Demostramos la utilidad del comportamiento de construcción de nidos en ratones de laboratorio como indicador de bienestar. El marcado de nidos es una técnica sensible que se ve alterada por la temperatura, la enfermedad y la agresión. El tiempo de integración en la prueba del nido (TINT) es una evaluación simple en la jaula que puede detectar el dolor postoperatorio.
Artículo de método
Edificio de la jerarquía como indicador de Salud y Bienestar en ratones de laboratorio
En este artículo
Resumen
Resumen
La minimización y el alivio del sufrimiento tiene implicaciones morales y científicas. Con el fin de mitigar esta experiencia negativa, uno debe ser capaz de identificar cuándo un animal está realmente en peligro. El dolor, la enfermedad o la angustia no se pueden manejar si no se reconocen. La evaluación del dolor o la enfermedad suele implicar la medición de indicadores fisiológicos y conductuales que son invasivos o no son adecuados para la evaluación a gran escala. La observación del comportamiento de anidación se muestra prometedora como base de una herramienta de evaluación apropiada para la especie en la jaula para reconocer la angustia en ratones. Aquí demostramos la utilidad del comportamiento de construcción de nidos en ratones de laboratorio como un indicador etológicamente relevante del bienestar. Los métodos presentados se pueden utilizar con éxito para identificar factores de estrés térmico, jaulas agresivas, enfermedades y dolor. La observación del comportamiento de construcción de nidos en colonias de ratones proporciona un refinamiento a la evaluación de la salud y el bienestar en el día a día.
Introducción
La medición del bienestar animal es una evaluación difícil y a menudo subjetiva. Cuando se utilizan animales con fines científicos, existe la obligación de proporcionar el mejor cuidado posible y minimizar las molestias1. Se necesitan métodos objetivos específicos de cada especie para medir el bienestar general con fines científicos y ganaderos. Los métodos actuales de evaluación del bienestar en ratones de laboratorio consumen mucho tiempo, requieren equipos costosos o deben analizarse posteriormente para determinar si se ha producido una alteración2-3. Estas técnicas son útiles en un entorno científico, pero difíciles de incorporar en la cría diaria. Un método simple orientado a ratones que pueda identificar rápida y fácilmente a los ratones con dolor o angustia sería un paso hacia la identificación inmediata y el alivio de esos factores estresantes.
Los nidos son utilizados por los ratones salvajes para protegerse de los depredadores, retirarse de las duras condiciones ambientales y proteger a las crías4. Por lo tanto, los comportamientos asociados con la construcción de nidos están altamente relacionados con la supervivencia de los ratones salvajes5. Los ratones de laboratorio, a pesar de haber sido retirados de las condiciones silvestres durante muchas generaciones, están muy motivados para construir un nido cuando se les proporcionan los materiales adecuados. Cualquier cambio en estos comportamientos altamente motivados, o en el nido en sí, debe indicar una alteración sustancial en el medio ambiente o en los propios animales.
El objetivo de este método es explotar los comportamientos de anidación altamente motivados en el ratón de laboratorio para identificar rápidamente el dolor, la enfermedad u otros factores estresantes que pueden afectar o reducir el bienestar general del animal. Esta técnica de evaluación binaria del lado de la jaula es ventajosa sobre otros métodos existentes porque se necesita poco entrenamiento, los materiales de prueba se encuentran en la colonia de ratones promedio y la prueba se puede completar con poca o ninguna manipulación de los animales. Además, el suministro frecuente de material de anidación fresco o diferente puede proporcionar una interacción positiva entre los ratones y los cuidadores, ya que se ha descubierto que el material de anidación es gratificante para los ratones.
Protocolo
Ambos protocolos siguientes son más precisos cuando los animales están alojados en jaulas de fondo sólido con material de cama.
1. Puntuación de nido6
- Pesa entre 8 y 10 g de material de anidación.
- Se recomienda el material de anidación de papel arrugado (como Enviro-Dri) como sustrato para el marcado de nidos, ya que la mayoría de los ratones construyen mejores nidos con este sustrato6, pero se pueden usar otros materiales9.
- Identifique la(s) jaula(s) que se va a puntuar.
- Los animales deben ser alojados en jaulas de fondo sólido para un rendimiento óptimo en esta prueba.
- Coloque el material de anidación de papel en la jaula.
- El material de anidación se puede proporcionar en cualquier momento conveniente para el investigador o el personal de cuidado de animales
- Regrese al día siguiente a las 7-9 horas después de que se enciendan las luces para puntuar.
Nota: Este es el mejor momento para puntuar los nidos, ya que los ratones deben estar inactivos10, los nidos deben tener la puntuación más alta11 y las habitaciones de los animales son tranquilas. Si los animales están activos, pueden pisotear el nido, alterando la puntuación. La variación en la construcción del nido ocurrirá dependiendo de la cantidad de tiempo que se les dé a los ratones para construir, por lo que es importante anotar el mismo día y hora después de que se proporcione el nuevo material. - Utilice el protocolo de puntuación de nidos de Hess et al.6 para anotar cada nido (Figura 1).
- Primero determine si el material ha sido manipulado por los ratones. Esto incluye ser procesado o movido alrededor de la jaula.
- Si el material está intacto, todo el nido recibe una puntuación de 0;
- A continuación, determine si la mayor parte del material de anidación se ha recogido en un sitio de anidación central.
- Sin sitio de anidación: Si no está claro dónde se encuentra el sitio de anidación, la jaula recibe una puntuación de 1 (es decir, el material está esparcido por toda la jaula);
- Sitio de anidación: Si hay un sitio de anidación centralizado, considere el nido como si fuera un cuadrado. A cada uno de los 4 lados del cuadrado se le puede dar una puntuación separada de 2 a 5. A continuación, se promedian las 4 puntuaciones para la puntuación del nido de jaula.
- 2 = el nido es plano sin paredes poco profundas;
- 3 = una forma ligeramente ahuecada en la que la pared del nido es inferior a la mitad de la altura de una cúpula que cubriría a un ratón;
- 4 = una pared que tiene 1/2 de la altura de una cúpula;
- 5 = paredes que son más altas que 1/2 de la altura de una cúpula, que pueden o no encerrar completamente el nido.
- Primero determine si el material ha sido manipulado por los ratones. Esto incluye ser procesado o movido alrededor de la jaula.
Nota: Alternativamente, la puntuación puede ocurrir 3-4 días después de la provisión de nuevo material, cuando a menudo se alcanzan las puntuaciones máximas (datos no publicados).
2. Hora de integrarse en Nest Test12
Nota: Esta prueba será más precisa si el animal tiene un material de anidación de papel de fibra larga y ha construido un nido con una puntuación de al menos 2 (ver arriba).
- Tome un cuadrado de 2 pulgadas de material de anidación de algodón (como un Nestlet) y córtelo en cuartos, lo que da como resultado 4-1 en cuadrados de prueba.
- Pruebe con animales dentro de las primeras 3 horas después de que se enciendan las luces del vivero.
- Esta ventana de prueba aprovecha el aumento de los comportamientos de construcción de nidos antes de la inactividad diurna11.
- Abra la tapa de la jaula y coloque 1 cuadrado de prueba en el lado opuesto de la jaula desde el sitio principal del nido.
- Coloque el cuadrado de prueba donde se pueda ver desde fuera de la jaula.
- El material de prueba debe colocarse en el mismo lugar cada vez que se realice la prueba.
- Regrese a la jaula después de 10 minutos.
Nota: Si falta la escuadra de prueba de su ubicación original, la jaula es TINT positiva. Si la escuadra de prueba permanece en la ubicación original, la jaula es negativa para TINT y es posible que se necesiten observaciones adicionales para determinar si los ratones requieren atención veterinaria.
Resultados
Temperatura:
Los nidos construidos por grupos de 3 ratones C57BL/6 se puntuaron en jaulas mantenidas a tres temperaturas ambientales diferentes (20, 25 o 30 °C; Figura 213) tras 24 horas. A medida que aumenta la temperatura, la puntuación del nido disminuye. Las paredes del nido se vuelven más bajas y los nidos se hacen más abiertos, lo que permite una mayor pérdida de calor.
Agregresión:
Grupos de ratones macho con un alto nivel de interacciones agresivas que resultan en heridas pueden identificarse por la forma del nido. En un experimento de 5 semanas, se encontró que el puntaje del nido correlacionaba negativamente con el número promedio de ratones macho C57BL/6 heridos en una jaula (F1,26 = 13.5; P=0.0011; Figura 3). La subcepa específica de ratones C57BL/6 no explicó significativamente los datos de heridas (F2,26 = 2.69; P = 0.086). Las jaulas con nidos de mayor puntuación tuvieron menos ratones heridos que aquellas con nidos de menor puntuación, independientemente de la subcepa.
Enfermedad:
Se ha encontrado que los ratones que experimentan un malestar general realizan poca o ninguna construcción de nidos cuando se les obliga a construir uno14.
Dolor:
Se ha observado que la conformación del nido se altera tras una intervención quirúrgica dolorosa11,15. El número de animales con un aumento negativo del TINT aumenta aproximadamente un 60 % después de una cirugía dolorosa12, pero los ratones regresaron a niveles basales positivos de TINT tres días después de la operación (Figura 4).
Figura 1. Diagrama de puntuación de nidos. Un nido, con cavidad interna, que muestra diferentes alturas de paredes para la puntuación6. La figura se reproduce con autorización del Journal of the American Association of Laboratory Animal Science. Haga clic aquí para ver la imagen ampliada.
Figura 2. Efecto de la temperatura sobre la puntuación del nido. Puntuación media del nido de ratones confinados a una temperatura ambiente de 20, 25 o 30 °C13. La línea diagonal indica un contraste lineal significativo. La figura se reproduce con permiso de Elsevier. Haga clic aquí para ver la imagen en tamaño mayor.
Figura 3. El efecto de la agresión sobre los puntajes del nido. Este gráfico muestra la correlación entre el puntaje promedio del nido de una jaula con 5 ratones macho y el número de esos machos que presentaron heridas. Esto se evaluó en 3 substrains diferentes de ratones C57BL6. Haga clic aquí para ver la imagen en tamaño mayor.
Figura 4. El efecto del dolor sobre el TINT. Se representan la media y el error estándar (SE) de un TINT negativo antes y después de dos cirugías12. La figura se reproduce con autorización del Journal of the American Association of Laboratory Animal Science. Haga clic aquí para ver la imagen en tamaño mayor.
Discusión
Con base en estos resultados, la construcción del nido se altera según el grado de estrés térmico, la cantidad de agresión presente dentro de la jaula, cuando los animales experimentan un malestar general y el comportamiento de recolección no se observa en ratones posquirúrgicos y potencialmente dolorosos. Dado que todos y cada uno de estos factores reducirán el bienestar de un ratón, creemos que la construcción de nidos se puede utilizar para identificar jaulas o animales donde se deben realizar intervenciones para mejorar su bienestar general. Creemos que la puntuación de nidos puede ser un método mejor utilizado con fines científicos porque la escala es más refinada y puede detectar diferencias más pequeñas que el binario TINT. Sin embargo, creemos que el TINT es una herramienta más práctica que se aplica mejor durante la cría diaria o la identificación postquirúrgica de animales dolorosos.
A diferencia de las especies depredadoras sociales, donde las muestras de enfermedades o lesiones pueden ser beneficiosas, mostrar señales de debilidad en las especies de presa puede ser la diferencia entre la supervivencia o la muerte. Se ha observado que los conejos, por ejemplo, responden al dolor o la angustia permaneciendo inmóviles, especialmente en presencia de un humano, lo que hace que los indicadores conductuales de angustia parezcan inútiles16. Los comportamientos de dolor continuos en ratones también son difíciles de identificar y usar para cuantificar el dolor17. Esto es especialmente difícil en especies de laboratorio nocturnas donde, a simple vista, los ratones angustiados e inactivos pueden confundirse fácilmente con los dormidos.
Los recursos, como los alimentos o los materiales que permiten la construcción de nidos, están fuertemente ligados a la supervivencia y la aptitud de los ratones salvajes5,18,19. En los estudios, el material de anidación es un recurso que los ratones de laboratorio están fuertemente motivados para obtener7,8. Se ha demostrado que Enviro-Dri es un enriquecimiento etológicamente relevante para ratones que les permite aliviar el estrés térmico mediante la construcción de nidos más aislantes7,10,13. La larga longitud de la fibra, que requiere poco o ningún procesamiento, permite que incluso los constructores de nidos pobres construyan mejores nidos6,7. Este material también es adecuado para ratones desnudos20, que a menudo son susceptibles a lesiones oculares. Si bien Enviro-Dri es superior para la construcción de nidos, otros materiales (es decir, Nestlets) funcionan mejor para el TINT. La presencia o ausencia del cuadrado de prueba del área designada es menos subjetiva que intentar determinar si se eliminó una parte de las tiras Enviro-Dri.
Tanto la puntuación del nido como el TINT se pueden utilizar fácilmente en animales alojados individualmente, sin embargo, pueden surgir problemas si 1 animal del grupo puede estar experimentando dolor o angustia. Los datos presentados en este manuscrito ilustran que el estrés térmico y la agresión de la jaula se pueden identificar en ratones alojados en grupos. Actualmente se están investigando más trabajos que analizan la cohesión social y las interacciones entre animales sanos y no saludables. Por lo tanto, advertimos utilizar estos métodos en animales alojados en grupo para detectar enfermedades o dolor en un subconjunto del grupo.
La variación en la construcción y recolección de material entre tipos de ratones de laboratorio está bien documentada7,21-23 y debe considerarse antes de usar esta técnica para todos los tipos de ratones. Específicamente, los ratones C3H no recolectan ni construyen nidos tan complejos como otras cepas endogámicas21,22. Por lo tanto, se deben observar la conformación normal del nido y los resultados de TINT en ratones no manipulados antes de utilizar esta técnica en cualquier cepa o stock. Es posible que diferentes tipos de jaulas puedan influir en el resultado de la construcción. Por ejemplo, el aumento de la pérdida de calor por convección experimentada en jaulas ventiladas individualmente puede aumentar las puntuaciones generales del nido debido al estrés térmico adicional.
La utilidad del examen del comportamiento de anidación solo ha comenzado a explorarse. La literatura indica que los nidos cambian debido al estado hormonal de la madre24,25 y, por lo tanto, también podría ser una herramienta para identificar a las hembras periparturientas sin molestarlas. Aunque aún no se ha probado directamente, los investigadores que estudian modelos de enfermedades humanas también podrían usar la evaluación del comportamiento de anidación como un punto final humano o para identificar el inicio de la enfermedad, aliviando en última instancia el sufrimiento general. La alteración en esta secuencia de comportamiento esencial y compleja también podría ser una tarea más válida, orientada al ratón, para modelos de trastornos de salud mental o incluso pruebas de drogas.
Divulgaciones
Brianna N. Gaskill y Kathleen R. Pritchett-Corning son empleadas de Charles River Laboratories que crían la cepa de ratón utilizada en este artículo.
Agradecimientos
La investigación presentada aquí fue apoyada por la Escuela de Medicina Veterinaria Charles River y Tufts Cummings. Los autores están muy agradecidos a Megan Rock y Miranda Gallo por su trabajo con las pruebas de tinte.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Enviro-Dri | Shepherd Papeles especiales | Material de anidación de papel arrugado | |
| Nestlet | Ancare | Material de anidación de algodón comprimido |
Referencias
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