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Methodenartikel

Echokardiographische Beurteilung des rechten Herzens bei Mäusen

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DOI:

10.3791/50912

⸱

27. November 2013

 ,  ,  , 
1Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 2Pulmonary and Critical Care Medicine, Vanderbilt University Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel enthält ein Protokoll für die echokardiographische Beurteilung der Rechtsherzgröße und Lungenhochdruck bei Mäusen. Die Anwendungen umfassen Phänotyp Bestimmung und Serienbewertung in transgenen und Toxin-induzierten Maus-Modellen der Kardiomyopathie und Lungengefäßerkrankung.

Zusammenfassung

Transgene und toxische Modelle der pulmonalen arteriellen Hypertonie (PAH) werden häufig verwendet, um die Pathophysiologie der PAH zu untersuchen und mögliche Therapien zu untersuchen. Angesichts der Kosten und Zeit bei der Schaffung von Tiermodellen der Krankheit beteiligt ist, ist es entscheidend, dass Forscher haben Werkzeuge, um die phänotypische Expression Krankheit genau zu beurteilen. Rechts Dysfunktion ist der Haupt Manifestation von Lungenbluthochdruck. Die Echokardiographie ist die Hauptstütze der nicht-invasiven Beurteilung der rechtsventrikulären Funktion in Nagetiermodellen und hat den Vorteil der klaren Übersetzung für Menschen, bei denen das gleiche Werkzeug verwendet wird. Veröffentlicht Echokardiographie Protokolle in Mausmodellen von PAH fehlen.

In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll für die Beurteilung der RV-und Lungengefäßfunktion in einem Mausmodell der PAH mit einer dominanten negativen BMPRII Mutation, jedoch ist dieses Protokoll für alle Erkrankungen des Lungengefäßsystems oder rechten Herzen. Wireine ausführliche Beschreibung der Tierpräparation, Bildaufnahme und Berechnung von hämodynamischen Schlagvolumen, Herzminutenvolumen und einer Schätzung des Lungenarteriendrucks.

Einleitung

Erhöhte Lungendruck und der rechten Herzkammer (RV) Dysfunktion sind die Markenzeichen des Lungengefäßkrankheiten in Tiermodellen und menschlichen Patienten mit pulmonaler arterieller Hypertonie (PAH). Transgene und toxisch (zB Monocrotalin oder Hypoxie) Modelle der PAH sind weit verbreitet, um die Pathophysiologie der PAH zu untersuchen und mögliche Therapien zu untersuchen. Angesichts der Kosten und Zeit bei der Schaffung von Tiermodellen der Krankheit beteiligt ist, ist es entscheidend, dass Forscher haben Werkzeuge, um die phänotypische Expression Krankheit genau zu beurteilen.

Die Echokardiographie ist die Hauptstütze der nicht-invasiven Beurteilung der Herzfunktion in Nagetiermodellen 1,2. Die Echokardiographie hat den Vorteil der klaren Übersetzung für Menschen, bei denen das gleiche Werkzeug verwendet wird. Darüber hinaus zeigen einige genetische Modelle unvollständiger Penetranz 3, die Fähigkeit, nicht-invasiv zu identifizieren betroffenen Tiere spart wertvolle Zeit und Ressourcen. Nicht-invasive Beurteilung der disease Schwere, ohne ein Tier erlaubt auch Forscher seriell die Auswirkungen der Untersuchungs Therapien zu studieren. Dies ist besonders wichtig angesichts der Schnelligkeit, mit der Translationstherapien für den menschlichen Versuchen 4,5 Fortschritt.

Beim Menschen ist echokardiographische Beurteilung der RV Größe und Lungenhochdruck besonders schwierig wegen der retrosternalen Position und unregelmäßige Form des RV 6. Nager-Modelle haben die zusätzlichen Herausforderungen des geringen Größe und extrem schnelle Herzfrequenzen (300-700 Beat / min). Jüngste Fortschritte einschließlich höhere Bildraten und kleinere Messwandler Bildqualität und erlaubt sogar bewusst Bildgebung in einigen experimentellen Protokolle verbessert, obwohl die meisten Nager-Bildgebung wird unter Narkose durchgeführt 7,8. Ausgezeichnete experimentelle Protokolle der Echokardiographie in Rattenmodellen von PAH sind beschrieben und validiert sowohl gegen invasive Hämodynamik MRI und 1,9 worden. Allerdings veröffentlicht EchokardiographieProtokolle in Mausmodellen von PAH fehlen.

In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll für die Beurteilung der RV-und Lungengefäßfunktion in einem Mausmodell der PAH mit einer dominanten negativen BMPRII Mutation und einem Modell der isolierten RV Nachlast nach Lungenarterie Streifenbildung, jedoch ist dieses Protokoll für alle Krankheiten, die die Lungengefäßen oder rechten Herzen. Wir beschreiben, Tier Vorbereitung und detaillierte Bewertung der RV Größe und Funktion sowie die wichtigsten Lungenarterie Größe (PA). Wir zeigen auch die Techniken und Berechnungen erforderlich, um das Schlagvolumen und Herzzeitvolumen zu schätzen. Technische Beschränkungen entgegenstehen Doppler genaue Schätzungen der Lungendruck, aber wir haben uns gut validierten Surrogat menschlichen, Lungenarterie Beschleunigungszeit, PA-Druck schätzen aufgebracht.

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Protokoll

1. Vorbereitung der Ausrüstung

  1. Untersuchen Sie die Ultraschallwandler für Mängel. Abhängig von der verwendeten Ausrüstung, kann dieser Schritt unnötig.
    1. Wenn eine Luftblase beobachtet wird, entfernen Sie die Schraube auf der rechten Seite des Wandlers Kopf und fügen sterilem Wasser durch das Loch mit einem 26-G-Nadel. Luftblasen im Schallkopf sind häufig. Sie werden den Erwerb der Bildqualität beeinträchtigen.
    2. Prüfen Sie die Membran, die die Sonde auf Lecks oder Löcher. Ersetzen Sie, wenn nötig.
  2. Öffnen Sie die Software und initialisieren Sie die Sonde.
    1. Wählen Sie das Herz-Paket aus dem Dropdown-Menü, zusammen mit der entsprechenden Wandler. Klicken Sie auf "initialisieren". Verwenden Sie eine 20 bis 60-MHz-Sonde für Mäuse unter 35 g und einer 15-45 MHz Sonde für Mäuse mehr als 35 g.
    2. Wählen Sie den Operator-, Tier-und Datum auf dem Demografie-Bildschirm, und wählen Sie "Start".

2. Maus PreparatIonen-Inklusive Anästhesie, Haarentfernung, und Positionierung

  1. Anästhesie: Ort mit der Maus in eine Induktionskammer und betäuben mit einem tragbaren, Tischplatte Anästhesiegerät, das eine Isofluran-Verdampfer und eine Abgas-Container.
    1. Gesetzt den Verdampfer zu 3% mit einem Sauerstoffdurchflussrate von 3 L / min. Diese relativ hohe Rate der Anästhesie wird verwendet, um schnelle betäubende Wirkung zu erzielen und damit Stress-Reaktion, die Herzfunktion beeinflussen können, zu minimieren. Die kurze Dauer des Protokolls minimiert mögliche Risiken für das Tier. Es ist sehr wichtig, immer gleich zu halten die Anästhesie Rate. Dieses Protokoll ist für die ausschließliche Verwendung von Isofluran als Anästhetikum optimiert somit optimale Bedingungen für andere Mittel können zu diesem Protokoll variieren. Eine geringere Tiefe der Anästhesie kann so gewählt werden, abhängig von experimentellen Anforderungen, aber sobald ein Anästhetikum Protokoll hergestellt ist, muss er nicht geändert werden. Anästhesie betrifft Herzfrequenz und other hämodynamischen Messungen. Deshalb, wenn die Tiefe der Anästhesie während eines Experiments verändert, können die Daten nicht nützlich für Analysen sein. Wenn mehrere Mäuse an einem Tag abzubildenden betäuben sie separat.
    2. Überwachung der Raumtemperatur um sicherzustellen, dass die gleiche zwischen den experimentellen Gruppen. Die Raumtemperatur kann Vasoreaktivität beeinflussen, auch wenn die Maus auf einem beheizten Tisch, so sollte es überwacht und hielt die gleiche zwischen experimentellen Gruppen, die verglichen werden sollen werden. Obwohl dieses Protokoll nicht Tier Temperatur direkt zu messen, sorgt für eine konstante Umgebungstemperatur und Tisch, dass es wenig Veränderung in der Temperatur zwischen experimentellen Gruppen.
  2. Haarentfernung: Entfernen Sie Haare aus der Brust mit einer Enthaarungscreme, nachdem die Maus narkotisiert. Start-Anwendung mit einem Wattestäbchen an den Schlüsselbeinen, und weiter bis knapp unterhalb des Zwerchfells.
    1. Platzieren Sie die Maus wieder in der Anästhesie Kammer für 1 min, damit die Enthaarungscreme zu arbeiten. Um festzustellen, ob Narkose wirksam ist, drücken Sie fest Daumennagel gegen einen von der Maus die Pfoten. Wenn es keine zurückziehen, ist ausreichende Anästhesie. Wenn das Glied zurückzieht, die Maus wieder in der Anästhesie Kammer für eine weitere Minute.
    2. Tragen Sie eine kleine Menge Schmier Salbe auf die Augen der Maus, um Schäden an der Hornhaut zu vermeiden.
    3. Entfernen Sie Haare aus der Brust mit einem 2 x 2 in Gaze. Der in der Enthaarungscreme benutzt Chemikalie ist ätzend, und wird die Haut schädigen, wenn sie zu lange auf der linken Seite ist, so ist darauf zu achten, alle Produkt von der Haut zu entfernen.
    4. Tragen Sie eine Feuchtigkeitsspender folgenden Haarentfernung.
  3. Positionierung: Legen Sie die Maus in einem ventrodorsal Position auf einem beheizten Tisch bis 37 ° C eingestellt Die richtige Positionierung ist zwingend notwendig, um den Erwerb der Bildqualität. Verwenden Sie eine Tabelle, die Körpertemperatur, Atmung und Herzfrequenz erfassen. Verwendung eines integrierten Schienensystem alleows für die präzise Positionierung und anschließend Bildoptimierung.
    1. Vorsichtig kleben Sie alle vier Pfoten und wenden einen Cent große Menge Gel Übertragung auf der Brust.

3. Erwerb der Bilder: Imaging in Parasternale langen Achse

  1. Sperren Sie die Ultraschallwandler in Platz innerhalb der Halterung auf dem Schienensystem, und drehen Sie es 10 ° gegen den Uhrzeigersinn, so dass die Metallsonde der Wandler wird direkt über dem Herzen positioniert. Genauer gesagt, sollte die Sonde auf der linken Seite der Brust, im 2. oder 3. Interkostalraum, und seitlich des Brustbeins.
    1. Manipulation der x-und y-Achsen auf dem Schienensystem liegt, bis die korrekte Sicht erhalten wird.
    2. Wählen Sie "B-Modus". Dies ist in dem oberen rechten Abschnitt der Systemkonsole gefunden, um eine 2D-Livebild zu projizieren.
    3. Sehen Sie sich die folgenden anatomischen Strukturen auf dem Monitor:
      1. Das gesamte Herz von der Spitze zu aorta - Die Spitze wird auf der weit links auf dem Bildschirm, und der Aorta auf der rechten Seite dargestellt werden.
      2. Das Lumen des linken Ventrikels (LV)
      3. Posterioren Wand des linken Ventrikels (LPW)
      4. Scheidewand (IVS)
      5. Das Lumen des rechten Ventrikels (RV)
      6. Vordere und hintere Mitralsegel (AML und PML)
      7. Aufsteigenden Aorta (AO)
      8. Linken Vorhof (LA)
  2. Erhalten einer diametralen Messung der Aorta in dieser Ansicht durch Drücken der Scan-/ Gefriertaste "einfrieren", das Bild. Dann verwenden Sie die Maus, um zurück durch die Video-Loop am unteren Rand des Bildes zu ziehen, bis die linke Herzkammer ist in der Systole und der Aorta am größten Durchmesser.
    1. Klicken Sie auf das Messwerkzeug in der oberen linken Ecke des Bildschirms und wählen Sie das Symbol, das wie eine diagonale Linie aussieht. Linke Maustaste klicken und eine gerade Linie von der vorderen bis zur hinteren Wand der Aorta, perpendicular zu seiner Längsachse. Sparen Sie durch Drücken der "Frame Store"-Taste.
    2. Erstellen Sie ein Video-Loop durch Drücken von "Cine Store"

. 4 Erwerb der Bilder: Imaging in Parasternale kurze Achse anzeigen

  1. Positionieren Sie den Wandler auf die 3 und 9 Uhr-Position (quer). Winkel leicht kaudal durch die Manipulation der Schwingerhalterung, um den besten Blick auf die Aorta und LV-Lumen erreichen. Die Metall-Sonde wird horizontal und direkt über dem Brustbein positioniert werden.
    1. Manipulation der x-und y-Achsen auf dem Schienensystem, bis die korrekte Sicht erhalten wird. Die LV Lumen gesehen werden, zusammen mit den anterolateralen oder posteromedial Papillarmuskeln, die auf der rechten Seite des Bildschirms angezeigt werden. Dies ist der Standard-Referenzpunkt für die kurze Achse, welche die Mittelabschnitt des linken VentrikelsGegebenen Dimension Messungen durchgeführt werden. Abweichend etwas von dem Referenzpunkt mit der x-und y-Achsen auf verschiedenen anatomischen Strukturen im Hinblick bringen wird notwendig sein, aber die Positionierung unter Bezugnahme auf das oben Ansicht erläutert.
  2. Besorgen Sie sich die folgenden Messungen in der kurzen Achse:
    1. B-Modus
      1. Zwei weitere diametrale Messungen der Aorta.
      2. Drei Messungen des pulmonalen Ausflusstrakt.
    2. Pulsed-Wave-Doppler-Modus (PW)
      1. Drei Geschwindigkeitsmessungen Zeitintegral (VTI) der Aorta
      2. VTI drei Messungen der Lungenarterie gemessen unmittelbar proximal zu der Pulmonalklappe.
      3. Lungenarterie zu messen Beschleunigungszeit durch Verfolgen des VTI-Kurve vom Beginn des Blutflusses zu Spitzengeschwindigkeit.
    3. M-Modus
      1. Drei Messungen des linksventrikulären Innendurchmesser in diastole (LVIDd)
      2. Drei Messungen des linksventrikulären Innendurchmesser in der Systole (LVIDs)
      3. Drei Messungen des rechten Ventrikels Innendurchmesser (RVID). Die RV-Lumen sind nur sichtbar, in dieser Ansicht, wenn sie gedehnt wird.
      4. Messung der Herzfrequenz dreimal mit m-Modus durch Verfolgen der Abstand zwischen zwei Spitzen der diastolischen vorderen Wand des LV in drei verschiedenen Herzzyklen.
  3. B-Modus-Messungen:
    1. Bearbeiten Sie die Y-Achse kranial von der Papillarmuskel Ansicht, bis die halbmondförmige Ventil der Aorta in den Fokus kommt.
    2. Erhalten Messungen der Aorta oberhalb des Ventils an dem größten Durchmesser.
    3. Klicken Sie auf das Messwerkzeug in der oberen linken Ecke des Bildschirms und wählen Sie das Symbol, das wie eine diagonale Linie aussieht.
    4. Linke Maustaste klicken und eine gerade Linie von der vorderen bis zur hinteren Wand der Aorta.
    5. Manipulieren ter x-und y-Achse, bis die Hauptlungenarterie verzweigt. Diese Struktur wird nach vorne zu sehen ist, und auf der rechten Seite der Aorta auf dem Monitor.
    6. Manipulation der y-Achse, bis die kranial Ringraum des Hauptlungenarterie in Sicht kommt. Es ist nicht so klar wie die Aorta definiert werden.
    7. "Freeze" das Bild und erhalten Sie die Messung in der Systole.
    8. Sammeln Sie drei Messungen insgesamt.
  4. Pulsed-Wave (PW) Doppler-Messungen: PW-Modus ist vor allem für die hämodynamische Beurteilung der Blutfluss durch die Arterien und Venen eingesetzt. In diesem Protokoll wird verwendet, um drei Geschwindigkeitszeitintegralmessungen der Aorta und Lungenarterie abzurufen.
    1. Bringen Sie die Aorta wieder in den Blick, wie in Schritt 4.3.1 und Punkt 1 beschrieben.
      1. Wählen Sie "PW-Modus". Dies ist auf der oberen rechten Ecke der Systemkonsole angeordnet und wird eine Doppler-Messung des Blutflusses durch die Aorta zu erzeugen.
      2. Legen Sie das sample Volumen gerade über dem Niveau der Aortenklappe. Die x-und y-Achse müssen leicht angepasst, um eine ausreichende Doppler Umschläge erhalten. Die Umschläge sollten weiße Ränder, und einen hohlen Inneren anzeigt laminaren Blutfluss haben.
      3. Sobald eine ausreichende Sicht erhalten wird, "einfrieren" das Bild und Spuren die Grenze des Doppler-Umschlag. Dies wird die VTI berechnen.
      4. Drehen Sie die "Angle"-Knopf befindet sich auf der Systemkonsole im Uhrzeigersinn, bis der segmentierten gelbe Linie im Bild auf der oberen rechten Seite des Monitors zu sehen ist, auf 0 °. Diese gelbe Linie stellt die Richtung der Blutströmung durch das Gefäß. Da der Wandler selbst ist derart, um einen Querschnitt bzw. Queransicht des Herzens herzustellen abgewinkelt, muss die Leitung auf 0 ° eingestellt werden, um mit der vertikalen Strömung von Blut durch die aufsteigende Aorta anzupassen.
    2. Platzieren des Probenvolumens proximal zu der Ebene der Pulmonalklappe in die Mitte desrechten Ausflusstrakt und wiederholen VTI Messungen wie oben. Der Blutfluss invertiert angezeigt, oder die Blutströmung in Bezug auf die Aorta auf dem Monitor Gegenteil.
  5. M-Modus-Messungen: M-Modus-Bildgebung bietet hohe zeitliche Auflösung der Gewebebewegung entlang einer einzigen Ultraschallstrahl und wird verwendet, um den Hohlraum Dimensionen quantifizieren sowie den Klappenfehler, Herzmuskel und Gefäßwandbewegung zu studieren.
    1. Fortsetzen "B-Modus" und positionieren den Signalwandler, die "Referenzansicht" (der Querschnitt des linken Ventrikels auf Höhe der Papillarmuskeln) zu erhalten.
    2. Drücken Sie die "M-Modus". Dadurch wird eine kontinuierliche Video-Feed, in dem die Bewegung der folgenden anatomischen Strukturen werden als "Band" sichtbar zu produzieren. Wenn geweitet werden die RV-Lumen an der Spitze der Förder als eine sehr dünne schwarze Band erscheinen. Die Scheidewand (IVS) wird als opake Farbband direkt unter der RV sichtbar seinLumen. Die LV Lumen wird direkt unterhalb der IVS zu sehen. Es ist der große schwarze Raum, der die Mehrheit der Futtermittel einnimmt. Unterhalb der LV-Lumen ist der LV Hinterwand (LVPW), die als eine undurchsichtige Band zu sehen sein wird.
    3. Frieren Sie das Bild und wieder zurück ziehen durch die Video-Loop, wenn bis zu einem Punkt, wo die Atmung nicht auftritt benötigt. Wenn die Maus atmet, die Bildaufnahme durch die Bewegung der Membran und der Brustwand unterbrochen, wodurch ein verzerrtes "verschmiert" Artefakt in der Beschickung, die mit regelmäßigen Frequenz auftritt.
    4. Besorgen Sie sich die folgenden Messungen mit der Diagonale-Symbol:
      1. Drei Messungen der LV enddiastolischen Dimension, die als der größte Abstand zwischen der IFD und LVPW erscheint.
      2. Drei Messungen des systolischen LV Ende Dimension, die als der kürzeste Abstand zwischen der IFD und LVPW erscheint.
      3. Drei Messungen der Herzfrequenz, die durch Klicken auf das Herzsymbol und Messung von systolischen Spitzen zu tun istsystolischen Spitze der LVPW.
      4. Wenn die RV Lumen erweitert, erhalten drei Messungen mit der Diagonale-Symbol.
    5. Nehmen Sie ein Video-Loop der parasternalen kurzen Achse Blick in "B-Modus" durch Drücken der Taste "Cine-Store".
    6. Gehen Sie auf "Datei", wählen Sie "Browse-Studie", um Ihre Messungen rekapitulieren, klicken Sie auf "End Session", und dann "Commit Session-Daten."
    7. Recover die Maus wie von der IACUC Protokoll dargelegt, und aufräumen.
    8. Exportieren von Daten als CSV-Datei auf einen USB-Stick für die spätere Analyse.
  6. Berechnen der folgenden Parameter der Herzfunktion (Tabelle 1):
    1. Die linksventrikuläre Ausflusstrakt Bereich
    2. Linken Ventrikels Schlagvolumen
    3. Linken Herzkammer Herzleistung
    4. Verkürzungsfraktion
    5. Lungenarterie Bereich
    6. Lungenarterie Beschleunigungszeit
    7. Rechten Ventrikel Schlagvolumen
    8. Cardiac Index

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Ergebnisse

Die wichtigsten Ziele dieses Protokolls sind RV Größe und Funktion zu quantifizieren und den Grad, zu dem die Lungengefäße erkrankt zu verstehen. Entsprechende Vorbereitung sowohl die Maus und Echokardiographie Ausrüstung ist wichtig, um genaue und reproduzierbare Ergebnisse. Mäuse sollten ihre Brust enthaart haben und Gliedmaßen auf den Imaging-Plattform mit Klebeband gesichert. Anästhesie, in diesem Fall Isofluran über Nasenkonus verabreicht. Der Wandler sollte für Mängel, insbesondere Luftblasen, die Bildqualität ver...

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Diskussion

Mausmodelle der Erkrankung, entweder transgenen oder Toxin bezogenen benötigen phänotypische Validierung, dass das Modell tatsächlich rekapituliert die menschliche Krankheit es ist beabsichtigt, zu emulieren. Diese Überprüfung kann oft durch die Anwesenheit oder Abwesenheit eines bestimmten Merkmals erreicht werden, beispielsweise die Entwicklung eines Tumors. Jedoch Modelle, die in hämodynamischen Anomalien wie Aortakonstriktion Modelle der linksventrikulären Hypertrophie oder unsere transgenen Modell PAK sind schwieri...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Vevo 770 Hochauflösendes Mikro-Ultraschall-SystemVisualsonics Inc.Weitere Informationen finden Sie unter www.visualsonics.com/products
RMV (Real-Time MicroVisualization) 704B 40 mH Scanhead mit gekapseltem SchallkopfVisualsonics Inc.Weitere Informationen finden Sie unter www.visualsonics.com/products
Vevo Integrated Rail System einschließlich des physioogischen ÜberwachungssystemsVisualsonics Inc.Weitere Informationen finden Sie unter www.visualsonics.com/products
Computermonitor, der für die Verwendung mit der Vevo770DELL eingerichtet ist, oder einer anderen General Supplier
Computermaus, die für die Verwendung mit der Vevo770General Supplier
Vevo770 Cardiac Package SoftwareVisualsonics Inc.Weitere Informationen finden Sie unter www.visualsonics.com/products
VetEquip Tragbares Tischanästhesiegerät mit einem Isofluran-VerdampferVetEquipWeitere Informationen finden Sie unter vetequip.com
Aktivkohle-AbgasbehälterVetEquip/Vaporguard931401erhalten Sie weitere Informationen unter vetequip.com
Puralube AugensalbeHenry ScheinWeitere Informationen finden Sie unter henryschein.com
Ecogel 100 Ultraschall GelEcoMed Pharmaceuticals30GBWeitere Informationen unter ecomed.com
3M Transpore TapeFisher Scientific1527-0Weitere Informationen unter fishersci.com
Kleiner SchlitzschraubendreherAllgemeiner Lieferant
Steril H2ODDI H2O aus dem Wasserhahn und dann Autoklav
6 in Baumwolle Applikatoren mit TippFisher ScientificWeitere Informationen finden Sie unter fishersci.com
Nair (Enthaarungscreme)General Supplier
2 in x 2 in MullschwämmeFisher ScientificWeitere Informationen finden Sie unter fishersci.com
eingerichtet ist.

Referenzen

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