Abstract
Duftmoleküle binden an die Zielrezeptoren in einer präzisen und koordiniert. Jeder Rezeptor erkennt ein spezifisches Signal und leitet diese Informationen an das Gehirn. Als solche Bestimmung, wie Geruchsinformation an das Gehirn übertragen, Modifizieren sowohl der Wahrnehmung und des Verhaltens, Vorzüge Untersuchung. Interessanterweise gibt es Anzeichen dafür, dass Zellübertragung und Transkriptionsfaktoren sind in der Diversifizierung der Geruchsrezeptor Neuron beteiligt. Hier bieten wir eine robuste ganze montieren immunologischen Markierungsverfahren, in vivo Geruchsrezeptor Neuron Organisation zu untersuchen. Mit dieser Methode haben wir alle olfaktorischen Rezeptorneuronen identifiziert mit Anti-ELAV Antikörper, einer bekannten pan-neuronalen Marker und Or49a-mCD8 :: GFP, einem Geruchsrezeptor Neuron speziell in NBA Neuron mit Anti-GFP-Antikörper exprimiert.
Introduction
Das olfaktorische System wird verwendet, um zwischen einer ungeheuren Vielfalt von Geruchsmolekülen zu unterscheiden und anschließend die sich ergebende Information zu den höheren Zentren des Gehirns zu senden. Dieser Eingang wird verwendet, um präzise zu steuern fundamentale Tierverhalten, wie Fütterung und Gegen 1-6. Da jedes Neuron Geruchstyp wird mit einem bestimmten Satz von Gerüchen, die Diversifizierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen verbunden (ORN) s ist für die richtige Funktion olfaktorische System 7.
Drosophila-Genetik können wir Einzelzellebene Untersuchung, die molekularen Mechanismen, mit ORN Entwicklung und physiologische Funktion 8-16 zugeordnet sind. Whole Mount-Immunfärbung von Drosophila Antennen hat uns ermöglicht, im Detail zu verstehen, die molekularen Mechanismen bei der Diversifizierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen beteiligt (ORN) s 7. Wir bieten hier eine umfassende Beschreibung einer einfachen Methode, um achieve diese.
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Protocol
1. Bereiten Apfel Platte
- Mischen 12,5 g Agar, 125 ml 100% im Handel erhältlichen Apfelsaft, 12,5 g Glucose und 375 ml H 2 O. Mikrowellen die Mischung für 1 bis 2 Minuten und gießt auf 3 cm Zellkulturschale. Lagern bei 4 ° C
2. Genetische Quer
- Verwenden Sie die folgenden repräsentativen genetischen Kreuz:
Or49a-mCD8 :: GFP / Cyo x w 1118
3. Dissection und Färbungsprotokoll
- Anesthetize die Fliege und dann schneiden Sie die Fliege Kopf vertikal, indem Sie sie mit einer Pinzette.
- Legen Sie das Antennen enthaltende Teil auf einer Apfelscheibe.
- Schneiden Sie das dritte Segment der Antenne mit feinen Sezierung Schere.
- Platzieren 90 ul der Fixierungslösung (4% Paraformaldehyd in 0,1% PBST (PBS mit 0,1% Triton X-100)) zu der Mitte einer Glasboden-Kulturschale.
- Vorsichtig überweisen Sie den seziert antennae mit einer spitzen Nadel direkt an den Fixierungslösung. Wenn nötig, physisch tauchen die Antennen in die Lösung mit Nadel.
- Inkubation für 40 Minuten bei Raumtemperatur (RT). Waschen Sie die Antennen in 0,4% PBST (PBS mit 0,4% Triton X-100), 3 x 10 min in jeweils, halten sie in der gleichen Schale. Verwenden gelbe Spitzen zu entfernen und PBST-Lösung hinzufügen. Verwenden 90 ul der Waschlösung jedes Mal.
HINWEIS: die Schale legen Sie nicht in einen Shaker während Immunhistochemie. Vor dem Entfernen oder Hinzufügen der Lösung in der Schale, bringen all die Antennen in die Mitte der Schale mit der Nadel und vorsichtig oder entfernen Sie die Lösung vom Rand der Schale. - Sperrung der Antennen mit 90 &mgr; l von 5% normalem Pferdeserum in 0,1% PBST 20 min bei RT.
- Nach dem Entfernen der Blockierungslösung, Inkubation der Antennen mit 90 &mgr; l primärer Antikörper in 0,1% PBST, enthaltend 5% Pferdeserum für 48 Stunden bei 4 ° C in einem befeuchteten Behälter wie zuvor beschrieben
- 6x 10 Minuten in 0,4% PBST waschen die Antennen.
- Inkubieren der Antennen mit 90 ul sekundären Antikörper in 0,1% PBST, enthaltend 5% Pferdeserum für 48 Stunden bei 4 ° C. Mit 0,4% PBST waschen 6x 10 Minuten.
- Um die Antenne zu befestigen, zu entfernen PBST von der Kulturschale so weit wie möglich nach und nach zwei verschiedenen Konzentrationen von Glycerin zu den Antennen einzuführen. Zuerst werden 40% Glycerin in die Schale für 1 bis 2 Minuten; dann entfernen Sie diese, und fügen Sie 80% Glycerin.
- Die Antennen (inkl. 80% Glycerin) vorsichtig Auszug aus der Kulturschale mit gelber Spitze und legen Sie sie auf eine Folie. Sanft statt ein Deckglas auf und Deckglasränder mit Nagellack. Die Antennen sind nun bereit, durch Fluoreszenzmikroskopie abgebildet werden.
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Representative Results
Sicherzustellen, dass sowohl die Präparation und die Fixierung rasch durchgeführt wird, ein wichtiger Faktor für den Erfolg mit diesem Protokoll. Mit feinen Schere und Pinzette ist auch entscheidend. Nach Immunfärbung wurden fluoreszenzmarkierte Antennen unter einem konfokalen Mikroskop untersucht. Wir nehmen normalerweise 1 um Abschnitte mit einem 20-fach-Objektiv. Wir markierten NBA 7 ORNs mit Or49a-mCD8 :: GFP und zählte die Anzahl der NBA ORNs in Wildtyp-Antenne. Die mCD8-GFP Reporters Zellmembran lokalisiert und so die Expression in Fig. 2 weist die Zellmembran OR49a ORNs GFP gesehen. In Abbildung 2 zeigt NBA ORNs Ausdruck mit anti-GFP-Antikörper und anti ELAV wurde als pan-neuronalen Marker verwendet. Die durchschnittliche Zahl der NBA ORNs pro Antenne ist 20 (n = 8).
Abbildung 1: Überblick über die DISSECTIOn Verfahren.
Abbildung 2: Projektion der konfokalen Z-Serie eines erfolgreich seziert Antenne. Um Nervenzellen erkennen Anti ELAV Antikörper wurde als pan-neuronalen Marker (A) und Anti-GFP-Antikörper verwendet, um spezifische Geruchsrezeptor-Expression (B) und fusionierte Bild zu erkennen, wie in (C) gezeigt.
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Discussion
Die Präparation des Drosophila Antennen wir beschreiben, ist einfach und leicht in einer Laborumgebung durchzuführen. Um eine erfolgreiche Präparation zu gewährleisten, ist es unerlässlich, feinkantigen Schere zu nutzen. Während der Immunfärbung seziert Antenne, ist es wichtig, sie in einer feuchtigkeitsgefüllten Behälter, um Verdunstung der Antikörperlösung zu vermeiden inkubieren. Die sezierten Antenne hat eine Tendenz, in der Lösung schweben. Verwendung von 0,1% Triton in PBS während der Fixierung und Blockierung Schritte Eintauchen der Antenne in der Lösung zu erleichtern und eine bessere Färbung zu gewährleisten. Mit "Glasbodenkulturschale" könnte den Verlust von Antennen während der Immunfärbung zu reduzieren und sicherzustellen, dass die kleinen Mengen (90 ul) Antikörperlösung in jedem Experiment verwendet.
Neuronale-Klasse Diversifikation ist ein zentrales Merkmal der Neurogenese. Diese physiologische Vorgang wird im olfaktorischen System, das eine große Palette von Geruchsrezeptor Neuron verwendet (ORN) BeispielKlassen. Erzeugung einer Vielzahl von ORNs mit Geruchsrezeptorexpression und axonalen Targeting ist entscheidend für die Erzeugung der neuronalen Diversität für die Übertragung von Informationen von Geruchsmolekülen zu höheren Gehirnzentren notwendig. Unsere ganze Berg Antenne Immunfärbung Protokoll hilft bei der Förderung unseres Verständnisses der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen ORN Diversifikation.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von MEXT-unterstützte Programm für die strategische Forschungs Stiftung an Privatuniversitäten und JSPS Young Scientist B Zuschuss für HT Wir möchten Ohtake Norihito danken, die Videoclips zu bearbeiten unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi DV4 dissection microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Glass bottom culture dishes | MatTek corporation | P35G-0-10-C | |
| Dissection scissor | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Rat anti-ELAV | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7E8A10 | Dilution 1:200 |
| Mouse anti-GFP | Invitrogen | A11122 | Dilution 1:400 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-225-152 | Dilution 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-165-150 | Dilution 1:200 |
References
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