Etablierung der minimalen bakteriziden Konzentration eines antimikrobiellen Mittels für planktonische Zellen (MBC-P) und Biofilmzellen (MBC-B)

Zusammenfassung

Dieses Protokoll ermöglicht einen direkten Vergleich zwischen planktonischer und Biofilmresistenz für einen Bakterienstamm, der mit einer 96-Well-Mikrotiterplatte einen Biofilm in vitro bilden kann. Planktonische oder Biofilmbakterien sind seriellen Verdünnungen des antimikrobiellen Mittels der Wahl ausgesetzt. Die Lebensfähigkeit wird durch das Wachstum auf Agarplatten geprüft.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll ermöglicht einen direkten Vergleich zwischen planktonischer und Biofilmresistenz für einen Bakterienstamm, der in vitroeinen Biofilm bilden kann. Bakterien werden in die Brunnen einer 96-Well-Mikrotiterplatte geimpft. Beim planktonischen Assay werden den bakteriellen Suspensionen serielle Verdünnungen des antimikrobiellen Mittels der Wahl zugesetzt. Im Biofilm-Assay, einmal geimpft, werden die Bakterien über einen bestimmten Zeitraum zu einem Biofilm zurückgelassen. Nicht angeschlossene Zellen werden aus den Brunnen entfernt, das Medium aufgefüllt und serielle Verdünnungen des antimikrobiellen Mittels der Wahl hinzugefügt. Nach der Exposition gegenüber dem antimikrobiellen Mittel werden die planktonischen Zellen auf Wachstum untersucht. Für den Biofilm-Assay werden die Medien mit frischen Medien ohne antimikrobielle Mittel aufgefrischt und die Biofilmzellen müssen sich erholen. Die Lebensfähigkeit von Biofilmzellen wird nach der Erholungsphase geprüft. Das MBC-P für das antimikrobielle Mittel ist definiert als die niedrigste Konzentration von Medikament, das die Zellen in der planktonischen Kultur abtötet.  Im Gegensatz dazu wird das MBC-B für einen Stamm bestimmt, indem vorgeformte Biofilme für 24 Stunden erhöhten Konzentrationen antimikrobiellen Mittels aussetzen. Das MBC-B ist definiert als die niedrigste Konzentration an antimikrobiellen Mitteln, die die Zellen im Biofilm abtötet.

Einleitung

Antibiotikaresistenz-Assays wurden ursprünglich entwickelt, um die Resistenz von planktonischen (freischwimmenden) Bakterienkulturen zu assayen. Da es sich bei vielen bakteriellen Infektionen um Biofilme (oberflächengebundene Zellen) handelt, waren wir an der Entwicklung einer Methode zum Assay biofilmspezifischer Antibiotikaresistenz interessiert. Die meisten Antibiotikaresistenztests sind jedoch schlecht geeignet, um die Resistenz von Biofilmen zu messen. Beispielsweise ist die Bestimmung der minimalen hemmenden Konzentration (MIC) der Goldstandard für die Bestimmung der Antibiotikaresistenz von planktonischen Bakterienkulturen ¹. Dieser Test beinhaltet d....

Protokoll

1. MBC-B

1. Anbau eines Biofilms (angepasst an O'Toole⁹).
   1. Wachsen Sie eine Kultur der wilden Art Stamm von Interesse und mutierte Sorte für 16 Stunden in einem reichen Medium bei 37 °C.
   2. Verdünnen Sie die gesättigten Nachtkulturen 1:100 in ein frisches Medium für Antibiotikaresistenztests. Ein Standardmedium für P. aeruginosa ist M63 minimal medium ergänzt mit Magnesiumsulfat und Arginin (siehe Tabelle 1). Dieses Medium stimuliert die Bildung eines robusteren Biofilms.
   3. Fügen Sie 100 l der Verdünnung pro Brunnen in eine 96-Well-Mikrotiterschale ein (siehe

Ergebnisse

MBC-P- und MBC-B-Assays wurden durchgeführt, um die Empfindlichkeit des PA14-Wildtyps mit PA14 ∆ndvBzu vergleichen. Tobramycin wurde als Antibiotikum verwendet. Die Ergebnisse, die Schritt 1.4.4 (Abbildung 1) und Schritt 2.3.4 (Abbildung 2) entsprechen, werden dargestellt. PA14 und ∆ndvB wurden in die MBC-P- und MBC-B-Assays in dreifacher Ausfertigung geimpft. Nach Abschluss der Schritte 1.0-1.4 des MBC-B-Protokolls und der Schritte 2.0-2.3 des MBC-P-Protokolls wurden d.......

Diskussion

Antibiotikaresistenz in planktonischen Zellen ist definiert als eine Erhöhung der minimalen hemmenden Konzentration (MIC) eines Antibiotikums aufgrund einer permanenten Veränderung der Zellen(z. B. eine Mutation). Die bisher identifizierten Mechanismen der biofilmspezifischen Resistenz oder Toleranz sind das Ergebnis der Expression wildartiger Gene in Biofilmen. Daher gilt die klassische Definition von Resistenz nicht für Biofilme. Es wurde jedoch eine weitere Reihe von Definitionen vorgelegt: Resistenzmechanism.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1x  M63			Vorbereiten als 5x  M63-Stamm durch Auflösen von 15 g KH2PO4, 35 g K2HPO4 und 10 g (NH4)2SO4 in 1 l Wasser. Dieser Schaft muss nicht autoklaviert werden und kann bei Raumtemperatur gelagert werden. 5x verdünnen; Lager 1:5, autoklavieren, abkühlen lassen, dann die gewünschten Komponenten hinzufügen.
> KH2PO4	Fisher	P285-500
> K2HPO4	Fischer	P288-500
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Magnesiumsulfat	Fisher	M63-500	Zu 1 mM Endkonzentration hinzufügen.  Als 1 M Vorrat in Wasser zubereiten und autoklavieren.
Tobramycin	Sigma		Vorbereiten 50 mg/m  Lager. Aliquotieren und speichern bei -20°C.
Arginin	Sigma	A5131	Zu 0,4% Endkonzentration hinzufügen.  Als 20% Vorrat in Wasser zubereiten und filtrieren, sterilisieren.  Diese alternative Kohlenstoff-/Energiequelle kann Glukose- und Casaminosäuren ersetzen
96-Well-Mikrotiterplatten	Corning	3595	Steril, flacher Boden, geringe Verdampfung
Tranferpette (Mehrkanalpipette)	BrandTech	2703610	8-Kanal, 20-200 μ l
Mehrpolige Vorrichtung	Dan-Kar	MC48	48 Zinken passen in ½ einer 96-Well-Mikrotiterplatte