本方案描述了一种新型的机械切碎方法，该方法可在无需解离为单细胞悬液的情况下实现球形神经干细胞及祖细胞聚集体的扩增。 维持细胞间的接触可实现超过40代的快速且稳定的生长。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
勘误通知
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
摘要
摘要
一种能够从单个样本中大量扩增细胞以用于科研实验和临床试验的细胞扩增技术，将极大地造福干细胞研究领域。目前许多扩增方法繁琐且成本高昂，而涉及完全解离的方法可能导致多种干细胞和前体细胞发生分化或过早衰老。为克服这些问题，我们开发了一种自动化机械传代方法，称为“切碎法”（chopping），该方法操作简单且成本低廉。该技术避免使用化学或酶解方法将组织解离为单个细胞，而是支持在保持细胞间持续接触的前提下，实现悬浮球状培养物的大规模扩增。该切碎法最初主要用于胎儿脑源性神经前体细胞或神经球，最近已发表用于胚胎干细胞和诱导性多能干细胞来源的神经干细胞。该操作过程包括将神经球接种于组织培养培养皿中，随后用锋利且无菌的刀片穿过细胞团，从而实现对每个神经球的手动机械解离过程的自动化。细胞在悬浮培养中具有有利的表面积与体积比；例如，直径小于0.5 mm的单个神经球内可培养超过50万个细胞。在一只T175培养瓶中，悬浮培养可生长超过5000万细胞，而贴壁培养仅能生长约1500万细胞。尤为重要的是，该切碎法已在现行药品生产质量管理规范（cGMP）条件下应用，可用于生产临床级细胞产品的大量制备。
引言
长期以来，啮齿类动物的神经干细胞在体外培养中被扩增为单层细胞1-3或聚集体形式的神经球4-7。此外，从发育中的中枢神经系统不同区域分离得到的人类神经前体细胞（hNPCs）8-17也已在体外成功扩增。in vitro。这些细胞具有双潜能性，能够分化为星形胶质细胞和神经元，在研究神经发育18,19及疾病机制20,21方面发挥了重要作用。hNPCs还被移植到多种中枢神经系统疾病的动物模型中，在不同模型中表现出程度不一的整合能力、存活率及功能效应22-24。
传统上，啮齿类或人源胎儿神经前体细胞（NPCs）需暴露于生长因子——通常是表皮生长因子（EGF）和/或成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）25-28——并且贴壁29以及三维球状体系统通常通过酶消化法解离为单细胞悬液进行传代30-34。由于操作简便，用于科研或临床用途的细胞扩增标准方法是采用贴壁单层培养。然而，我们已证明，使用酶或化学溶液对单层培养及神经球形式的人神经前体细胞（hNPCs）进行传代会导致早期衰老35。此外，根据胚胎干细胞的研究数据，酶消化法可能导致分化水平升高以及核型异常36-38。尽管标准的hNPCs传代方法已生产出符合现行药品生产质量管理规范（cGMP）要....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 伦理声明与安全
- 本实验操作涉及使用来源于人类或动物的细胞培养产品。所有来源组织在使用前必须获得相应的机构审查委员会和/或机构动物护理与使用委员会的批准。
- 所有生物危害性废弃物必须根据各机构制定的安全规定进行处置。在本实验全过程之中，须了解并严格遵守所有相关的安全操作与废弃物处理指南。
2. 仪器、耗材、试剂的准备及观察
- 准备
- 准备一个玻璃培养皿、直径为8.5 cm的滤纸圆片和双刃切片刀。
- 将一张滤纸放入培养皿中，并将多个未包被的刀片转移至培养皿内的滤纸上。
- 重复叠加滤纸和刀片，直至培养皿约填充至75%，盖上培养皿盖后进行高压灭菌。储存于无菌或密闭环境中以保持无菌状态。
- 将18 cm的镊子和一个可高压灭菌的螺母扳手放入灭菌袋中进行高压灭菌。若用于cGMP生产，还需将多个不锈钢垫片圆盘放入灭菌袋中进行高压灭菌。有关垫片圆盘的更多信息，请参见步骤3.5。
- 使用70%异丙醇（IPA）对生物安全柜（BSC）进行消毒。
- 所有操作必须在生物安全柜（BSC）中进行，以维持无菌环境。将以下物品无菌转移至BSC中：
- McIlwain组织切碎机（切碎机）。使用70% IPA擦拭所有表面，尤其是切碎机臂（图1B）。如有必....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
图5. 代表性数据。A) 在p19代冻存的人神经前体细胞（hNPCs），解冻后通过酶消化法以贴壁单层方式扩增，其细胞数量变化与通过切碎法传代的神经球进行比较。第0天表示在p20代解冻细胞的时间点。B) 切碎前神经球的代表性图像，10倍放大。C) 切碎后神经球的代表性图像，10倍放大。D) 在可比cGMP条件下用于描述培养基条件化程度的颜色样卡。E) 解冻后p29代hNPCs接种培养1天后的免疫.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
图6. 切割示意图。通过机械切割法在培养中扩增球形干细胞/前体细胞。
关键步骤
图6展示了切碎扩增方法的概览。图6中的人神经前体细胞（hNPC）球体大小是传代神经球前需要观察的重要标准之一。尽管球体大小存在较大差异，但至少应有30%的球体直径大于300 µm。如果球体过小而不适合传代，只需将培养基（CM）更换为新鲜的维持培养基（MM），更换比例为25%-50%，并在1-4天后重新评估。若在球体直径过小时进行传代，会导.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Soshana Svendsen 博士对本报告的审阅与编辑。 本工作由美国国立卫生研究院/国家神经疾病与卒中研究所（NIH/NINDS）1U24NS078370-01 项目和加州再生医学研究所（CIRM）DR2A-05320 项目资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 50 ml 烧杯 | Fisherbrand | FB-100-50 | 多个制造商/供应商 |
| II 级生物安全柜 | Baker | SG-603A | 4 英尺或 6 英尺型号。 推荐使用 6 英尺型号；多个制造商/供应商 |
| 双刃切片刀，用于样本制备 | Personna | 74-0002 | 多个制造商/供应商。 警告：锋利 |
| 无细胞冻存培养基 | Sigma-Aldrich | C6295-50ML | 含 DMSO，无血清 |
| 离心机，带 15 ml 摇摆桶转子 | Eppendorf | 5810 R | 多个制造商/供应商 |
| 15 ml 锥形离心管 | Fisherbrand | S50712 | 多个制造商/供应商 |
| 50 ml 锥形离心管 | BD Falcon | 352074 | 多个制造商/供应商 |
| 程序降温仪 | Planer | Kryo 750 | 多个制造商/供应商 |
| 2 ml 冻存管 | Corning | 430488 | 多个制造商/供应商 |
| 通气培养瓶，T12.5 | BD Falcon | 353107 | 多个制造商/供应商 |
| 通气培养瓶，T25 | BD Falcon | 353081 | 多个制造商/供应商 |
| 通气培养瓶，T175 | BD Falcon | 353045 | 多个制造商/供应商 |
| 通气培养瓶，T75 | BD Falcon | 353110 | 多个制造商/供应商 |
| 滤器，0.22 µm，带接液杯，1 L | Millipore | SCGPU11RE | 多个制造商/供应商 |
| 滤器，0.22 µm，带接液杯，150 ml | Millipore | SCGVU01RE | 多个制造商/供应商 |
| 滤器，0.22 µm，带接液杯，500 ml | Millipore | SCGPU05RE | 多个制造商/供应商 |
| 滤器，0.22 µm，带接液杯，50 ml | Millipore | SCGP00525 | 多个制造商/供应商 |
| 滤纸，直径 8.5 cm 圆形 | Whatman/GE | 1001-085 | |
| 标准齿纹弯头镊子，18 cm | Fine Science Tools | 11001-18 | |
| 异丙醇冷冻室 | Nalgene | 5100-0001 | "Mr. Frosty" |
| 培养箱，37 °C/5% CO2 | Forma | 370 系列 | 多个制造商/供应商 |
| 血细胞计数板（相差型） | Hausser Scientific | 1475 | 多个制造商/供应商 |
| McIlwain 组织切片机 | Lafayette Instruments | TC752-PD | 需配备培养皿改装装置。 警告： 含运动部件及锋利刀片。 |
| 移液器，1–10 μl | Gilson | F144562 | 多个制造商/供应商 |
| 移液器，100–1,000 μl（起始套装） | Gilson | F167700 | 多个制造商/供应商 |
| 移液器，2–20 μl（起始套装） | Gilson | F167700 | 多个制造商/供应商 |
| 移液器，20–200 μl（起始套装） | Gilson | F167700 | 多个制造商/供应商 |
| 六角扳手，可高压灭菌，5/16" | Steritool | 10302 | |
| 巴斯德移液管，带棉塞 | Fisherbrand | 13-678-8B | 多个制造商/供应商 |
| 玻璃培养皿，可高压灭菌 | Corning | 3160-100 | |
| 手动移液器（Pipet Aid） | Drummond | 4-000-101 | 多个制造商/供应商 |
| 垫片 | McMaster-Carr | VARIABLE | 多个制造商/供应商 |
| 带滤芯移液器吸头，10 μl，无菌 | AvantGuard | AV10R-H | 多个制造商/供应商 |
| 带滤芯移液器吸头，1,000 μl，无菌 | AvantGuard | AV1000 | 多个制造商/供应商 |
| 带滤芯移液器吸头，20 μl，无菌 | AvantGuard | AV20-H | 多个制造商/供应商 |
| 带滤芯移液器吸头，200 μl，无菌 | AvantGuard | AV200-H | 多个制造商/供应商 |
| 一次性无菌移液管，全塑料包装，10 ml | Fisherbrand | 13-676-10J | 多个制造商/供应商 |
| 一次性无菌移液管，全塑料包装，2 ml | Fisherbrand | 13-675-3C | 多个制造商/供应商 |
| 一次性无菌移液管，全塑料包装，25 ml | Fisherbrand | 13-676-10K | 多个制造商/供应商 |
| 一次性无菌移液管，全塑料包装，5 ml | Fisherbrand | 13-676-10H | 多个制造商/供应商 |
| 灭菌袋，19 × 33 cm | Crosstex | SCL | 多个制造商/供应商 |
| 细胞筛，40 µm | BD Falcon | 352340 | |
| 组织培养皿，60 mm | BD Falcon | 351007 | |
| 可互锁式四向试管架 | Fisherbrand | 03-448-17 | |
| 水浴锅 | Fisherbrand | S52602Q | 多个制造商/供应商 |
| 神经前体细胞特异性处理试剂 | |||
| 神经干细胞扩增培养基（Stemline） | Sigma-Aldrich | S3194-500ML | 必须使用 Stemline 品牌 |
| 重组人表皮生长因子（EGF） | Millipore | GF316 | 多个制造商/供应商 |
| 重组人白血病抑制因子（LIF） | Millipore | LIF1010 | 多个制造商/供应商 |
| 台盼蓝（0.4%） | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | 多个制造商/供应商 |
| TrypLE Select（1×） | Life Technologies | 12563-011 |
参考文献
- Cattaneo, E., McKay, R. Proliferation and differentiation of neuronal stem cells regulated by nerve growth factor. Nature. 347, 762-765 (1990).
- Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cel....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue
Posted by JoVE Editors on 9/01/2014. Citeable Link.
A correction was made to A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. The corresponding author was changed from:
Brandon C. Shelley
to:
Clive Svendsen
