Summary
هذا البروتوكول تفاصيل مقايسة مصممة لقياس الكيميائي العدلة الإنسان من قطرة واحدة من الدم الكامل مع استنساخ قوية. هذا النهج تلتف على ضرورة الفصل العدلة ويتطلب بضع دقائق فقط من الوقت اللازم لإعداد مقايسة. رقاقة ميكروفلويديك تمكن التدبير المتكررة الكيميائي العدلة مع مرور الوقت في الرضع أو الثدييات الصغيرة، حيث حجم العينة محدودة.
Abstract
العدلات تلعب دورا أساسيا في الحماية ضد الالتهابات وأعدادهم في الدم في كثير من الأحيان يتم قياس في العيادة. عدد العدلات العالي في الدم وعادة ما تكون مؤشرا على العدوى الجارية، في حين التهم العدلة المنخفضة هي علامة تحذير لمخاطر أكبر للعدوى. لإنجاز مهامهم، يكون العدلات أيضا أن تكون قادرة على التحرك بشكل فعال من الدم حيث يقضون معظم حياتهم، إلى أنسجة، حيث تحدث العدوى. وبالتالي، يمكن أي عيوب في قدرة العدلات لترحيل زيادة مخاطر للعدوى، حتى عندما تكون موجودة بأعداد مناسبة في الدم العدلات. ومع ذلك، وقياس القدرة الهجرة العدلة في العيادة هي مهمة صعبة، والتي تستغرق وقتا طويلا، ويتطلب كمية كبيرة من الدم، ومعرفة الخبراء. لمعالجة هذه القيود، قمنا بتصميم المقايسات ميكروفلويديك قوية للهجرة العدلات، الأمر الذي يتطلب قطرة واحدة من الدم غير المجهزة، يلتصقفتحات الحاجة لفصل العدلة، وسهلة لقياس على المجهر بسيطة. في هذا الاختبار، العدلات تهاجر مباشرة من قطرات الدم، من خلال قنوات صغيرة، نحو مصدر جاذب كيميائي. لمنع تدفق الحبيبية من خلايا الدم الحمراء من خلال نفس القنوات، ونفذنا المرشحات الميكانيكية مع زاوية الحق يتحول التي تمنع بشكل انتقائي تقدم خلايا الدم الحمراء. نحن التحقق من صحة الفحص بمقارنة الهجرة العدلة من قطرات الدم التي تم جمعها من وخز الإصبع والدم الوريدي. نحن أيضا مقارنة هذه الدم الكامل (WB) مصادر الهجرة العدلة من عينات من العدلات المنقى وجدت سرعة ثابتة والاتجاهية بين المصادر الثلاثة. وهذه المنصة ميكروفلويديك تمكين دراسة الهجرة العدلات الإنسان في العيادة وإعداد البحوث للمساعدة في دفع فهمنا من وظائف العدلات في الصحة والمرض.
Introduction
الاتجار العدلة يلعب دورا حاسما في تحديد التقدم وحسم العديد من حالات الالتهابات، بما في ذلك تصلب الشرايين 1، عدوى بكتيرية أو الإنتان 2، وحرق إصابة 3. للمساهمة كبرى لشروط الصحة والمرض، عدد العدلات هو جزء من تحليل الدم القياسية غالبا ما يعتبر في المختبرات السريرية والبحوث. ومع ذلك، على الرغم من كونها واحدة من التجارب الأكثر انتشارا، وقيمة عدد العدلات في تشخيص العدوى والإنتان قد شكك في كثير من الأحيان 4. على سبيل المثال، كشفت دراسة واحدة من العدلات في مرضى الحروق التي العد العدلة والعدلة وظيفة الهجرة لا ترتبط؛ مما يدل على أن العدلات العد وحده ليس مؤشرا دقيقا لحالة المناعة 3. على الرغم من صعوبة قياس، وقد اقترح العدلة الكفاءة الوظيفية على أنها أكثر قيمة في مجموعة واسعة من الظروف.
ر "> الأهم من ذلك، العديد من العيوب العدلات عابرة وليست ناجمة عن عيوب وراثية دائمة، وهو التمييز الذي تم تجاهله إلى حد كبير في العيادة حتى وقت قريب. وفي سياق إصابات الحروق، ويمكن رصد هجرة العدلات أثناء علاج المريض كمؤشر على حالة التهابات أو عدوى 3. لا يمكن ترجمتها المقايسات الهجرة التقليدية المستخدمة حاليا في المختبر (غرفة بويدن، وغرفة دن، مقايسة micropipette) في عملية إعداد سريرية لأنها تتطلب كميات كبيرة من الدم ومرهقة تستغرق وقتا طويلا تقنيات العدلة العزلة (الجدول 1). أيضا لا يمكن أن تستخدم هذه المقايسات لرصد التغيرات عابرة في الكيميائي العدلة في الحيوانات المختبرية الصغيرة، مثل الفئران، وذلك لأن حجم الدم اللازمة لالعدلة العزلة يسمح لعينة واحدة فقط، وغالبا ما حتى يتطلب تجميع الدم من الحيوانات متعددة لفحص واحد، فعلى سبيل المثال، دراسة شملت مالشروط والعلاجات ضافة عدة على عدة نقاط في الوقت يحتمل أن تتطلب الآلاف من الفئران باستخدام المقايسات الكيميائي الحالي. هذا يحد من البحوث البيولوجية الأساسية التي يمكن القيام به لفهم ديناميات معقدة من وظيفة المناعة في سياق إصابات أو عدوى أو حرق غالبا ما درس في نماذج الفئران 5.لتلبية الحاجة لفحص وظيفي العدلة التي هي سريعة وقوية، في حين تتطلب الحد الأدنى من حجم الدم، قمنا بتطوير جهاز ميكروفلويديك الذي يقيس الكيميائي العدلة مباشرة من قطرات صغيرة من الدم الكامل. من المعروف أن العديد من العوامل في الدم كله، بما في ذلك المصل 6 و 7 الصفائح الدموية، تؤثر على وظيفة العدلات. ولذلك فمن المفيد أن كل مقايسة ميكروفلويديك الدم يقلل تجهيز العينات للحفاظ على المكروية في الجسم الحي من العدلات عند قياس التغيرات في الكيميائي مع المختبر في فحص 8. هذا النهجيقلل من الوقت من جمع الدم إلى العدلة المقايسات الهجرة من ساعة باستخدام التقنيات التقليدية، لدقائق معدودة فقط (الجدول 1). منصة ميكروفلويديك الدم الكامل تنتج استقرارا التدرج جاذب كيميائي خطي لطول التجربة، لا يوجد لديه أجزاء متحركة، ولا يتطلب مصدر الضغط الخارجي (أي ضخ حقنة). الميزة الرئيسية في تصميم كامل الجهاز ميكروفلويديك الدم هو إدماج خلية الدم الحمراء (RBC) مشط الترشيح أن يرشح ميكانيكيا كرات الدم الحمراء من دخول القناة الهجرة من الجهاز. يتحول حق هذا الترشيح مشط حيلولة دون الحاجة لترشيح حجم الإقصاء، والتي من المرجح أن يكون انسداد بواسطة كرات الدم الحمراء، وبالتالي منع التدرج جاذب كيميائي من الوصول إلى العدلات المهاجرة بنشاط في الضفة الغربية. إدماج كامل الجهاز ميكروفلويديك الدم في لوحة 12 أو 24 أيضا يسهل فحص وسطاء متعددة من الاشتراكية العدلات الكيميائي الإنسان أو الفئرانmultaneously.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ميكروفلويديك تصنيع جهاز
- باستخدام تقنيات الطباعة التصويرية القياسية وتصنيع القالب رقاقة الماجستير في غرفة نظيفة الطبقة 1،000. النمط الأول 3 ميكرون رقيقة طبقة مقاومة للضوء سلبي قائم على الايبوكسي لتحديد قنوات الهجرة وفقا لتعليمات من الشركة المصنعة. النمط الثاني طبقة 50 ميكرون سميكة لتحديد الخلية التحميل وchemokine غرف.
- استخدام رقاقة منقوشة للادلاء polydimethylsiloxane الأجهزة (PDMS). بقوة مزيج PDMS (20 غرام) مع البادئ (2 غ) لمدة 5 دقائق باستخدام الشوكة البلاستيكية في علبة بلاستيكية كبيرة وزنها.
- صب بعناية PDMS على القالب.
- ديغا في PDMS عن طريق وضع القالب مع PDMS سكب في مجفف فراغ لمدة 1 ساعة.
- خبز وعلاج PDMS ميكروفلويديك الأجهزة لا يقل عن 3 ساعة في الفرن لتعيين 65 درجة مئوية.
- كمة خارج WBLCs المركزية باستخدام الناخس التي يبلغ قطرها 1.5 ملم غيض من.
- لكمة من الأجهزة على شكل دونات كله باستخدام puncلها بقطر غيض من 5.0 مم.
- إزالة الجسيمات من أجهزة دونات باستخدام شريط لاصق.
- شطف لوحة 12 جيدا مع الماء منزوع الأيونات ثم الجافة مع النيتروجين. وضع لوحة في الفرن 60 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- الأكسجين البلازما علاج لوحة 12 جيدا مرتين؛ مرة واحدة وحدها لمدة 35 ثانية ثم مرة أخرى مع دونات الأجهزة لمدة 35 ثانية أخرى.
- وضع بعناية الأجهزة في الآبار من لوحة باستخدام الملقط.
- لوحة خبز مع أجهزة المستعبدين على صفيحة ساخنة تعيين إلى 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
2. ميكروفلويديك الفحص التحضير
- أجهزة ميكروفلويديك رئيس مباشرة بعد العلاج البلازما الأكسجين، وعندما يكون الجهاز هو ماء والآثار الشعرية يمكن أن تعزز فتيلة من قنوات صغيرة في الجهاز.
- خلق حل جاذب كيميائي عن طريق خلط 5 ميكرولتر fMLP [محلول المخزون 10 ميكرومتر] مع 5 ميكرولتر فبرونيكتين [محلول المخزون 1 ملغ / مل] و 490 ميكرولتر HBSS.
- ببطء الماصة & #160؛ حل جاذب كيميائي في WBLC، وذلك باستخدام طرف جل التحميل (الشكل 1A). الماصة ل20 ميكرولتر إضافية من جاذب كيميائي حول الجزء الخارجي من الجهاز.
- وضع لوحة في مجفف لمدة 15 دقيقة. من خلال تطبيق فراغ إلى الجهاز، وتغرس الحل في الجانب قنوات للجهاز والهواء النازحين تنتشر من خلال وPDMS.
- إزالة لوحة من مجفف وتأكيد ترطيب قناة الجهاز تحت المجهر. مشاهدة ليصبح أصغر فقاعة كحل جاذب كيميائي يدخل الغرفة. ينبغي أن تكون هناك فقاعة موجودة داخل الجهاز بعد العلاج فراغ.
- غسل WBLC وخارج الجهاز جيدا لإزالة حل جاذب كيميائي الزائدة. هذه الخطوة بإنشاء التدرج من جاذب كيميائي من كل دائرة من الدوائر الكيميائي التنسيق (FCCs) إلى مركز الجهاز.
- ملء حقنة 1 مل مع برنامج تلفزيوني، إضافة إلى 30 G طرف إبرة حادة إلى الحقنة. بلطف، وإدراج غيض إبرة الحقنة فيإلى مركز الثقب دونات. دفع برفق 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في الحفرة بحيث قطرات من أشكال PBS على رأس الجهاز.
- لوحة الميل وماصة 1 مل من برنامج تلفزيوني حول الجهاز بحيث يجمع السائل في قاع البئر. نضح السائل وعملية تكرار لمجموعه 3X باستخدام حل العازلة الطازجة (وسائل الإعلام بدلا من استخدام عازلة إذا كان سيتم تحميل العدلات فصل في وسائل الإعلام) 9.
- ملء كل بئر مع وسائل الاعلام حتى يتم المغمورة قمم الأجهزة تحت السائل. السماح للأجهزة الجلوس لمدة 15 دقيقة للسماح التدرج لتحقيق الاستقرار. النتائج التجريبية والبيانات النظرية من محاكاة العناصر المحددة تبين أن التدرجات في هذه الأجهزة هي مستقرة تصل إلى 24 ساعة لجزيئات صغيرة (على سبيل المثال، fMLP) وتصل إلى عدة أيام لعرض أكبر الوزن الجزيئي (على سبيل المثال، IL8).
- نصائح باستخدام هلام التحميل، ماصة ببطء 2 ميكرولتر من الدم (أو العدلات معزولة) في كل مبناها الدم الكاملقرع غرفة (WBLC) (الشكل 1A).
3. إعداد نموذج
العدلات الإنسان من الدم الشعرية
- جمع الدم الشعرية من وخز الإصبع من المتطوعين الأصحاء، الذين لا مناعة على. وقد تم الحصول على جميع عينات المرضى مع الموافقة المسبقة الخطية، ومن خلال الإجراءات المعتمدة من قبل MGH وشرينرس مجالس المراجعة المؤسسية.
- لجمع الدم وخز الاصبع، وغسل اليدين بالماء والصابون وتجفيف الجلد. إعداد محلول المخزون anti-coagulant/stain بإضافة 1 مل HBSS + HSA 0.2٪ و 10 ميكرولتر هويشت صمة عار (32.4 ميكرومتر) لجمع الدم أنبوب الهيبارين (1.65 USP/50 ميكرولتر من الدم). وخز الإصبع باستخدام مشرط السلامة SurgiLance (2.2 ملم العمق، 22 G)، يمسح أول قطرة من الدم، وجمع 50 ميكرولتر من الدم في أنبوب إيبندورف التي تحتوي على مخزون المضادة للتخثر وهويشت حل الفلورسنت وصمة عار (10 ميكرولتر) وبلطف المزيج.
العدلات الإنسان من الدم الوريدي
- رسم 10 مل من الطرفية، والدم الوريدي في أنابيب تحتوي على 33 USP الهيبارين.
- إضافة 50 ميكرولتر من الدم الوريدي إلى وسائل الإعلام وهويشت صمة عار كما هو موضح سابقا. احتضان الدم وهويشت صمة عار لمدة 10 دقيقة للسماح لتلطيخ الفلورسنت النواة. تشغيل العينة في حدود 1 ساعة من جمع الدم.
العدلة فصل من الدم الجامع - التحكم إيجابي
- لفصل العدلات، واستخدام تقنيات عقيمة لعزل العدلات من 10 مل عينة من الدم الوريدي كله باستخدام Hetastarch (6٪ ث / ت) التدرج الكثافة تليها مجموعة مختارة حبة المغناطيسي عدة عزلة سلبية بعد بروتوكول المصنعين.
- معلق قسامة النهائي من العدلات في concentrأوجه من 4،000 خلية / ميكرولتر 1X في HBSS + 0.2٪ ألبومين المصل البشري. إبقاء الخلايا عند 37 درجة مئوية حتى جاهزة للتشغيل التجربة.
4. المجهري وتحليل الصور لالعدلات الكيميائي القياسات
- إعداد درجة حرارة biochamber إلى 37 درجة مئوية والرطوبة 80٪، وأول أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2.
- بدء التصوير فورا باستخدام الوقت الفاصل بين التصوير على المجهر (10X التكبير أو أعلى).
5. التحليل الإحصائي
- تتبع يدويا لا يقل عن 50 العدلات في كل عينة.
- عد الخلايا دخول لجنة الاتصالات الفدرالية على مر الزمن (الشكل 2).
- حساب السرعات العدلة في القناة بين WBLC وFCC باستخدام يماغيج (NIH) (الشكل 2).
- تحديد اتجاهها من العدلات عن طريق حساب عدد الخلايا التي تمر التشعب وحساب النسبة بين عدد الخلايا التي تتحول نحو FCC والخلايا التي خروج اله الجهاز. الخلايا غير اتجاهي لا تتبع التدرج الكيميائي، وبالتالي تهاجر بأعداد متساوية تجاه لجنة الاتصالات الفدرالية والخروج قناة (الشكل 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم التحقق من صحة كله الدم (WB) العدلات الكيميائي الفحص عن طريق قياس تراكم العدلات نحو الانحدار fMLP (السينما S1). تؤكد النتائج أن كرات الدم الحمراء محاصرون من قبل مشط الترشيح بينما العدلات (الازرق) قادرون على الهجرة بنشاط من الدم الكامل (الشكل 3A والسينما S1). تم تأكيد مستقرة التدرج جاذب كيميائي الخطية (الخضراء) التي شكلتها كله الجهاز ميكروفلويديك الدم باستخدام ديكستران FITC المسمى (الشكل 3A أقحم) وقياس مستويات مضان بمرور الوقت. كانت التدرجات التي تنتج في هذه الأجهزة مستقرة تصل إلى 24 ساعة للجزيئات الصغيرة وتصل إلى أسبوع لعرض أكبر الوزن الجزيئي. تم التحقق من كفاءة بروتوكول الغسيل عن طريق التصوير إشارة الفلورسنت المترجمة في لجنة الاتصالات الفدرالية مع عدم وجود إشارة في WBLC أو المحيطة بها الجهاز. كانوا يعملون في الأجهزة القادمة لتقييم الاختلافات في الهجرة العدلة من مختلف BL مصادر العود.
النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام منصة الكيميائي رواية WB تكشف عن أن العدلات من قطرات إصبع وخز من البنك الدولي، والبنك الدولي من وريدي، أو معزولة عن الدم الوريدي تهاجر مع سرعة متسقة (20 ± 2 مم / دقيقة، والخط الأزرق) وبإجمالي الخلايا المهاجرة مماثلة ( 38 ± 10 خلية / ساعة، والحانات المظللة) من جميع المصادر الدم (الشكل 3B). كنا أيضا قادرة على تحديد اتجاهها أو قدرة العدلة لمتابعة التدرج الكيميائي بشكل صحيح. التشعب دمجها في تصميم الجهاز الدم الكامل سمح لنا لتحديد العدلات التي هاجرت إتجاهي على طول جاذب كيميائي التدرج نحو FCC مقارنة مع العدلات التي هاجرت عشوائيا تحت تنشيط كيميائي وخرجت من الجهاز. العدلات المهاجرة من جميع المصادر الدم ثلاثة هاجرت مع مؤشر 0.9 الاتجاهية (9 خلايا نحو FCC لكل خلية التي خرجت من الجهاز).
: together.within المحافظة على صفحة = "دائما"> 
الشكل 1. تخطيطي للجهاز على شكل دونات. A) وتستعد جاذب كيميائي في الجهاز ويتم تشكيل التدرج على طول القناة الهجرة نحو غرف الكيميائي التنسيق (FCCs). ستة عشر FCCs تحيط بكل WBLC. بعد الغسيل، وجاذب كيميائي يبقى فقط في لجنة الاتصالات الفدرالية، ويتم تشكيل الانحدار الخطي على طول القناة الهجرة. خلايا الدم الحمراء (RBC) الترشيح مشط يمنع كرات الدم الحمراء من انسداد القناة ومنع الهجرة النشطة العدلة. رؤية فيلم S1 باء) العدلات ترحيل بنشاط من الدم الكامل وتتراكم في لجنة الاتصالات الفدرالية، وعلى السرعة، والاتجاهية وأرقام يمكن أن يكون كميا بدقة. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر نسخة من هذا الرقم.
الشكل 2. تخطيطي ونظرة عامة على نظام العد الخليوي لجهاز WB. العدلات ترحيل بنشاط من 2 ميكرولتر من الدم الكامل (WB) تحميلها في غرفة كاملة التحميل الدم (WBLC) الماضي الحمراء الترشيح خلايا الدم ومشط في مدخل الجهاز. يتم قياس الاتجاهية للخلية استنادا إلى قرار الخلية في التشعب. سوف العدلات الاتجاه اتباع التدرج الكيميائي تؤدي إلى الخلايا غرفة الكيميائي وغير اتجاهي التنسيق لن تتبع التدرج وسوف تهاجر بشكل عشوائي إما نحو قناة خروج أو لجنة الاتصالات الفدرالية مع توزيع متساو. يتم حساب عدد الخلايا النهائية في كل نقطة زمنية عن طريق عد الخلايا في لجنة الاتصالات الفدرالية. files/ftp_upload/51215/51215fig2highres.jpg "الهدف =" _blank "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. قياس العدلات الكيميائي من قطرات من الدم الكامل (WB). A) WB (1 ميكرولتر) يتم تحميلها في غرفة كاملة التحميل الدم (WBLC). العدلات (الازرق) تهاجر على طول الكيميائي التدرج fMLP تشكلت في القناة الهجرة نحو FCC. B) العدلات من قطرات إصبع وخز من البنك الدولي، والبنك الدولي من وريدي، أو معزولة عن الدم الوريدي تهاجر مع أرقام متناسقة (الحانات) والسرعة (الازرق سطر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
r.within صفحة = "دائما"> 
الجدول 1. مقارنة بين البروتوكولات لالكيميائي العدلة باستخدام كامل منصة ميكروفلويديك الدم مقابل جهاز ميكروفلويديك من جانب القناة وغرفة بويدن التقليدية. تتم مقارنة كمية من الوقت والكواشف لإكمال كل خطوة بروتوكول بين أساليب مختلفة لقياس الكيميائي العدلة. منصة ميكروفلويديك الدم كله يقلل من الوقت الإجمالي المطلوب لتشغيل الفحص بنسبة 95٪ وحجم المطلوب من الدم> 99٪.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا العمل، قمنا بتطوير منصة ميكروفلويديك لقياس العدلات الكيميائي من قطرات من الدم (2 ميكرولتر). الترشيح الميكانيكي للكرات الدم الحمراء على رقاقة من الهجرة بنشاط العدلات تلتف الحاجة إلى أساليب مرهقة فصل الخلية مثل كثافة التدرجات 10، واختيار الإيجابي 11، أو اختيار السلبية 12، والتي هي عرضة لإدخال القطع الأثرية من خلال تفعيل العدلات. الترشيح الميكانيكي للكرات الدم الحمراء يميز التكنولوجيا لدينا من رقائق ميكروفلويديك الأخرى لبحث الهجرة العدلة. على سبيل المثال، الأعمال السابقة من مختبرنا 13 و بيب وآخرون. 8 selectins تستخدم على رقاقة، لفصل العدلات من عينة دم كامل، قبل الفحص الكيميائي. بعد الانفصال على الأسطح selectin، حدثت هجرة العدلات في حل العازلة. في هذه الظروف، وإزالة أي تأثير المصل على العدلات الكيميائي. وعلاوة على ذلك، ومن المعروف selectinsلتنشيط الخلايا عن طريق الانشغال مستقبلات معينة، وبالتالي قد يغير في القياسات الكيميائي المختبر. الفصل الميكانيكي عن طريق الترشيح مشط RBC في الجهاز لدينا لا يغير من حالة العدلات تقاس الجهاز لدينا. لدينا جهاز يسهل قياسات السرعة وقوية من الخلية رقم تراكم فضلا عن الاتجاهية الخلية.
في هذه الدراسة، ونحن قد أظهرت أن العدلات من المتطوعين الأصحاء المهاجرة من الدم الشعرية الكاملة، قطرة من الدم الوريدي، وفصلها عن الدم الوريدي تهاجر مع سرعة مماثلة والاتجاهية 14. قياس العدلة الاتجاهية المهم في حالات الالتهابات، مثل الحروق 3 و 15 و 16 الصدمة، حيث يعرف اتجاهها لتنخفض قيمته. ضعف وحفز على العدلات قد تهاجر بعيدا عن موقع الإصابة، وربما تتسبب في إصابة الأنسجة السليمة. وجود قيود من الجهاز الحاضرإد في هذه الورقة هو أن تخصيب الخلية على الجهاز غير ممكن، وبالتالي عدد الخلايا تعتمد على النسبة التي وجدوا في الدم كله الأصلية. هذا قد يثير مشاكل في الحصول على قياسات الكيميائي من عدد كبير من الخلايا في ظروف مثل قلة العدلات، حيث يكون عدد العدلات منخفض. آخر مشكلة محتملة في الجهاز لدينا هو عائق الفراغية للهجرة الخلايا عن طريق كرات الدم الحمراء أو خلايا أخرى المهاجرة في وقت واحد. في تجاربنا، ويمكن العدلات ضغط كرات الدم الحمراء الماضية المحاصرين في المنعطفات من الترشيح مشط RBC دون تغيير سرعة هجرتهم. بالإضافة إلى ذلك، تركيز جاذب كيميائي وفعالية من المهم للغاية في إحداث الهجرة الخلية. لاستكشاف مقايسة مع ظروف أخرى قد يكون من المهم لتشغيل منحنيات الاستجابة للجرعة مع مقادير متفاوتة من جاذب كيميائي. مناولة ومعالجة chemoattractants أكثر غير مستقرة مثل وسطاء الدهون هي أيضا حاسمة، ولذلك فمن المهم أن أجهزة رئيسمباشرة قبل WB التحميل. أخيرا، فإنه أمر بالغ الأهمية أيضا أن الدم كله لا تجلط قبل فتيلة الجهاز WB. إذا كان من غير الممكن لتشغيل فحص على الفور التالية يجب أن يتم تخزين جمع الدم الدم على الكرسي الهزاز في الهيبارين. وينبغي أن يتم تحميل العينة ببطء، مع الرعاية حتى لا أعرض الضغط المفرط في الجهاز WB.
في المستقبل، لدينا جهاز يمكن استخدامه لقياس اضطرابات في وظيفة العدلات في حرق أو المرضى المصابين بصدمات دون إزالة العدلة من مصل الأم المريض، والتي من المرجح ان يلعب دورا رئيسيا في اختلال وظيفي العدلة 17. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا الجهاز في المستقبل لفحص العلاجات المحتملة المؤيدة للقرار لاستعادة وظيفة العدلات طبيعي في هؤلاء المرضى. أخيرا، وهذا الجهاز يمكن زيادة هندسيا لقياس الكيميائي من الخلايا المهاجرة الأخرى مثل وحيدات، الضامة، والخلايا التائية.
في الختام، قمنا بتطوير نوفيطريقة لقياس لتر العدلات الكيميائي مباشرة من قطرات من الدم الكامل. إدماج كامل الجهاز ميكروفلويديك الدم في لوحة 12 أو 24 أيضا يسهل فحص شروط متعددة في وقت واحد. وهذا الجهاز تسهيل تطوير وسطاء من القرار لعلاج التهاب الحروق وحالات الالتهابات الأخرى. في المستقبل، سوف تستخدم هذا الجهاز لقياس اضطرابات في وظيفة الكيميائي العدلة مع مرور الوقت في عينات من المرضى ونماذج الفئران حيث حجم العينة محدودة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا توجد تضارب المصالح في الكشف عنها.
Acknowledgments
بدعم من المعاهد الوطنية للصحة (GM092804 يمنح، DE019938) ومستشفى شرينرس بيرنز.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Device Fabrication | |||
| SU-8 | Microchem | Y131273 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 1.1 lb. Kit | |
| Standard glass slides | Fisher Scientific | 125495 | 1 X 3 inches |
| Glass-bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0 mm | Ted Pella, Inc. | 15081 | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Microfluidic Assay Preparation and Analysis | |||
| Gel-loading pipet tip | Fisher Scientific | 02-707-139 | |
| Syringe | Fisher Scientfic | 309602 | |
| Blunt tip needle, 30 G ½ in. | Brico Medical Supply | BN3005 | |
| Vacutainer, Heparin | Becton Dickinson | ||
| HBSS | Sigma-Aldrich | ||
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A5843-5G | 0.2% final concentration in HBSS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895-1MG | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| SurgiLance safety lancet, 2.2-mm depth, 22 G | SLN240 | ||
| Hoescht stain | Life Technologies | H3570 | |
| Positive Control | |||
| HetaSep | STEMCELL Technologies Inc. | 7906 | |
| EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies Inc. | 19257 | |
| Plasma Asher | March Instruments | P-250 | |
| Lindberg/Blue M Oven | Thermo Scientific | 13-258-30C | |
| Stainless Steel Precision Tweezers | Techni Tool | 758TW458 | |
| Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Dataplate Digital Hot Plate | Alpha Multiservices | PMC 720 | |
| Nikon TiE inverted microscope | Nikon - Micro Video Instruments Inc. | MEA53100 | |
| CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd Objective | Nikon - Micro Video Instruments Inc. | MRH20101 | |
| Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon | Nikon - Micro Video Instruments Inc. | 500-L200NI2 | |
| DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32-mm Exciters - 25-mm Emitters | Chroma - Micro Video Instruments Inc. | 31013v2 | |
| Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1,600 x 1,200 pixels | Qimaging - Micro Video Instruments Inc. | RET-2000R-F-M-12-C | |
References
- Hansson, G. K., Robertson, A. K., Soderberg-Naucler, C.
- Phillipson, M., Kubes, P.
- Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS one. 5, (2010).
- Lavrentieva, A., et al. Inflammatory markers in patients with severe burn injury. What is the best indicator of sepsis. Burns : journal of the International Society for Burn Injuries. 33, 189-194 (2007).
- De Filippo, K., et al. Mast cell and macrophage chemokines CXCL1/CXCL2 control the early stage of neutrophil recruitment during tissue inflammation. Blood. 121, 4930-4937 (2013).
- Mankovich, A. R., Lee, C. Y., Heinrich, V. Differential effects of serum heat treatment on chemotaxis and phagocytosis by human neutrophils. PloS one. 8, (2013).
- Palabrica, T., et al. Leukocyte accumulation promoting fibrin deposition is mediated in vivo by P-selectin on adherent platelets. Nature. 359, 848-851 (1992).
- Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120, (2012).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic chambers for monitoring leukocyte trafficking and humanized nano-proresolving medicines interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20560-20565 (2012).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 412, 15-20 (2007).
- Lyons, P. A., et al. Microarray analysis of human leucocyte subsets: the advantages of positive selection and rapid purification. BMC genomics. 8, (2007).
- Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PloS one. 6, (2011).
- Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab on a chip. 8, 2054-2061 (2008).
- Hoang, A. N., et al. Measuring neutrophil speed and directionality during chemotaxis, directly from a droplet of whole blood. Technology. 0, 1-9 (2013).
- Kurihara, T., et al. Resolvin D2 restores neutrophil directionality and improves survival after burns. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. , (2013).
- Buffone, V., Meakins, J. L., Christou, N. V. Neutrophil function in surgical patients. Relationship to adequate bacterial defenses. Arch Surg. 119, 39-43 (1984).
- Malawista, S. E., de Boisfleury Chevance, A., van Damme, J., Serhan, C. N. Tonic inhibition of chemotaxis in human plasma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 17949-17954 (2008).
