Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Differential Mærkning af Celle-overflade og internaliseres Proteiner efter Antibody Fodring Live dyrkede neuroner

doi: 10.3791/51139 Published: February 12, 2014
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver en fremgangsmåde til at mærke proteiner på overfladen af ​​levende neuroner under anvendelse af et specifikt polyklonalt antistof mod ekstracellulære epitoper. Protein bundet af antistof på celleoverfladen og derefter internaliseres via endocytose kan skelnes fra protein forbliver på eller handles til overfladen under inkubationen.

Abstract

For at påvise celleoverfladen lokalisering af en formodet transmembran-receptor i dyrkede neuroner, vi mærkede protein på overfladen af ​​levende neuroner med en specifik primær antistof rejst mod en ekstracellulær del af proteinet. Eftersom receptorer bliver solgt til og fra overfladen, hvis cellerne permeabiliseret efter fiksering derefter både celle-overflade og indre protein vil blive detekteret af den samme mærket sekundært antistof. Her har vi tilpasset en metode, der anvendes til at studere protein-handel ("antistof fodring"), differentielt etiket-protein, der var blevet internaliseret ved endocytose i antistoffet inkubationstrin og protein, der enten forblev på celleoverfladen eller var handles til overfladen i løbet af denne periode . Evnen til at skelne mellem disse to puljer af protein blev muliggjort gennem inkorporering af en overnatning blokering skridt med højt koncentrerede umærket sekundært antistof efter en indledende incubation af unpermeabilized neuroner med en fluorescens-mærket sekundært antistof. Efter blokering trin permeabilisering af neuroner tilladt påvisning af internaliseret pool med en fluorescerende sekundært antistof mærket med en anden fluorofor. Ved at bruge denne teknik, som vi var i stand til at indhente vigtige oplysninger om den subcellulære placering af denne formodede receptor, der afslører, at det var faktisk handles til celleoverfladen i neuroner. Denne teknik er bredt anvendelig til en række celletyper og celleoverfladeproteiner, der giver en egnet antistof mod en extracellulær epitop er tilgængelig.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ved at etablere funktionen på nyligt identificerede proteiner, kan undersøgelse af subcellulære lokalisering og handel af proteinet pågældende give vigtige fingerpeg om sandsynlige rolle / s af proteinet 1,2. Bioinformatisk analyse af transkriptomet i udviklingslandene neocortex 3 forsynet os med en liste over gener udviser ændret udtryk i løbet af mus hjerne corticogenesis. Vi vedtog derefter et gen knockout tilgang til at konstatere, at proteinet kodet af et af disse gener, sez6, har en central rolle i neuron udvikling. Vi observerede, at beslaglæggelsen-relateret gen 6 eller Sez6, protein ligger i udviklingslandene dendritter og er også til stede i dendritiske Torner, specialiserede strukturer på dendritter, der modtager og integrerer excitatory signaler. Desuden, når dette protein mangler, dendritter og excitatoriske synapser undlader at danne korrekt 4. Den sandsynlige dominerende isoform af proteinet har funktioner i en transmembrane receptoren selv, når den subcellulære fordeling af immunmærket protein blev undersøgt ved konfokal mikroskopi eller ved immunoelektronmikroskopi de fleste, hvis ikke alle, af signalet banke forbundet med små blærer i somatodendritisk rum med lidt eller slet ingen, protein mærkes på plasmamembranen på celleoverfladen.

For endeligt at vise, at denne formodede receptor med et forventet stort ekstracellulært domæne handles til plasmamembranen vi vedtaget en levende-celle-fremgangsmåde under anvendelse af antiserum vi havde genereret til en ekstracellulær del af proteinet til at mærke proteiner på celleoverfladen. Ved at kombinere dette "antistof fodring" tilgang med to anvendelser af differentielt mærket sekundært antistof adskilt af en omfattende blokering skridt og et permeabilization skridt, var vi i stand til at identificere to forskellige puljer af protein kendetegnet ved binding til fluorescens-mærkede sekundære antistoffer bærer forskellige fluorescerENT tags. Således var vi i stand til at skelne protein, der var blevet internaliseret ved endocytose i antistoffet inkubationstrin fra protein, der enten forblev på celleoverfladen eller var handles til overfladen i løbet af denne periode. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, har vi konstateret, at proteinet af interesse handles til og fra celleoverfladen i neuroner. Derfor er dette relativt hurtig og enkel teknik vist sig mere informativ end traditionelle immuncytokemi metoder eller præ-indlejring immunguld elektronmikroskopi, trods det faktum, at vi brugt den samme kanin polyklonalt antiserum for alle disse teknikker. Denne teknik er alment gældende for enhver transmembrane protein gav en god antistof, som genkender ekstracellulære domæne epitoper er til rådighed. Teknikken har tidligere været anvendt til at studere receptor handel glutamatreceptoren GluR1 underenhed 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1.. Dissocieret Hippocampus neuronkultur

  1. Forbered dækglas (borosilikatglas):
    1. Vask i 100% ethanol.
    2. Lufttørre under UV-bestråling.
    3. Coat med poly-D-lysin (0,5 mg / ml i 0,15 M borat-buffer, natten over ved 4 ° C).
    4. Den næste dag (den dag kultur) Vask 3x i PBS smøre med laminin (2,5 ug / ml naturlig muselaminin) + 5% v / v varmeinaktiveret føtalt kalveserum (FCS) fortyndet i PBS i 2 timer ved 37 ° C.
  2. Dissekere embryonale dag 18 (E18) rotte hippocampus og indsamle i PBS indeholdende calcium og magnesium, afkølet på is. BEMÆRK: alle forsøgsprotokoller, der involverer dyr blev godkendt af Animal Ethics Committee fra University of Melbourne.
  3. Forbered papain og DNase I-opløsninger fra Papain Dissociation Kit ifølge producentens anvisninger.
    1. Tilsæt 50 ul DNase I løsning til 1 ml papain løsning.
    2. BEMÆRK: Nårførst er fremstillet, kan papain-opløsning, og DNase I-opløsninger separat dispenseret i portioner (0,5 ml og 25 portioner gl for papain og DNase I, henholdsvis) og opbevaret ved -20 ° C indtil brug.
  4. Fjern så meget som muligt PBS og inkuberes hippocampi (fra et kuld af embryoner) med 1 ml papain / DNase I-opløsning ved 37 ° C i 15-20 min. Knips forsigtigt på røret for at blande indholdet to gange i løbet af inkubationstiden.
  5. Tritureres hippocampus væv forsigtigt (undgå dannelsen af ​​bobler) med en flamme-poleret silikoniseret Pasteur-pipette 10-15x indtil celle dispersion er opnået, og få, om nogen, bidder af udissocieret væv tilbage.
  6. Lag forsigtigt dissocierede cellesuspension i en 3 ml pude af 4% vægt / vol bovint serumalbumin (BSA) i Hanks Balanced Salt Solution plus additiver (HBSS +, se afsnit 1.6.1).
    1. Klargør trinvis gradient opløsning ved at opløse BSA ved stuetemperatur uden opsigtring i HBSS indeholdende 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 4 mM NaHCO3 og 40 mM glucose (HBSS +) og derefter sterilt filter og opbevares ved 4 ° C.
  7. Centrifuge, 100 xg, 7 min i en bordcentrifuge med en swing-out rotor.
  8. Fjern supernatanten være omhyggelig med ikke at aspirere cellepelleten.
  9. Resuspender pelleterede celler forsigtigt med en flamme-polerede (silikoniseret) Pasteur-pipette (eller 1 ml blå pipettespids) i 1 ml komplet Neurobasal medium (2% B27, 0,5 mM L-glutamin tilsat 1% FCS).
  10. Count to 10 gl portioner ved hjælp af et hæmocytometer (nb kun tælle fase-lyse celler som "live" celler).
  11. Plate primære neuroner på preprepared overtrukne dækglas (0,75-1 x 10 5/18 mm dækglas i 12-brønds plade). Umiddelbart før plating, aspirere overskydende laminin / serum løsning fra dækglas og erstatte med primær neuron dyrkningsmedium (se nedenfor). NB krævede numbra af dækglas skal bestemmes på forhånd som dækglas forberedelse er begyndt dagen før kultur (se trin 1.1).
  12. Kultur rotte primære E18 hippocampale neuroner i op til 21 dage in vitro (DIV) i neurobasalt medium, 2% B27, 0,5 mM L-glutamin tilsat 1% FCS (varmeinaktiveret). Udfør en halv medium forandring på 7 DIV og derefter ugentligt. Den antimitotisk fluordeoxyuridin / uridin tilsættes ved 7 DIV, 1/1, 000 fortynding af 10 mM bestand af hver nukleosid) for at forhindre glial tilgroning.

2. Antistof Inkubation med Live-neuroner

  1. I den første uge i kultur, er neuroner udvikler dendritiske dorne og ved uge 2-3, har neuroner modnet tilstrækkeligt til at blive undergår synaptogenesis 6,7.
    1. På udvalgte eksperimentelle tidspunkt / s, gælder det primære antistof til tredobbelte brønde, der indeholder primære embryonale neuroner på dækglas. Der tilsættes en portion af antistoffet direkte i dyrkningsmedietde primære neuroner til den ønskede endelige fortynding Bemærk: I vores eksempel blev et kanin polyklonalt antiserum rejst mod et rekombinant udskilt form af proteinet, fortyndet 1/500 ved tilsætning af 2 pi til 1 ml dyrkningsmedium i godt, centrifugering i 10 min , 13.000 xg, RT kan indarbejdes forud for at tage en portion af antistof, da dette vil fjerne partikler, og kan hjælpe med at reducere baggrunden.
    2. For præimmune serum kontroller tilsættes en ækvivalent mængde af præimmunserum (til den samme endelige fortynding). Hvis der ikke præimmunserum er tilgængelig, tilføje ækvivalent volumen Neurobasal medium eller PBS (ingen primære antistof kontrol). Alternativt, hvis en passende primære antistof er tilgængelig som genkender intracellulære område / r af proteinet dette antistof kan tilsættes til en kontrol og for at teste specificiteten af ​​overfladefarvning.
    3. Retur cellerne til kulturen inkubatoren i 1-4 timer (denne inkubationsperiode kan bestemmes empirisk). I vores experimeNTS antistoffet var til stede i hele perioden, selv om det eksperimentelle design kunne inkorporere en puls af antistof efterfulgt af en yderligere inkubationsperiode efter vask-out (en pulssporingsforsøg) for at vurdere tidsforløbet af internalisering.
      Valgfrit trin: Inkubationen kan udføres ved stuetemperatur eller endda på is for at sænke hastigheden af ​​basal protein internalisering, hvis nødvendigt. Hvis den udføres i et ikke-CO 2-kontrolleret miljø, bør mediet ændres til en, der ikke bicarbonat bufret før tilsætning af antistof / antiserum. ADVARSEL: Modne neuron kulturer (> 14 dage og især dyrkede muse embryonale neuroner) ikke tåle fuld medium ændringer godt.
  2. Vi har anvendt inkubationstider for denne primære antistof internalisering trin af 1 time, 2 timer og 4 timer med gode resultater, selv om det optimale tidspunkt vil afhænge af overflod af proteinet af interesse samt dynamikken af ​​protein handel i cells under studiet.
    BEMÆRK: De dobbelte farvebilleder vist i Repræsentative resultater blev opnået med en inkubationstid på 1 time ved 37 ° C i en vævsdyrkningsinkubator.
  3. Efter inkubation i den ønskede periode, aspireres fra antistof-holdige medium. Brøndene vaskes forsigtigt, men hurtigt én gang med PBS ved stuetemperatur.

3. Sekundært antistof Ansøgning til Fast, Unpermeabilized Cells

  1. Fix neuroner med 4% paraformaldehyd i fosfatbuffer pH 7,2, 5 min ved stuetemperatur Bemærk: For bedste resultater, frisklavet fiksativ, alternativt bruge fix, der er opbevaret ved -20 ° C og helt optøet, så der ikke udfældet paraformaldehyd er indlysende . ADVARSEL: Paraformaldehyd fiksativ bør udarbejdes og håndteres i et stinkskab.
  2. Fjern fix fra brønde (overførsel til flydende affaldscontainer i stinkskab) og skyl 3x med PBS.
    1. Valgfrit trin: Hvis det ønskes, for at spare på antistofreagenser, kan dækglasomhyggeligt fjernet fra 12-brønds plade med en pincet og placeret celle side opad, på et stykke Parafilm lagt på bunden af ​​en engangs dyrkningsplade.
    2. Opløsninger kan derefter pipetteres forsigtigt på dækglassene, så de er fuldstændigt dækket uden opløsningen oversvømmelser over kanten af ​​dækglasset på Parafilm.
    3. Denne teknik er velegnet til kortvarige inkubationer (1-2 time) dog længere inkubationer (fx natten over) bør udføres i et fugtigt kammer. Alternativt kan dækglas placeres tilbage i brøndene i 12-brønds pladen for inkubering natten over og tilstrækkelig volumen bør tilføjes for at sikre, at dækglassene ikke tørre ud.
  3. Blok til 30 minutter ved stuetemperatur med 5% BSA i PBS (Bemærk: Du må ikke tilføje vaskemiddel til blokerende opløsning på dette tidspunkt, da det er vigtigt, at cellerne ikke permeabilized).
  4. For at mærke overflade protein før du fortsætter med detekteringtion af internaliserede protein, anvende første fluorescensmærkede 2 ° antistof valg.
    Bemærk: I det her beskrevne eksempel blev den primære antiserum rejst i kanin (in-house-antistof) til et rekombinant udskilt isoform 4. Således for første sekundært antistof til påvisning af ekstracellulære region af det transmembrane isoform på overfladen af ​​unpermeabilized neuroner brugte vi æsel-anti-kanin Dylight 649 (1/200 fortyndet i PBS indeholdende 5% BSA). Det anbefales at centrifugere fortyndede sekundær antistof-opløsninger (10 min, 13.000 xg, RT) før brug.
  5. Inkubér dækglas i 2 timer ved stuetemperatur.
  6. Vask dækglas (i brønde), 2x 5 minutter med PBS.

4.. Blokering med overskud af umærket 2 ° Antibody

  1. Blokere unpermeabilized neuroner med en høj koncentration (> 0,1 mg / ml) af umærket 2 ° antistof.
    1. Den umærkede 2 ° antistof bør hæves mod de arter, hvordet primære antistof blev hævet (i dette tilfælde kanin) ved inkubation natten over ved stuetemperatur.
    2. Til denne protokol blev AffiniPure Fab fragment gede anti-kanin IgG (H + L), der anvendes i en koncentration på 0,13 mg / ml.
      BEMÆRK: inkubation natten over blev fundet at være af afgørende betydning, da kortere inkubationstiden (2 timer), var utilstrækkelig til fuldstændig blokering af primært antistof, der ikke var fuldt bundet af mærket sekundært antistof.
  2. Vask dækglas (i brønde), 2x 5 minutter med PBS.
  3. Efter dette bloktrinet, post-fikseres cellerne med 4% paraformaldehyd i phosphatbuffer pH 7,2, 5 minutter ved stuetemperatur. Skyl med PBS (2x) efter fjernelse af fiksativ (overførsel fiksativ til flydende affaldscontainer i stinkskab).

5.. Permeabilisering og anvendelsen af ​​det andet Fluorescerende Konjugeret 2 ° antistof

  1. Permeabiliserer og blokere cellerne med 5% BSA i PBS indeholdende 0,1% Triton-X-100 ved værelse tempeperatur i 30 minutter.
  2. Den blokerende opløsning fjernes (at tage sig at de dækglas ikke tørre ud). Tilsæt den anden fluorescens-konjugeret 2 ° antistof mærket med en anden fluorofor.
    1. BEMÆRK: Det skal være muligt at skelne denne fluorofore tag fra det tidligere anvendte, afhængigt af de tilgængelige excitation / emission filtre på konfokal mikroskop (se nedenfor).
    2. For præsenteres i denne protokol eksempel blev en Alexa Fluor 488-konjugeret æsel-anti-kanin 2 ° anvendte antistof (1/200 i PBS, 5% BSA og 0,1% Triton-X-100). Inkuber 2 timer ved stuetemperatur og derefter fjerne 2 ° antistof løsning.
  3. Vask dækglas 3x 5 minutter med PBS og endelig kort vask med deioniseret vand.

6.. Montering og Imaging

  1. Mount dækglas på objektglas med en vandig montering medium indeholdende antiblegemiddel (f.eks Vectashield), og lad det tørre. Opbevares i mørke ved 4 ° C i optimal bevarelse af fluorescerende signal intensitet.
  2. Billede immunofarvet celler på en konfokal mikroskop.
    1. Passende excitation og emission filtre til detektering af de to fluoroforen signalerne skal være tilgængelige.
    2. Hvis der er forskellige eksperimentelle betingelser skal sammenlignes (f.eks internalisering satser under depolariserede 8,9 eller kontrol betingelser), sikre, at alle replikere dækglas fra de forskellige betingelser er afbildet med de samme billedparametrene erhvervelsesomkostninger. Kan derefter måles integrerede tæthed af standard regioner af interesse eller puncta attributter (fx antal, størrelse) fra de fremkomne billeder bruger standard billede analyse software (f.eks Fiji / ImageJ, Metamorph).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tofarvet fluorescerende immunfarvning teknik præsenteres her, er nyttige til mærkning af ekstracellulære domæner af transmembrane proteiner i levende celler (vist skematisk i figur 1). Under inkubationsperioden immunoglobulinerne binder tilgængelige epitoper og en del af populationen af ​​proteinmolekyler sammen med bundet antistof, endocytose. Desuden kan nysyntetiserede protein at nå celleoverfladen via fremad handel og genbrugsmaterialer proteinmolekyler kan returneres til plasmamembranen 10.

Denne metode er blevet optimeret til detektering af to forskellige protein pools, celleoverfladen og internaliseres ved hjælp af den samme primære antistof specifikt for proteinet under undersøgelse. Ved anvendelse af en fluorescens-mærket sekundært antistof til fikserede celler før permeabilisering kan protein lokaliseret på celleoverfladen på tidspunktet for fiksering påvises. Indarbejdelsen af ​​en thordybdegående bloktrinet at forbyde enhver binding af resterende protein-primære antistof overflade komplekser, som ikke er bundet af den første sekundære antistof tillader efterfølgende påvisning (med sekundært antistof konjugeret til en anden fluorofor) af protein-antistof-komplekser, som blev endocytoserede under inkubationen periode (figur 1).

Repræsentative billeder af dobbelt farvemærkning opnået med denne metode er vist i figur 2. Indarbejdelsen af ​​et blokerende trin af lang varighed (inkubation natten) med den relevante umærkede sekundære antistof, rettet mod mætning binding af eventuelle resterende overflade protein / primære antistof-komplekser, viste sig at være afgørende for succes af denne tilgang. Effektiviteten af ​​dette blokerende trin med umærket sekundært antistof før permeabilisering demonstreres ved fraværet af dobbelt-farvet puncta (med undtagelse af småcellet markeret med en pilespids, som udviser den karakteristiske morfologi for en døende celle, vises afrundet og kondenseret, figur 2). Optimering af de betingelser og kombinationer for de to mærkede sekundære antistoffer kan være nødvendige og den no-primære antistof tilstand er en vigtig kontrol. Mens han arbejdede op denne protokol, fandt vi, at det ikke var muligt at helt at blokere uspecifik binding af visse mærkede sekundære antistoffer, især med at blokere et kortere tidsrum end det inkubation natten beskrevet her.

Eksempler på én farvemærkning af internaliserede protein i dyrkede neuroner (figur 3) for at fremhæve karakteristiske punktformig farvningsmønster af protein i endosomale rum 10,11. For at bekræfte, at protein internaliseres under antistof-fodring inkubation og vise punktat farvning blev lokaliseret i endosomer, neuroner udtrykker en tidlig / genbrug endosome markør (transferrin-mCherry; TFR-MCH) 12 blev immunostained efter permeabilisering. Den omfattende overlapning af punktformet farvning med TFR-MCH-ekspression er vist i figur 4..

Figur 1
Figur 1.. Skematisk viser tofarvet mærkning af celle-overflade og internaliserede proteiner efter antistof fodring af levende dyrkede neuroner. Klik her for at se større billede .

Figur 2
Figur 2. LaBeling celle-overflade protein (cyan, EXT) og internaliseret protein (grøn, INT). om en kultiveret rotte hippocampus neuron sammen med det flettede billede (flet) Dobbelt farvning (pilespids) blev kun observeret i en celle, der tilsyneladende var usundt. Skala bar = 10 mM. Klik her for at se større billede .

Figur 3
Figur 3. Højere magt visning af enkelt-farve (internaliserede protein) immunfarvning viser den typiske punktformet mønster af endocytoserede proteiner. Skala bar = 10 mM. Klik her for at se større billede .


Fig. 4. En region i den dendritiske dorn af en neuron, der udtrykker en fluorescerende markør for genanvendelse endosom (en ekspressionskonstruktion til transferrin-receptor-mCherry fusionsproteinet TFR-MCH blev transficeret under anvendelse af Lipofectamine 2000 [Invitrogen] i overensstemmelse med producentens anvisninger ). Dagen efter transfektion blev neuroner farves (efter permeabilisering) for endocytose protein (kandidat-receptor), viser overlapning med genanvendelse endosom rum. Skala bar = 20 um. Klik her for at se større billede .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den her beskrevne teknik er komplementær til celleoverflade-biotinylering (gennemgået af Arancibia-Carcamo et al.) 12, og det er den foretrukne metode til at bevare information om den subcellulære lokalisering af det internaliserede protein, forudsat at en passende primære antistof til et extracellulær epitop er tilgængelig. Desuden kan kvantificering af protein handel / internalisering tiden udføres (ved fastsættelse af dækglas på forskellige tidspunkter i løbet af levende celler inkubation med primært antistof), uden at det er nødvendigt at forberede proteinekstrakter.

Farvning intensitet eller antallet og størrelsen af ​​puncta i områder af interesse (for eksempel den apikale regioner pyramideformet neuronal somata eller den proksimale apikale dendritceller på et sæt afstand fra soma) kan måles i konfokal billeder og sammenlignet under forskellige betingelser (for eksempel stimuleret versus basisniveauer 8,9). Internaliseret receptor SIGnal intensitet kan derefter normaliseret til at af overflade receptorer. Alternativt kan teknikken være tilpasset til kvantificering af receptor genanvendelse tilbage til celleoverfladen gennem optagelse af en stripning trin for at fjerne resterende antistof fra celleoverfladen efterfulgt af en inkubation for at tillade tidligere internaliseres, antistofbundet protein at vende tilbage til overflade 13.

Ved hjælp af denne metode, var vi i stand til at bekræfte, at Sez6, den formodede membran-receptoren af ​​interesse, når og er lokaliseret på celleoverfladen i neuroner. Således er denne teknik lykkedes, hvor mere almindeligt anvendt immunfluorescens eller immunoelektronmikroskopi (præ-embedding immunogold) protokoller, der tidligere var mislykkedes. Trods forudsigelser baseret på den primære aminosyresekvens for dette protein var endegyldige bevis for dets tilstedeværelse på celleoverfladen været vanskeligt at opnå. Proteinet vi opdaget på overfladen af ​​nonpermeabilized celler var umiddelbart synlige som sondringt puncta besidder lignende karakteristika for de tilstedeværende intracellulært i somatodendritiske og axonale rum. En mulig forklaring på denne overflade punktformig farvning er, at bindingen af antistof kan stimulere internalisering og derfor muliggøre påvisning af klynger last i fremspirende clathrin overtrukne gruber 14. Overlapning farvningsmønstret af internaliserede protein puncta med den tidlige / genbrug endosome reporter TFR-mCherry giver indirekte støtte til dette koncept. Derudover har vi beviser (ikke offentliggjort), at en del af proteinet er til stede i lipidklumper, der også redegør for dens grupperet fordeling på overfladen.

Mens vi har fokuseret vores opmærksomhed på neuroner i den nuværende protokol, observerede vi bevis for optagelse af immunoreaktivt protein (sandsynligvis til at repræsentere de udskilles og / eller spaltede versioner af protein) i gliaceller morfologisk ligner astrocytter. Denne konstatering er interest, for det første fordi det indikerer, at metoden kan tilpasses til studiet af parakrine virkninger af udskilte faktorer (for eksempel i cokulturer), dels, fordi det indebærer, at metoden vil være gældende for andre celletyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takker Teele Palumaa for assistance med tallene. Finansieret af Project Grant 1008046 fra National Health og Medical Research Council, Australien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS with Ca and Mg Invitrogen 14040182
Neurobasal medium Invitrogen 21103-049
B27 supplement Invitrogen 17504-044
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation PDS
Bovine Serum Albumin  Sigma Aldrich Australia A9418
Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red Invitrogen (Gibco) 14175-079
Poly-D-Lysine Sigma Aldrich Australia P0899
Natural mouse laminin Invitrogen 23017-015 Thaw on ice prior to making aliquots
Fetal bovine serum HyClone Thermo Fisher
Fluorodeoxyuridine Sigma Aldrich Australia F0503
Uridine Sigma Aldrich Australia U3003
18 mm Round glass coverslips Menzel Gläser CB00180RA1
VECTASHIELD aqueous mounting medium Vector Laboratories H1400
Donkey anti-rabbit Dylight 649  Jackson ImmunoResearch Laboratories 711-495-152
AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L)  Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-007-003
Paraformaldehyde Sigma Aldrich Australia P6148 TOXIC - handle in fume hood
Triton-X-100 Sigma Aldrich Australia T8787
Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody Invitrogen - Molecular Probes A21206

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewis, T. L. Jr, Mao, T., Arnold, D. B. A role for myosin VI in the localization of axonal proteins. PLoS Biol. 9, (2010).
  2. von Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
  3. Gunnersen, J. M., Augustine, C., Spirkoska, V., Kim, M., Brown, M., Tan, S. -S. Global analysis of gene expression patterns in developing mouse neocortex using serial analysis of gene expression. Mol. Cell. Neurosci. 19, 560-573 (2002).
  4. Gunnersen, J. M., Kim, M. H., et al. Sez-6 proteins affect dendritic arborization patterns and excitability of cortical pyramidal neurons. Neuron. 56, 621-639 (2007).
  5. Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. Syntaxin-4 Defines a Domain for Activity-Dependent Exocytosis in Dendritic Spines. Cell. 141, 524-535 (2010).
  6. Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures. Brain Res. 1359, 44-55 (2010).
  7. Grabrucker, A., Vaida, B., Bockmann, J., Boeckers, T. M. Synaptogenesis of hippocampal neurons in primary cell culture. Cell Tissue Res. 338-341 (2009).
  8. Vaillant, A. R., Zanassi, P., Walsh, G. S., Aumont, A., Alonso, A., Miller, F. D. Signaling mechanisms underlying reversible, activity-dependent dendrite formation. Neuron. 34, 985-998 (2002).
  9. Park, M., Penick, E. C., Edwards, J. G., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Recycling endosomes supply AMPA receptors for LTP. Science. 305, 1972-1975 (2004).
  10. Kennedy, M. J. &, Ehlers, M. D. Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 29, 325-362 (2006).
  11. Lasiecka, Z. M., Yap, C. C., Caplan, S., Winckler, B. Neuronal early endosomes require EHD1 for L1/NgCAM trafficking. J. Neurosci. 30, 16485-16497 (2010).
  12. Arancibia-Cárcamo, I. L., Fairfax, B. P., Moss, S. J., Kittler, J. T. Studying the localization, surface stability and endocytosis of neurotransmitter receptors by antibody labeling and biotinylation approaches. The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology. Kittler, J. T., Moss, S. J. CRC Press. Boca Raton, FL. (2006).
  13. Petrini, E. M., Lu, J., Cognet, L., Lounis, B., Ehlers, M. D., Choquet, D. Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation). Neuron. 63, 92-105 (2009).
  14. Reider, A., Wendland, B. Endocytic adaptors – social networking at the plasma membrane. J. Cell Sci. 124, 1613-1622 (2011).
Differential Mærkning af Celle-overflade og internaliseres Proteiner efter Antibody Fodring Live dyrkede neuroner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carrodus, N. L., Teng, K. S. L., Munro, K. M., Kennedy, M. J., Gunnersen, J. M. Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons. J. Vis. Exp. (84), e51139, doi:10.3791/51139 (2014).More

Carrodus, N. L., Teng, K. S. L., Munro, K. M., Kennedy, M. J., Gunnersen, J. M. Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons. J. Vis. Exp. (84), e51139, doi:10.3791/51139 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter