Abstract
Odorant molekülleri hassas ve koordineli bir şekilde hedef reseptörlerine bağlanır. Her bir reseptör belirli bir sinyal algılar ve beyne bu bilgileri aktarır. Gibi, koku bilgi algı ve davranışlarını, yararları soruşturma hem değiştirerek, beyne transfer edilir nasıl belirlenmesi. İlginçtir, hücresel iletimi ve transkripsiyon faktörleri koku reseptör nöron çeşitlendirilmesi dahil olduğunu yeni kanıtlar vardır. Burada bir bütün in vivo güçlü bir koku reseptör nöron organizasyon tahlil için immünolojik etiketleme yöntemi montaj kısmı temin etmektedirler. Bu yöntemi kullanarak, anti-ELAV antikoru, bilinen pan-sinir işaret ve Or49a-mCD8 :: GFP, özellikle anti-GFP antikoru kullanılarak NBA nöron içinde ifade edilen bir koku alıcı nöron Tüm olfaktori reseptör nöronlar tespit edilmiştir.
Introduction
Koku sistemi koku molekülleri çok büyük bir çeşitlilik ayırt etmek ve daha sonra, yüksek beyin merkezlerine elde edilen bilgi göndermek için kullanılır. Bu giriş, kesinlikle böyle beslenme ve çiftleşme 1-6 gibi temel hayvan davranışlarını kontrol etmek için kullanılır. Her koku nöron tipi kokuların bir dizi özel, koku reseptör nöronların çeşitlendirilmesi ile ilişkili olarak (ORN) ler doğru koku alma sistemi fonksiyonu 7 için gereklidir.
Drosophila genetiği ORN gelişimi ve fizyolojik fonksiyonu 8-16 ile ilişkili moleküler mekanizmaları içeren tek hücre düzeyinde soruşturma yapmak için bize sağlar. Drosophila antenlerin Tüm montaj immünoboyamasıdır daha detaylı koku reseptör nöronların çeşitlendirilmesi dahil moleküler mekanizmaları (ORN) s 7 anlamak sağladı. Bu yazıda ac için basit bir yöntem kapsamlı bir açıklama sağlamakBu hieve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Elma tabak hazırlayın
- 12.5 g agar karıştırılır, 125 ml% 100 ticari olarak temin edilebilen elma suyu, 12.5 g glukoz ve 375 ml 2 H O. 1-2 dakika için karışımın mikrodalga ve 3 cm hücre kültürü tabağına dökülür. 4 ° C'de saklayın
2.. Genetik çapraz
- Aşağıdaki temsilcisi genetik haç kullanın:
Or49a-mCD8 :: GFP / cyo x 1118 w
3.. Diseksiyon ve boyama protokolü
- Sinek uyutmak ve daha sonra bir forseps kullanarak tutarak dikey sinek kafasını kesti.
- Dikkatli bir elma plaka üzerinde antenleri içeren kısmını yerleştirin.
- Ince diseksiyon makas kullanılarak antenin üçüncü bölümü kesmek.
- Bir cam alt kültür çanağı ortasına ()% 0.1 Triton X-100 ile% 0.1 PBST (PBS içinde% 4 paraformaldehid) sabitleme çözeltisi 90 ul koyun.
- Yavaşça disseke ANTENN transferidoğrudan sabitleme çözüm için keskin bir iğne ile ae. Gerekirse, fiziksel olarak bir iğne kullanılarak çözelti içine anten daldırın.
- Oda sıcaklığında (RT) 40 dakika süreyle inkübe edin. Aynı çanak tutarak, (% 0.4 Triton X-100 ile PBS)% 0.4 PBST içinde her 3x 10 dakika anten yıkayın. PBST çözüm kaldırmak ve eklemek için sarı ipuçlarını kullanın. Her süresi, yıkama çözeltisi 90 ul kullanın.
NOT: immünohistokimyada sırasında karıştırıcı içine çanak koymayın. Çanak içine alınarak, veya eklemeden önce, iğne kullanılarak çanağın merkezine tüm antenler getirmek ve dikkatli bir yemeğin kenarından çözeltisi eklemek veya çıkarmak. - Oda sıcaklığında 20 dakika süreyle% 0.1 'lik PBST içinde% 5 normal at serumu ve 90 ul anten bloke eder.
- Bloklama çözeltisi uzaklaştırıldıktan sonra, daha önce tarif edildiği gibi bir kap içinde nemli 4 ° C'de 48 saat boyunca% 5 at serumu ihtiva eden% 0.1 'lik PBST içinde birincil antikor 90μl ile antenler inkübe
- % 0.4 PBST içinde 10 dakika 6x anten yıkayın.
- 4 ° C'de 48 saat boyunca% 5 at serumu ihtiva eden% 0.1 'lik PBST içinde sekonder antikor 90 ul ile inkübe antenler % 0.4 PBST kullanarak 6x 10 dakika yıkayın.
- , Antenler monte mümkün olduğunca kültürü çanak PBST kaldırmak ve yavaş yavaş antenine gliserol iki farklı konsantrasyonları tanıtmak. İlk olarak 1-2 dakika için çanak% 40 gliserol ekleyin; sonra bu kaldırmak ve% 80 gliserol ekleyin.
- Dikkatle sarı ucunu kullanarak kültürü çanak (% 80 gliserol dahil) antenleri ayıklamak ve bir slayt üzerine koyun. Yavaşça üstüne lamel yerleştirin ve tırnak cilası ile lamel kenarları mühür. Antenler artık floresan mikroskop ile görüntülü hazırız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Diseksiyon ve sabitleme hem de hızlı yapılabilmesinin sağlanması, bu protokol ile başarıya ulaşmada önemli bir faktördür. Ince makas ve forseps kullanılması da önemlidir. İmmunosteyn sonra, floresan etiketli antenleri konfokal mikroskop altında incelendi. Biz normalde 20x lens kullanarak 1 Pm'lik bölümleri alır. Biz NBA Or49a-mCD8 :: GFP kullanarak 7 Örns etiketli ve vahşi-tip anten Nba Örns sayısını sayılır. Bunun ardından mCD8-GFP raportör hücre zarı lokalize ve böylece ekspresyon, Şekil GFP ifade OR49a Örns 2 sergiler hücre zarı görülür. Şekil 2, anti-GFP antikoru ve anti ELAV bir pan-sinir markör olarak kullanılmıştır kullanılarak NBA Örns ifade gösterir. Anten başına Nba Örns ortalama sayısı 20 (n = 8).
Şekil 1: dissectio genel bakışn prosedür.
Şekil 2: Bir başarıyla disseke anten konfokal Z-serisi Projeksiyonu. Nöronlar tespit etmek için bir anti-ELAV antikoru (C) 'de gösterildiği gibi, özel bir reseptörü ifade odorant (B) ve birleştirilmiş görüntü tespit etmek için bir pan-sinir işaretleyici (A) ve anti-GFP antikor olarak kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz tarif Drosophila anten diseksiyonu basit ve bir laboratuvar ortamında gerçekleştirmek kolaydır. Başarılı bir diseksiyon sağlamak için, bu ince kenarlı makas kullanmak için gereklidir. Parçalara anten immün da, bu antikor çözeltisi buharlaşmasını önlemek için bir nem dolu kap içinde inkübe etmek önemlidir. Kesilmiş anten çözeltide yüzer bir eğilimi vardır. Tespit sırasında PBS içinde% 0.1 Triton kullanılarak ve adım bloke çözeltisi içinde antenin suya batmaya kolaylaştıracak ve daha iyi boyama sağlamak. "Cam alt kültür çanağı" kullanılarak immün sırasında anten kaybını azaltmak ve her deneyde kullanılan antikor çözeltisinin küçük miktarlarda (90 ul) sağlamak olabilir.
Nöronal sınıf çeşitlendirme nöron merkezi bir özelliğidir. Bu fizyolojik bir süreç koku reseptör nöron geniş bir dizi kullanır koku alma sistemi, (ORN) örneklenmiştirsınıflar. Odorant reseptör ekspresyonu ve aksonal hedefleme ile Örns geniş bir yelpazede oluşturulması, yüksek beyin merkezlerine koku molekülleri bilgi iletmek için gerekli olan nöronal çeşitlilik oluşturmak için çok önemlidir. Moleküler mekanizmalar yatan ORN çeşitlendirme anlayışımızı sürdürmek bizim bütün montaj anten İmmünbüyanmanın protokol yardımcıları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Özel Üniversitelerde Stratejik Araştırmalar Vakfı ve Biz video klipleri düzenlemek için Ohtake Norihito teşekkür etmek istiyorum HT JSPS Genç Bilimci B hibe MEXT Destekli Programı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi DV4 dissection microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Glass bottom culture dishes | MatTek corporation | P35G-0-10-C | |
| Dissection scissor | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Rat anti-ELAV | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7E8A10 | Dilution 1:200 |
| Mouse anti-GFP | Invitrogen | A11122 | Dilution 1:400 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-225-152 | Dilution 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-165-150 | Dilution 1:200 |
References
- Christensen, T. A., White, J. Representation of olfactory information in the brain In The Neurobiology of Taste and Smell. , New York. 201-232 (2000).
- Ache, B. W. Towards a common strategy for transducing olfactory information. Sem. Cell Biol. 5, 55-63 (1994).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction. C. elegans. Cell. 13, 515-527 (1993).
- Barth, A. L., Justice, N. J., Ngai, J. Asynchronous onset of odorant receptor expression in the developing zebrafish olfactory system. Neuron. 16, 23-34 (1996).
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413, 211-218 (2001).
- Stockinger, P., et al. Neural circuitry that governs Drosophila male courtship behavior. Cell. 121, 795-807 (2005).
- Endo, K., et al. Chromatin modification of Notch targets in olfactory receptor neuron diversification. Nat Neurosci. 15, 224-233 (2011).
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. , (2011).
- Suh, G. S., et al. A single population of olfactory sensory neurons mediates an innate avoidance behaviour in Drosophila. Nature. 431, 854-859 (2004).
- Sachse, S., Galizia, C. G. Role of inhibition for temporal and spatial odor representation in olfactory output neurons: A calcium imaging study. J Neurophysiol. 87, 1106-1117 (2002).
- Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117, 965-979 (2004).
- Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. An olfactory sensory map in the fly brain. Cell. 102, 147-159 (2000).
- Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. J. Molecular, anatomical and functional organization of the Drosophila olfactory system. Curr Biol. 15, 1535-1547 (2005).
- Clyne, P., et al. Odorant response of individual sensilla on the Drosophila antenna. Invert Neurosci. 3, 127-135 (1997).
- Vosshall, L. B., et al. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96, 725-736 (1999).
- Wang, J. W., et al. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112, 271-282 (2003).
