Simulation von Bauchspeicheldrüsenneuroplastizität: Published: April 14, 2014 doi: 10.3791/51049

DOI

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Ihsan Ekin Demir¹, Elke Tieftrunk¹, Karl-Herbert Schäfer², Helmut Friess¹, Güralp O. Ceyhan¹

¹Department of Surgery, Klinikum rechts der Isar, Technische Universität München, ²Department of Biotechnology, University of Applied Sciences Kaiserslautern/Zweibrücken

Summary

Neuronale Plastizität ist eine zunehmend erkannt, aber unzureichend verstanden Funktion des Magen-Darm (GI-Trakt). Hier im Beispiel der menschlichen Bauchspeicheldrüse, stellen wir einen in vitro-Assay Neuroplastizität für die Untersuchung der neuronalen Plastizität im GI-Trakt sowohl morphologischen und funktionellen Niveau.

Abstract

Neuroplastizität ist ein inhärentes Merkmal des enterischen Nervensystem und Magen-Darm-(GI) Innervation unter pathologischen Bedingungen. Allerdings bleibt die pathophysiologische Rolle der Neuroplastizität in GI-Erkrankungen bekannt. Neuartige experimentelle Modelle, die Simulation und Modulation der Neuroplastizität GI erlauben kann verbesserte Wertschätzung des Beitrags der Neuroplastizität insbesondere GI Krankheiten wie Bauchspeicheldrüsenkrebs (PCA) und chronischer Pankreatitis (CP) zu ermöglichen. Hier stellen wir ein Protokoll für die Simulation von Bauchspeicheldrüsen neuroplasticity unter in vitro Bedingungen mit neugeborenen Rattenhinterwurzelganglien (DRG) und Plexus myentericus (MP) Neuronen. Diese Dual-Neuron-Ansatz ermöglicht nicht nur die Überwachung der beiden Orgel intrinsische und extrinsische-Neuroplastizität, sondern auch ein wertvolles Werkzeug, um neuronale und gliale Morphologie und Elektrophysiologie zu beurteilen. Darüber hinaus ermöglicht es funktions Modulation der mitgelieferten Mikroumgebungs Inhalte für das Studium ihrer impact auf Neuroplastizität. Einmal eingerichtet, ist die vorliegende Neuroplastizität Assay trägt das Potenzial, für das Studium der Neuroplastizität in jedem GI Orgel.

Introduction

Veränderungen im Magen-Darm-(GI) Nerven Morphologie und Dichte haben die Aufmerksamkeit der Gastroenterologen und Pathologen für eine lange Zeit gefangen, aber ihre Bedeutung für die Pathophysiologie der GI-Erkrankungen ist unbekannt ^03.01. Tatsächlich sind mehrere hoch gemeinsamen GI-Erkrankungen wie Gastritis, Reflux-Ösophagitis, Kolitis, Divertikulitis, Appendizitis und mit erhöhter Innervationsdichte in entzündeten Gewebebereiche ¹ zugeordnet. Es wurde jedoch keine echte Aufmerksamkeit bisher auf die Mechanismen und Bedeutung der Neuroplastizität im GI-Trakt bezahlt. Sie morphologisch veränderten GI Nerven unterscheiden sich von normalen GI Nerven, also der Normalzustand des enterischen Nervensystems, in ihrer Funktion? Was sind die Auswirkungen von veränderten Neuropeptid / Neurotransmitter Gehalt in magensaftresistenten Kunststoff Nerven? Hat peripheren Neuroplastizität immer bringen veränderte Signalisierung an das zentrale Nervensystem? Und wo sind die zentralen Projektionen der Kunststoff ExtriNSIC GI Nervenbahnen? Eine lange Reihe von Schlüsselfragen wie leicht, wenn man den Mangel an unserer Kenntnisse über die funktionalen Aspekte der Neuroplastizität GI erzeugt werden.

Die Studie von GI Neuroplastizität bei Funktionsebene erfordert gültige, reproduzierbare und noch leicht anwendbar experimentellen Modellen. In einer Zeit zunehmender Beliebtheit und Akzeptanz von gentechnisch bedingte Mausmodellen (GECoMM), wie in vivo-Einstellungen tragen das Potenzial, bisher unbekannte Facetten der GI Neuroplastizität in einer realistischen Art und Weise ^ein aufzuklären. Jedoch bleibt die Konstruktion und Produktion von GECoMM teuer, arbeitsintensiv und vor allem zeitaufwendig ist. Darüber hinaus erfordern sie die a-priori-Auswahl des Ziel bedingt in der genetisch veränderten Maus (z. B. transgene Überexpression von Nervenwachstumsfaktor / NGF in enterischen Epithelzellen) moduliert werden. Daher ist für die DESign einer erfolgreichen GECoMM, brauchen die Forscher einige Indikatoren (z. B. früheren experimentellen Daten) einer lohnendes Ziel, das heißt, dass das Molekül von Interesse (hier NGF) zumindest erwartet, dass einige biologisch relevante Auswirkungen auf die GI Nerven auszuüben.

Solche Indikatoren können leicht von in-vitro-Modellen, in denen ausreichende isolierten Zelltypen aus der komplexen Mikroumgebung eines In-vivo-System kann wahlweise in einem hetero Weise ^4-7 kokultiviert werden, abgeleitet werden. Die Modulation des molekularen Targets in einer solchen heteroKulturEinstellung beträgt durchschnittlich technisch weniger aufwändig, schneller, und kann daher in der Vorfilterung lohnenswertes Ziel unterstützen zur Überprüfung in in vivo-Studien.

Kürzlich haben wir eine in-vitro-Assay Neuroplastizität, die entworfen wurde, um die erhöhte neuronale Dichte und Hypertrophie der intrapankreatischen ne simulierenRVE im menschlichen Pankreas-Krebs (PCa) und chronischer Pankreatitis (CP) Gewebe. Hier wurden Neuronen aus neugeborenen Ratten dorsalen Wurzelganglien (DRG) und Plexus myentericus (MP) abgeleitet wird, um Gewebeextrakten von chirurgisch entfernten PCa oder CP Geweben Proben belichtet und im Vergleich zu denen in normalen menschlichen Bauchspeicheldrüse (NP) Gewebeextrakte ⁵ kultiviert. Anstelle von Gewebeextrakten, kann man auch Zelllinie Stände, die Auswirkungen der ausgewählten Zelltypen auf Neuroplastizität zu studieren. Wenn eine standardisierte morphometrische Messungen kombiniert werden, kann der Test gültig präsentiert Neuroplastizität und reproduzierbaren Beurteilung von neuronaler Plastizität in Reaktion auf verschiedene pankreatischen Mikroumgebungen. Insbesondere ermöglicht es die Simulation 1) morphologische Neuroplastizität, dh die Änderungen in der Neuritenwachstum, Verzweigungsmuster und neuronalen Größe und 2) funktionelle Neuroplastizität, dh Veränderungen in der Erregbarkeit von peripheren Neuronen. Darüber hinaus sind nicht nur Peripheriegerät ( (zB DRG oder zweiter Ordnung Rücken) Neuronen können in der vorliegenden Assay auf ihre morphologischen und funktionellen Reaktion auf verschiedene Gewebe GI Inhalt bewerten einbezogen werden. In dem vorliegenden Video-Tutorial zeigen wir, das technische Protokoll für die Durchführung dieses Tests und diskutieren seine Vorteile und Schwächen. Darüber hinaus weisen wir auf die Anwendbarkeit der Grundgedanke dieses Assays zum Studium der Neuroplastizität in jedem GI Orgel.

Protocol

Alle Tierversuchsverfahren im Protokoll befolgen Sie die Tierpflege-Richtlinien der Technischen Universität München, Deutschland.

1. Medien / Auszug Vorbereitung

1. Gewebehomogenisierung
   Die Qualität der Homogenisierung Gewebe ist für den nachfolgenden Nachweis von neuroplastischen Veränderungen in kultivierten Neuronen. Hier wird empfohlen, die ein Homogenisator Gewebedissoziation ermöglicht ohne große Erhöhung der Gewebetemperatur.
   1. Über 5 mm x 5 mm x 5 mm große Würfel von Pankreasgewebe direkt von -80 ° C bis flüssigem Stickstoff und in einer festen Phase im Gewebe homogenator. Die ideale homogenator würde das Gewebe schnell genug distanzieren, ohne dass es um aufzutauen.
   2. Unmittelbar nach der Dissoziation, resuspendieren festen, pulverförmigen Homogenat in 300-500 ul 0,1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Hier verwenden Sie keine Lyse-Puffer (wie RIPA), da dies die Nervenzellen zu lysieren.
   3. Zentrifugieren der Homogenate für mindestens 15 min bei maximaler Geschwindigkeit der Tischzentrifuge (z. B. 21.130 xg). Sammeln Sie die klare Überstand, der die Gewebeextrakt darstellt.
2. Zelllinie Stände
   1. Lassen Sie die Zellen von Interesse zu erreichen mindestens zu 70 - 80% Konfluenz in normalem Wachstumsmedium.
   2. Normalerweise werden diese Medien enthalten Serumkomponenten und können unkontrollierbare Auswirkungen auf die neuronale Wachstum ausüben. Deshalb wird nach Erreichen der gewünschten Zelldichte, waschen Sie Ihre Zellen mindestens 3x mit Zellkultur-Grade-PBS und legen Sie sie in Serum-freien Medium (SFM) für bis zu 48 Stunden.
      Hinweis: Hier berücksichtigen, dass bestimmte Zellen (wie Pankreassternzellen) Serum müssen in ihrem Wachstumsmedium, um ihre normalen Zustand und die Struktur aufrecht zu erhalten. In solchen Fällen führen serielle Verdünnungen Serum im Medium der Zelle von Interesse, um die bestmöglichen Serumgehalt für intakte Zelle notwendig funk findenn.
   3. Messung der Proteinkonzentration der Gewebehomogenat oder Zellüberständen mittels Bradford-Proteintest. Obwohl diese Werte abhängig von der Gewebe-und Zelltyp variieren, Pankreasgewebeextrakte, würde man einen Konzentrationsbereich von 5-12 ug / ul zu erwarten, und für die Zelllinie Stände zwischen 3-8 ug / ul.

2. Aliquot Extrakte und Zellüberständen

Abhängig von der Konzentration in dem Assay verwendet werden, sollte die Endkonzentration des Extrakts oder der Überstand in der neuronalen Medium 100 ug / ml ^5,8 sein.

Anmerkung: Für einen Test mit Neuronen in 500 ul Medium wachsen in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen benötigt man 50 &mgr; g Protein von jedem Extrakt oder Überstand pro Vertiefung. Bei einer typischen Extrakt-Konzentration von etwa 10 ug / ul, ein 5 ul Extrakt / Stand müssten für jeden gut. In jedem setting als dreifach durchgeführt, würde dies zu 15 ul Extrakt / Stand entsprechen. Für verschiedene Gewebe oder Zelltypen, führen serielle Verdünnungen der endgültigen Extrakt oder Überstand Konzentration und vergleichen Sie die beobachteten Effekte zwischen verschiedenen neurotrophen Extrakt / Stand Konzentrationen.

3. Isolierung von Neuronen

Wenn der Extrakt / Stand Sammlung abgeschlossen ist, weiter mit Isolierung von Nervenzellen.

1. Für DRG-Neuronen, sammeln die Hals zu neugeborener Ratten zwischen postnatalen Tag (P) 12.2 nach Enthauptung und stereomikroskopische Präparation der DRG (Abbildung 1A) lumbalen DRG. Um eine ausreichende DRG-Neuronen für eine 24-Well-Platte haben, sammeln sie alle Gebärmutterhalskrebs zu einer neugeborenen Ratte (entspricht 52 DRG) pro Platte lumbalen DRG.
   1. Schneiden Sie den peripheren (neuronalen) und Zentralprojektionen (Wurzeln) der DRG mittels Mikroschere.
      Lässt man die Projektionen in Verreiben Ort behindert und erhöht ter Kontaminationsrisiko der Kultur von Fibroblasten.
2. Für MP Neuronen, schneiden Sie das Gekröse aus dem Dünndarm und von Hand vorsichtig abstreifen seromuskuläre Schicht des Dünndarms (für eine detaillierte Protokoll über MP Isolation, siehe Schäfer et al. ^9, Abbildung 1B). Für MP, sammeln die Plexus aus zwei Ratten pro 24-Well-Platte.
   Hinweis: Versuchen Sie, so sanft wie möglich zu sein, um Risse in der seromuskuläre Schicht zu vermeiden, da sie die erfolgreiche Trennung von der Dünndarm behindern.
3. Sammeln Sie die DRG und seromuskuläre Schicht in eiskaltem Minimalmedium (MEM) mit Gentamicin (20 mg in 500 ml Medium) und Metronidazol (2,5 mg in 500 ml Medium) geliefert.
4. Nach Sammlung von DRG, inkubieren in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) mit Collagenase Typ II für 20-30 min zugeführt. Für MP Isolation, Inkubation in Collagenase Typ zwischen 1-3 Stunden, je nach Alterdes Tieres (Abbildung 1C).
5. Für MP, sammeln die netzartige MP Stücke unter Stereomikroskop und Transfer zum eiskalten MEM.
6. Dann verreiben Sie die DRG und MP durch Spritzen mit abnehmendem Durchmesser.
   Hinweis: Überhöhte Verreiben können die Neuronen weniger die Gliazellen zu zerstören, aber.
7. Sobald das Medium, das die DRG oder MP hat sich bewölkt, Zentrifuge die Suspension bei 93,9 g für 5 min, entsorgen Sie die mittel-und resuspendieren in Neurobasal Medium (mit 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 0,5 mM L-Glutamin und 2% B-27).
8. Zählen der Gesamtzahl der Zellen (dh Neuronen und Gliazellen) mittels einem Hämozytometer.
   Anmerkung: Die Anzahl der benötigten Zellen ist abhängig von der Messgröße. Für die Quantifizierung von Neuriten Dichte, dichter Kulturen und somit eine größere Anzahl von Zellen als für die Messung von Neuritenwachstum, perikaryonal Größe benötigt manund Verzweigungsmuster einzelner Neuronen. Für Neuriten Dichtemessungen, verwenden Sie zB 10.000 Zellen (Neuron + Glia) / gut oder 1500 Neuronen / gut. Für Morphometrie von einzelnen Neuronen, kurz (1 Minute lang) Trypsinierung der Zellen und der Aussaat von 2500 Zellen / Well oder 400 Neuronen / Vertiefung wird empfohlen. Die typische Ausbeute an Zellen aus einer Ratte erhalten etwa 300.000-500.000 Zellen.
9. Samen der Zellen auf 13 mm Deckgläschen, die wurden in der Nacht überzogen haben, bevor die Brunnen und oben mit Neurobasal Medium (mit 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 0,5 mM L-Glutamin und 2% B-27) (Abbildung 1D).
   Hinweis: Verwenden Poly-D-Lysin (40 mg / m ²⁾ oder Ornithin-und Laminin-beschichtete (1 mg / ml) beschichteten Deckgläschen. Zellen zu befestigen, um Poly-D-Lysin extrem schnell, so dass es für Experimente, in denen viele Zellen benötigt werden (dh Neuriten Dichtemessungen) geeignet. Anbau an Laminin ist in der Regel einigewas schwächer, aber Laminin ist ein starker Förderer der Neuritenwachstum. Daher ist für Messungen an Nervenverzweigungen und Neuritenlänge bevorzugen Ornithin / Laminin-Beschichtung.
10. Damit die Zellen heften sich an die Brunnen über Nacht. Am nächsten Tag, bereiten die Extrakt-ergänzten Medium (zu einer endgültigen Extrakt / Überstand Konzentration von 100 ug / ml).
11. Saugen Sie den Aussaatmedium und führen Sie eine optionale, sehr sanft mit PBS gewaschen, und dann langsam pipettieren den Extrakt / Stand-Medien ergänzt (1E).
12. Lassen Sie die Zellen wachsen für 48 Stunden. Saugen Sie die Medien und fix in 4% Paraformaldehyd für Immunfärbung (1F).
13. Führen Doppelimmunfluoreszenzfärbung mit Neuronen-spezifischen (z. B. beta-Tubulin-III) und Glia-spezifisch (zB Gliazellen fibriallary sauren Protein / GFAP) Marker (1G).
14. Für Morphometrie, verwenden Sie einen invertierten Lichtmikroskop mit einer CCD-Kamera in Kombination wi ausgestattetth automatisierte Software, die die Messung von Neuriten Dichte ermöglicht (siehe Tabelle).
15. Die Neuriten Dichte von neuronalen Kulturen auf 4-5 Vertreter mikroskopische Aufnahmen bei 200-facher Vergrößerung aus 4 verschiedenen Regionen der dichtesten Wachstum auf jedem Deckglas durch Überlagerung ein 50 um x 50 um Netz und Zählen der Faserdichte pro Quadratmeter in den Schnittfasern gemessen. Neuritenwachstum, mittlere Anzahl der Filialen pro Neuron kann die mittlere Zweig Länge und perikaryonal der Größe von 30 zufällig ausgewählten Einzelneuronen von jedem Deckglas durch Markieren der Neuriten und Perikarya (1H) gemessen werden.

Representative Results

Morphologische Neuroplastizität

In der angegebenen Altersbereich von neugeborenen Ratten (P2-12) und den Einsaatdichten, MP und DRG-Neuronen bereits dichte neuronale Netze bauen nach 48 h (Abbildung 2A). Vergleich von Neuriten Dichte zwischen Neuronen in PCa, CP kultiviert und NP Extrakte zeigt größere Dichte von Neuriten-DRG-Neuronen in PCa-oder CP-Extrakte als NP-Extrakte (2A) ^5. Wir bevorzugen insbesondere MP Neuronen für Messungen an einzelnen Neuronen, da MP Neuronen sind in der Regel leichter von umgebenden Gliazellen als DRG-Neuronen zu distanzieren. Hier MP Neuronen in PCa oder CP-Extrakte auch länger gewachsen Neuriten bauen und weisen eine komplexe Verzweigungsmuster als MP Neuronen wachsen in NP-Auszug mit einem Medium (2B) ^5. Das Fehlen dieser Unterschied in der neuronalen Morphologie von NP, CP und PCa extrahiert induzierte zeigt ein technisches Problem in der einssay. In den meisten Fällen kann dies auf 1 sein) schlechte Qualität des hergestellten Extrakts durch lange Verarbeitungszeit oder 2) aufgrund der Schädigung von Neuronen, die während des Isolationsverfahrens aufgetreten.

Funktionelle Untersuchungen

Die Neuroplastizität Assay trägt hoch genug Sensibilität für Veränderungen durch das Vorhandensein oder Fehlen bestimmter Zielmoleküle von Interesse in den Überständen ergänzt Extrakte oder induziert wird. Zum Beispiel die Blockade des neurotrophen Faktors Artemin oder Nervenwachstumsfaktor aus PCa Zelle (PCC) Überstände durch Zugabe von spezifischen blockierende Antikörper gegen NGF oder Dynabead-induzierte Verarmung an Artemin Ergebnisse der Dämpfung der neuronalen Netzwerkbildung (2C) ^10. In einer aktuellen Studie haben wir einen sehr ähnlichen Effekt für den Beitrag der neurotrophic factor Neurturin auf Neuroplastizität bei CP im gleichzeitigen Vergleich mit anderen neurotrophen Faktoren wie NGF, Glia-Zelllinie originären zeigen konnte,ed neurotrophen Faktor (GDNF) oder transformierenden Wachstumsfaktor-beta (TGF-beta) ^11.

Glia

Der gleiche Ansatz kann auch angewendet werden, um die Reaktion von DRG-ordneten Satelliten Gliazellen oder ente Glia den pankreatischen Mikroumgebungs Inhalte zu beurteilen. Tatsächlich ist einer der stärksten Effekte von PCa Gewebeextrakte auf DRG-oder MP-assoziierten Glia prominente Erhöhung des Wachstums von Gliazellen (Fig. 3) ^5. Außerdem ist dieser Effekt in PCa ausgeprägter als in CP. Hier sollte man berücksichtigen, dass die Proliferation von Gliazellen nicht nach absoluten Glia zählt auf den relativen Anteil der Gliazellen, Neuronen (Glia-Neuron-Index) gerichtet werden, sondern ^5. Dies ist besonders wichtig zu beachten, da die Anzahl von Gliazellen in diesen Kulturen ist schwieriger, aufgrund der Wirksamkeit von Glia-Proliferation zu steuern, im Gegensatz zu Neuronen.

1. Schema Protokoll der in vitro-Assay Neuroplastizität. Die vorliegende Assay nutzt neugeborenen Ratte dorsalen Wurzelganglien (DRG) und Plexus myentericus (MP)-Neuronen, die Auswirkungen von Pankreasgewebeextrakten oder Zellüberständen auf neuronale und gliale Morphologie studieren. DRG werden nach vorderer Laminektomie und MP seromuskuläre haltige Schicht nach der Resektion und mechanisches Abstreifen des Dünndarms gesammelt (A, B). Nach Collagenase Typ II Verdauung werden die Neuronen in der benötigten Dichte ausgesät (siehe Text für Details) ad 24 h (C, D) kultiviert. Dann werden die frisch hergestellten Pankreas (oder von jeder GI Organ von Interesse) Extrakte und Zellüberständen in dem Wachstumsmedium von Neuronen im zuvor definierten Konzentrationen (E) zugegeben.Nach 48 Stunden werden die Kulturen in 4% Paraformaldehyd fixiert und gegen neuronale und gliale Marker (F, G) zweiimmungefärbt. Die neuronale Morphologie, einschließlich Neuriten Dichte, neuronale Verzweigung Muster und Größe perikaryonal werden mittels eines standardisierten Software-Protokoll (H) gemessen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Bauchspeicheldrüsenneuroplastizität durch menschliche Pankreas-Krebs (PCa) und chronischer Pankreatitis (CP) induziert. Menschliche Pankreasgewebe Extrakte chirurgisch aus normalen Bauchspeicheldrüse (NP), CP oder PCa Geweben stammen induzieren prominente Unterschiede in der Dichte der Neuriten DRG ne Urone (A) und in der neuronalen Verzweigungsmuster MP Neuronen (B). Hier PCa und CP Gewebeextrakten üben eine prominente neurotrophe Wirkung auf DRG-und MP-Neuronen. Ähnlich wie Gewebeextrakten, auch den Überständen der einzelnen Zelltypen (hier Bauchspeicheldrüsenkrebs Zellen / PCC) auch bemerkenswert erhöhen die Dichte der Neuriten DRG-Neuronen (C). Dieser Anstieg ist jedoch reversibel, wenn ausgewählt neurotrophen Faktoren wie Artemin (ARTN) oder Nervenwachstumsfaktor (NGF) erschöpft sind oder mit diesen Überständen blockiert. Alle Neuronen gegen beta-III-Tubulin-Immunfärbung. Alle Bilder bei 100-facher Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 3. Gliazellen Reaktion auf Pankreasmikroumgebungs Inhalte. Bauchspeicheldrüsengewebe Extrakte aus PCa oder CP Geweben nicht nur eine neurotrophe Wirkung, aber auch die Förderung von Wachstum und Gliazellen Glia-Zellzahl in DRG-oder MP-Kulturen. Glia-Zellen gegen die Glia Marker saure Gliafaserprotein (GFAP) immungefärbt. Alle Bilder bei 200-facher Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Das vorliegende Protokoll soll die Methodik hinter der in-vitro-Assay Bauchspeicheldrüsenneuroplastizität, die kürzlich von unserer Arbeitsgruppe entwickelt wurde, um die Mechanismen der Neuroplastizität bei PCa und CP ⁵ studieren zu veranschaulichen. Das Protokoll beinhaltet einen dreitägigen Prozedur, die leicht angewendet werden können, sobald die Darsteller hat ausreichende Erfahrung bei der Isolierung und Kultur von DRG-und MP-Neuronen gewonnen werden. Darüber hinaus stellt es ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung der gleichzeitigen Reaktion der Darm-und DRG-assoziierten Glia Pankreasmikroumgebungskomponenten.

Unserer Meinung nach ist eine der interessantesten Features von diesem Test die Fähigkeit, in einem in vitro vereinfachte Einstellung erkennen und simulieren die Veränderungen, die während des PCa und CP (dh neuronale Keimen und Hypertrophie) auftreten. In der Tat, die Anwendung von Gewebeextrakten oder Zellüberständen zu Veränderungen in der neuronalen Morphologie werden kann mit ausreichender Empfindlichkeit durch systematische morphometrische Analyse nachgewiesen werden. Kürzlich konnten wir auch zeigen, dass dieser Test auch die Unterschiede in der neurotrophen Potential von mehreren Krebs Einheiten in gleichzeitigen Vergleich erkennen empfindlich: Wenn die neurotrophe Eigenschaften PCa Zellinien wurde die Zelllinien von Darmkrebs verglichen PCa induzierten Zelllinien signifikant mehr Neuriten Dichten unter DRG-Neuronen als Darmkrebs-Linien ^8. Selbst im Vergleich rektale gegen Dickdarm-Krebszelllinien waren Darmkrebszelllinien im Hinblick auf ihre potentielle neuro ⁸ legen rektale Krebszellen.

Einer der wichtigsten Vorteile dieses Tests ist die einfache Zugänglichkeit für nicht nur morphologisch, sondern auch elektrophysiologische Analysen. Im Gegensatz zu in-situ-Neuronen im Schnittpräparate, Aufnahmen von Neuronen in unserem Test in definierten Medien oder in der einbsence / Über Vorhandensein von definierten Faktoren sind technisch nicht anspruchsvoll und kann wertvolle Informationen über die Rolle der ausgewählte Moleküle in diesen Mikroumgebungen auf neuronaler Aktivität liefern.

Sicherlich sollte der Assay nicht dargestellt angesehen werden, ausschließlich auf die Untersuchung von Fragen an Pankreas neuroplasticity Zusammenhang beschränkt. Neuroplastizität ist ein hervorstechendes Merkmal des gesamten GI-Trakt unter pathologischen Bedingungen, wie entzündliche Neuropathien ente ^1-3. Alle diese Bedingungen wurden gemeldet, um mit Veränderungen in der Morphologie und Innervation veränderten neuronalen Aktivität ^1-3 zugeordnet werden. Daher ist es denkbar, Pankreas-Gewebeextrakten oder Zelllinien, von denen aus den entsprechenden Geweben stammen ersetzen und studieren ihre spezifische Wirkung auf Neuronen und Glia Begleit. Unsere jüngsten Analysen auf den Vergleich von Pankreas-und Darmkrebs Gewebe unterstützt diese Vorstellung ^8. Es ist jedoch auch unter Annahme plausibele, die Komponenten der verschiedenen Gewebemikroumgebungen nicht zu induzieren, wie empfindlich und Vertreter Veränderungen, wie wir routinemäßig in Pankreasgewebe Komponenten zu beobachten. Daher empfehlen wir die vorherige umfassende Beurteilung der neuronalen Morphologie durch "positive" Kontrollgeweben (dh Gewebe z. B. mit histologisch nachgewiesenen neuronalen Hypertrophie) versus "negativ" Kontrollgeweben (dh ohne histologische Nachweis für neuronale Hypertrophie) induziert.

Unsere früheren Untersuchungen über die Reaktion von Gliazellen in diesem Test wurden für die Bestimmung von Glia-Zellzahlen in den verschiedenen pankreatischen Mikroumgebungen beschränkt. Glia-Zellen besitzen zunehmende Bedeutung in der Neurobiologie seit der Anerkennung ihrer neurogene Potential und erhöhtes Interesse an Calciumströme entlang Glia-Membran ^12. Daher sind auch Gliazellen in diesem Test leicht zugänglich weiteren funktionellen Analysendurch neue Ansätze. Allerdings müssen solche zusätzliche innovative Ansätze vorherige umfangreiche Validierung vor ihrer Anwendung für weitere Studien.

Wie jede andere Versuchsansatz, auch die Neuroplastizität präsentiert Assay trägt eine begrenzte Vergleichbarkeit der aus verschiedenen menschlichen Patienten nach der Operation erhalten Gewebeproben. Es ist zwingend notwendig für diese Gewebe aus demselben Gewebe Regionen (zB Pankreaskopf, von der Haupttumormasse) für zuverlässige Analysen ¹ abgeleitet werden. Außerdem, selbst wenn diese Voraussetzung erfüllt ist, ferner Unterschiede in Gewebe-oder Tumorbiologie nicht ausgeschlossen sichts der großen Variation in der biologischen Antwort-Muster von verschiedenen Individuen ¹ ist. Um diese einzelnen Gewebeunterschiede zu umgehen, empfehlen wir die Durchführung des Tests mit Gewebe aus so viele Patienten wie möglich, dh mit mindestens 5 erhalten - 10 verschiedene Patienten pro Einheit.

Als Schlüssel technischen Aspekt, möchten wir die Aufmerksamkeit auf die Rolle der Beschichtungsstoffe auf neuronale Wachstum ziehen. Wie ebenfalls oben erwähnt, bevorzugen wir Poly-D-Lysin für Messungen an Neuriten Dichte und Ornithin / Laminin-Beschichtung für die auf einzelne neuronale Verzweigung / Auswuchs Muster. In unseren Händen, während die Messung der Neuronenauswuchs können auch auf Poly-D-Lysin-bedeckten Oberflächen durchgeführt werden, finden wir, dass dieser Ansatz neigt dazu, die Empfindlichkeit des Assays für die tatsächlichen Unterschiede zu verringern. Daher sollte Forschern Anwendung dieses Assays die Verwendung der optimalen Beschichtungsmaterial für die Frage von Interesse sicherzustellen.

Zusammenfassend glauben wir, dass die vorgestellte Neuroplastizität Assay stellt ein wertvolles Werkzeug, um schnell und reproduzierbar Informationen über neuro-Morphologie und neuro-Funktion in verschiedenen Gewebemikroumgebungen zu erhalten, wie in dem Beispiel der BeweisPankreasgewebe. Die empfindlichen Nachweis von Unterschieden in der neuro-Morphologie von verschiedenen Pankreasgewebe induzierte Inhalte unterstreicht die in-vitro-Reproduzierbarkeit von Bauchspeicheldrüsenneuroplastizität in der menschlichen PCa und CP. Weitere Anstrengungen sind bei optimierten preassay Prüfungen angewendet Stände zielen und extrahiert, um die besten definierten Medien für das Studium der GI-Krankheit assoziierte Neuroplastizität zu erreichen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P1149
Ornithine/laminin	Sigma-Aldrich	P2533/L4544
13 mm Coverslips	Merck		For use in 24-well plates
Dismembranator S	Sartorius
Anti-Beta-III-tubulin antibody	Millipore	MAB1637	1:200 concentration
Anti-GFAP-antibody	DAKO	M0761	1:400 concentration
RIPA buffer + protease inhibitor			Any supplier
Neurobasal medium	Gibco/Life Sciences	21103-049
B-27 Supplement	Gibco/Life Sciences	17504044	Quality of B-27 is known to depend on the lot number
Gentamicin/Metronidazol			Any supplier
Minimal essential medium	Gibco/Life Sciences	31095-029
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco/Life Sciences	24020133	Improves collagenase activity when containing Ca/Mg
Collagenase type II	Worthington Biochemical	CLS-2	Obtain lots with at least 200 U/mg activity
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibco/Life Sciences	25200056
4% Paraformaldehyde			Any supplier
analySIS docu software	Olympus