemorrhage. Stroke. 25, 1342-1347 (1994).
- Thal, S. C., Plesnila, N. Non-invasive intraoperative monitoring of blood pressure and arterial pCO2 during surgical anesthesia in mice. J. Neurosci. Methods. 159, 261-267 (2007).
- Hockel, K., Trabold, R., Scholler, K., Torok, E., Plesnila, N. Impact of anesthesia on pathophysiology and mortality following subarachnoid hemorrhage in rats. Exp. Transl. Stroke Med. 4, 5 (2012).
- Wang, Z., Schuler, B., Vogel, O., Arras, M., Vogel, J. What is the optimal anesthetic protocol for measurements of cerebral autoregulation in spontaneously breathing mice? Exp. Brain Res. 207, 249-258 (2010).
- Schwartz, A. Y., Masago, A., Sehba, F. A., Bederson, J. B. Experimental models of subarachnoid hemorrhage in the rat: a refinement of the endovascular filament model. J. Neurosci. Methods. 96, 161-167 (2000).
- Feiler, S., Plesnila, N., Thal, S. C., Zausinger, S., Scholler, K. Contribution of matrix metalloproteinase-9 to cerebral edema and functional outcome following experimental subarachnoid hemorrhage. Cerebrovasc. Dis. 32, 289-295 (2011).
